第二章 材料與方法
2.4 DNA 疫苗之動物試驗
2.4.1 實驗動物
本研究使用之實驗動物為6 至 8 週齡無特定病原 (specific pathogen free，SPF)之 BALB/cByJ 公小鼠，購自財團法人國家實驗動物中心，實
驗動物送達後至少飼養一週以使其適應環境，每一小鼠籠中飼養4 隻小
鼠，水及飼料採任飼方式餵食，每週固定時間更換墊料以維持潔淨，室 溫空間溫度控制於23-25℃。
2.4.2 疫苗免疫策略
實驗小鼠共 32 隻，分為 8 組，每組 4 隻。實驗組群共分為 5 組，
分別為 ApxIA 組、ApxⅡA 組、OmlA 組、HgbA 組以及含有上述四種 DNA 疫苗混合施打之四合一疫苗組，對照組共分為 3 組，pcDNATM3.1 Directional TOPO vector 空載體組以及 phosphate buffered saline (PBS) (表 2)組作為陰性對照組，市售疫苗組 (百靈佳® 猪放線桿菌胸膜肺炎不活 化菌苗 INGELVAC® H)作為陽性對照組。
實驗組之 ApxIA 組、ApxⅡA 組、OmlA 組、HgbA 組施打劑量為
100μg DNA 疫 苗 輔 以 50μg aurintricarboxylic acid (ATA) (Glasspool-Malone et al., 2000)溶於 100μl PBS 中 (需新鮮配置)，四合一 疫 苗 組 是 以 pcDNAD-ApxIA 、 pcDNAD-ApxⅡA 、 pcDNA-OmlA 、 pcDNAD-HgbA 各 100μg 輔以 50μg ATA 溶於 100μl PBS 中，ATA 為一種 DNA topoisomeraseⅡ抑制劑，可減少 DNA 疫苗於小鼠體內被分解。陽 性對照組施打劑量為100μl 市售疫苗 (INGELVAC® H, 百靈佳)，其含有 不活化之第 1、2、3、4、5、7 血清型猪胸膜肺炎放線桿菌及氫氧化鋁 佐劑。陰性對照組施打100μg 空載體 DNA 輔以 50μg ATA 溶於 100μl PBS 中。PBS 組每次施打 100μl PBS 作為對照。在第 0、14 天分別於小鼠後 腿作肌肉注射。
2.4.3 血清檢體製備
每次施打疫苗前以及第 2 次免疫後 7 天分別由小鼠尾巴採血
100μl，待採集的血液凝固後，以 6,000 rpm 離心 10 分鐘，淡黃色之上清 液即為血清，抽取血清至新的1.5 ml 離心管中，保存於-20℃備用。
2.4.4 酵素連結免疫吸附法 (ELISA)
ApxIA 組、ApxⅡA 組、OmlA 組以及 HgbA 組小鼠血清 ELISA 方 式如下：先用 coating buffer (表 2)將 anti-V5 抗體以 1:5000 稀釋
(Invitrogen)，濃度為 0.4 μg/ml，將 100μl anti-V5 稀釋抗體注入 ELISA 盤 中於4℃隔夜，倒去 well 中之液體，注入 200μl blocking buffer 於 37℃
反應1 小時，倒去 well 中之液體，以 200μl TBST 清洗三次，注入 100μl 能表達目標抗原之 E. coli 的菌體 lysate 上清液於 37℃反應 1 小時，以 200μl TBST 清洗三次，注入 200μl 以 TBST 稀釋 100 倍之小鼠血清檢體 後，以2 倍連續性稀釋於 37℃反應 1 小時，以 TBST 清洗三次，注入 100μl goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate (1:5000 稀釋) (Sigma) 於37℃反應 1 小時，以 200μl TBST 清洗三次，注入 75μl 溶解於 ELISA substrate buffer (表 2)之 p-nitrophenyl phosphate (1 mg/ml)於 37℃反應 30 分鐘後以ELISA 測讀機偵測 OD405之吸光值，以OD405 > 0.32 判定為陽 性反應。
四合一疫苗組、空載體組、市售疫苗組以及 PBS 組小鼠血清 ELISA 方式如下：將 100μl 以 coating buffer 稀釋之猪胸膜肺炎放線桿菌注入 ELISA 盤 (約 103 CFU/well) 於 4℃隔夜，倒去 well 中之液體，注入 200μl blocking buffer 於 37℃反應 1 小時，倒去 well 中之液體，以 200μl TBST 清洗三次，注入100μl 以 TBST 稀釋 100 倍之小鼠血清檢體後以 2 倍連 續性稀釋於37℃反應 1 小時，以 200μl TBST 清洗三次，注入 100μl goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate (1:5000 稀釋) (Sigma)於 37℃反應 1 小時，以 200μl TBST 清洗三次，注入 75μl 溶解於 ELISA
substrate buffer 之 p-nitrophenyl phosphate (1 mg/ml)於 37℃反應 30 分鐘 後以ELISA 測讀機偵測 OD405之吸光值，以OD405 > 0.27 判定為陽性反 應。
2.4.5 攻毒試驗
將猪胸膜肺炎放線桿菌培養以含 0.1％菸鹼醯胺腺嘌呤雙核酸之
BHI 培養液中，於 37℃進行懸浮培養至吸光值 OD600=0.6，估算此時菌 液濃度約為2 × 109 CFU/ml。將菌液以 6000 rpm 離心 20 分鐘，以 PBS 清洗兩次，將菌體沈澱以PBS 稀釋為 5 × 109 CFU/ml，每隻小鼠以 100μl 濃度5 × 109 CFU/ml 之菌液進行點鼻 (intranasal)攻毒，即每隻小鼠之攻 毒劑量為5 × 108 CFU (對小鼠之 10 倍 ID50)(Liao et al., 2003)，點鼻攻毒 之方式先將小鼠置於含有乙醚之密閉容器內，待其昏迷後以1 ml 之針筒 配合26 號針頭吸取 100μl 濃度 5 × 109 CFU/ml 之菌液，慢慢地將菌液點 塗於小鼠之鼻孔處，小鼠由於被乙醚麻醉後缺氧便會急促地吸氣，因此 便會將菌液吸入其肺部，完成點鼻攻毒後 24 小時內每 6 小時紀錄小鼠 之死亡率，24 小時後每 12 小時紀錄小鼠之死亡率，觀察 5 天後評估疫 苗之保護性。