第二章 材料與方法
2.1 猪胸膜肺炎放線桿菌目標抗原基因之選殖
本實驗所採用之目標抗原為不具有毒性之前毒素結構蛋白 ApxIA
與ApxⅡA、外膜脂蛋白 OmlA 及血紅蛋白結合蛋白 HgbA。
2.1.1 猪胸膜肺炎放線桿菌菌株來源
本研究之猪胸膜肺炎放線桿菌菌種來源為行政院農委會家畜衛生 試驗所所提供，菌株為第一生物型之第一血清型。
2.1.2 猪胸膜肺炎放線桿菌菌體培養
本實驗室收到行政院農委會家畜衛生試驗所寄送之菌株是乾燥封 存在玻璃管中，需在無菌操作條件下將菌種取出，進行活化培養。首先
以70％酒精擦拭玻璃管，再以火焰加熱玻璃管尖端，待外管處於高溫狀
態時，滴數滴冰冷的無菌水於加熱處，使玻璃管破裂，之後以無菌鑷子 將玻璃撥開，並取出管內之棉塞，用無菌吸管取1 ml 的無菌水，加入玻
璃管中回溶樣品直到均勻懸浮。再將懸浮之菌液加至含 0.1％菸鹼醯胺
腺嘌呤雙核酸 (β- nicotinamide adenine dinucleotide, Sigma N7004)之 BHI 培養液 (表 1)中，於 37℃進行震盪培養 18 小時。
2.1.3 猪胸膜肺炎放線桿菌基因組 DNA 之萃取
猪胸膜肺炎放線桿菌基因組 DNA 以 Blood and Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System (VIOGENE)萃取。詳細方法如下，將菌 株液態培養至109 cells/ml 之濃度，取 1.5 ml 菌液於 1.5 ml 之離心管中，
以 7,500 rpm 離心 10 分鐘。將離心後沈澱之菌體以 200μl lysozyme reaction solution (表 2)再懸浮，於 37℃作用 3 分鐘。加入 20μl proteinase K 和 200μl EX Buffer 於樣品中，均勻混合，於 60℃作用 30 分鐘。再於 70℃作用 30 分鐘，作用期間將 200μl ddH2O 於 70℃中預熱。加入 210μl isopropanol 於樣品中，均勻混合。將 B/T Genomic DNA Mini Column 置 放於Collection Tube 上，將所有的樣品注入 column 中，以 8,000 rpm 離 心2 分鐘，將 column 置放於新的 Collection Tube 上。以 0.5 ml WS Buffer 於 8,000 rpm 離心 2 分鐘清洗兩次，將離心下來的液體倒掉。再以全速 離心2 分鐘以去除殘留之 ethanol。將 column 置放於 1.5 ml 之離心管上，
將預熱於70℃中的 200μl ddH2O 加入 column 中，將 column 直立靜置 5
分鐘，以全速離心2 分鐘，離心所得之液體即為猪胸膜肺炎放線桿菌基
因組DNA，將其保存於-20℃備用。
2.1.4 DNA 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)
將表 3 之試劑加入 PCR tube 中，反應所需之 forward primer 與 reverse primer (表 4)，試劑混合好後置於聚合酶連鎖反應機器 (ASTEC, PC320, Japan)中之反應凹槽中，先以 94℃反應 3 分鐘後進行 30 個循環 之反應，即 94℃反應 30 秒，復性溫度 (表 4) 反應 30 秒，72℃反應 3 分鐘 (除 OmlA 反應 1 分鐘外)。循環反應完成後，以 72℃反應 10 分鐘 將DNA 片段補齊，反應完成後，將產物保存於-20℃備用。
2.1.5 洋菜膠電泳 (agarose gel electrophoresis)
將適量之洋菜膠粉末加入1X TAE buffer (表 2)中，配置成 0.8％之 洋菜膠，並以微波爐加熱使其完全溶解，待洋菜膠稍涼後倒入水平製膠 器 (MJ-105, MAJOR SCIENCE)中，加上適當的齒狀鑄槽器後，於室溫 待其凝固。將凝固的洋菜膠置於電泳槽中，倒入適量的1X TAE buffer (以 完全蓋過洋菜膠為標準)，將欲分析之 DNA 與 1/5 體積之 6X gel loading buffer 於蠟紙上混合後，利用微量吸管注入洋菜膠的樣品凹槽 (well)中，
以電壓100 伏特分離 DNA 約半小時，再以 ethidium bromide (EtBr) (表 2)染色 10 分鐘，H2O 退染色 1 分鐘，於紫外光下觀察 DNA 分離情況。
2.1.6 目標抗原 DNA 之純化
將目標抗原DNA 片段 (ApxIA 3066 bp，ApxIIA 2868 bp，OmlA 1095 bp，HgbA 2844 bp)由洋菜膠上切下，在 Electro-elutor (東生生技公 司, 台北)之白金環下鋪上適當大小的蠟紙，在白金環中注入 200 μl 的 TAE buffer，將切下的洋菜膠切成適當大小後浸入白金環中的 TAE buffer，再將電極針刺入洋菜膠中，以 15 伏特通電 4 分鐘，移除白金環 中的洋菜膠，吸取白金環中的TAE buffer 至 1.5 ml 離心管中，在 1.5 ml 離心管中加入10 μl 3M sodium acetate (GENEPURE)和 10 μl 核酸沈澱佐 劑 (Nucarrier) (東生生技公司, 台北)，再加入 400 μl 100％酒精，以 12,000 rpm 離心 7 分鐘，去除上清液，待離心管中的沈澱物自然風乾後 將其回溶於40 μl ddH2O 中，樣品保存於-20℃。