第二章 材料與方法
2.2 猪胸膜肺炎放線桿菌目標抗原基因質體之建構
2.2.1 以 pcDNA
TM3.1 表現質體接合目標抗原 DNA
將15ng 欲接合之目標抗原基因之 PCR 產物、1μl Salt Solution (1.2M NaCl, 0.06 M MgCl2) 、 1μl pcDNATM3.1 Directional TOPO vector (Invitrogen)以無菌水加至 6 μl，均勻混合 (混合後之溶液稱為 TOPO
cloning reaction)，於室溫進行接合作用 30 分鐘後置於冰上備用。
2.2.2 質體轉化 (transformation)
將6 μl 之 TOPO cloning reaction 在冰上緩慢均勻地加入 One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli 中，於冰上靜置 5 分鐘。在 42℃中 作用5 分鐘，然後迅速移至冰上。加入 250 μl SOC medium (需事先回溫 至37℃)後，於 37℃水平搖晃 (200 rpm) 1 小時。將搖晃後之菌液均勻塗 於selective plate (含 50 μg/ml ampicillin 之 LB plate ) (表 1)上，於 37℃培 養16 小時。再將長出之單一菌落以含 50 μg/ml ampicillin 之 LB medium 作液態培養後，抽取其質體DNA 確認。
2.2.3 質體 DNA 的製備
質體DNA 以 High-Speed Plasmid Mini Kit 製備 (Geneaid)。詳細方 法如下，將TOP 10 E. coli 以 LB medium 作液態培養 18 小時後，取 1.5 ml 之菌液於1.5 ml 離心管中，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，除去上清液，加 入200 μl PD1 Buffer 後將沈澱物再懸浮，加入 200 μl PD2 Buffer 後溫和 地來回翻轉 10 次以充分混合藥劑 (勿劇烈震盪以避免擷取到 genomic DNA)，於室溫下作用 2 分鐘，加入 300 μl PD3 Buffer 後溫和地來回翻轉 10 次以充分混合(勿劇烈震盪)，以 13,000 rpm 離心 2 分鐘 (溶液 1)。將
PD Column 置於 2 ml Collection Tube 上，取溶液 1 之上清液入 PD Column 中，以13,000 rpm 離心 30 秒，將離心下來的液體倒掉，加 400 μl W1 Buffer 於PD Column 中，以 13,000 rpm 離心 30 秒，將離心下來的液體倒掉，
加600 μl Wash Buffer (已加入 ethanol)於 PD Column 中，以 13,000 rpm 離心 30 秒，將離心下來的液體倒掉，再以 13,000 rpm 離心 3 分鐘，將 離心下來的液體倒掉，以新的1.5 ml 離心管置換 2 ml Collection Tube 於 PD Column 下，加入 30 μl 之無菌水，將 column 直立，靜置 2 分鐘後以 13,000 rpm 離心 2 分鐘，離心所得之液體即為質體 DNA，將其保存於 -20℃備用。
2.2.4 質體 DNA 正確性之確認
選殖入目標抗原基因之質體DNA 以限制酶切割作初步確認，以 3 μl 之質體DNA、5 μl 之 10 倍濃度限制酶專用 Buffer、0.5 μl 之 100 倍濃度 BSA (bovine serum albumin)及 0.5 μl 限制酶 (若以兩種限制酶作雙重切 割則各加入0.5 μl)溶於總體積 50 μl ddH2O 中，於 37℃作用 1.5 小時後 以洋菜膠電泳分離 DNA 片段，再以 EtBr 染色 10 分鐘，H2O 退染色 1 分鐘，於UV 燈下觀察 DNA 分離情況。
pcDNAD-ApxIA 以 EcoR V 作確認，pcDNAD-ApxⅡA 以 BamH I、
EcoR V 作確認、pcDNAD-OmlA 以 Kpn I 作確認、pcDNAD-HgbA 以 EcoR
V 作確認。
質體 DNA 以限制酶初步確認正確後，送交昕穎生技公司定序，定
序後之序列與National Center for Biotechnology Information (NCBI)之基 因資料庫進行比對。
2.3 猪胸膜肺炎放線桿菌抗原基因質體於活體外 (in vitro)之表 現
2.3.1 猪腎細胞 (LLC-PK1)與大腸桿菌 (TOP10)之培養
2.3.1.1 猪腎細胞 (LLC-PK1) 之培養
猪腎細胞 (LLC-PK1)為購自食品工業發展研究所生物資源保存及 研究中心 (BCRC Number：60080)。猪腎細胞保存於液態氮中，欲培養 時將猪腎細胞於 37℃水浴中快速解凍後，以含有 3％FBS (fetal bovine serum)、0.15% NaHCO3之Medium 199 培養基 (表 1)於 5% CO2細胞培 養箱 (Astec, SCA-165DS, Japan)中進行培養。
2.3.1.2 大腸桿菌 (TOP10)之培養
大腸桿菌TOP10 (Invitrogen)以 LB medium 於 37℃震盪培養。
2.3.2 細胞轉染 (transfection)
轉染時先以16μg 目標抗原質體 DNA 溶於 760μl Medium 199 中，
再加入40μl Plus Reagent (Invitrogen)，於室溫作用 15 分鐘 (溶液 1)。將 40μl Lipofectamine reagent (Invitrogen)加 760μl Medium 199 中，再將其與 溶液 1 混合後於室溫作用 15 分鐘 (溶液 2)。將長滿 50%猪腎細胞 (LLC-PK1)的 T flask 中的 Medium 換成不含 FBS 的 Medium 199，加入 溶液2 後於 5% CO2、37℃作用 3 小時，再加入 FBS，於 5% CO2、37℃
培養48 小時後以 Neomycin (50μg/ml)進行篩選，待轉染成功之細胞長滿 整個T flask 後，收集轉染之細胞進行測試。
2.3.3 硫酸十二酯鈉多醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
2.3.3.1 蛋白質樣本製備
將1.5 ml 之菌液置於 1.5 ml 離心管中，以 12,000 rpm 於 4℃離心 3
分鐘，去除上清液，加入1 ml ddH2O 回溶混勻菌體，以 12,000 rpm 於 4℃
離心3 分鐘，去除上清液，加入 100μl ddH2O 與 100μl 2X SDS gel-loading buffer (表 2)，以沸水加熱 5 分鐘，以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，上清液 即為蛋白質樣本。
2.3.3.2 製作硫酸十二酯鈉多醯胺凝膠
以EC120 mini vertical gel system (Thermo)進行 SDS-PAGE，先配置 10% SDS-PAGE separating gel 溶液 (表 2)，將溶液注入電泳玻璃槽中，
在separating gel 溶液上注滿 ddH2O 以壓平膠面，待凝 30 分鐘，配置 5%
SDS-PAGE stacking gel 溶液 (表 2)，將溶液注入電泳玻璃槽中，插入適 當之尺梳，待凝1 小時，膠體凝固後拔出尺梳，將 SDS-PAGE 置於電泳 槽內，注入樣本處朝內，於兩片 SDS-PAGE 之間注滿 Tris-glycine electrophoresis buffer ( 表 2) ， 電 泳 槽 下 方 亦 需 注 入 Tris-glycine electrophoresis buffer，以超過膠體下方之電線為標準。膠體製備完成後，
將 20μl 樣本注入凹槽內，先以 90 伏特通電約 1 小時，待藍色染劑皆通 過stacking gel 與 separating gel 交界面時，再以 120 伏特進行電泳，依藍 色染劑位置來追蹤樣品電泳情形，依欲觀察樣品之蛋白質大小決定終止 電泳之時間。
2.3.4 西方點墨法 (Western blot)
以EC140 mini blot module (Thermo)進行 Western blot，先將 transfer buffer (表 2)注滿轉漬槽，由轉漬槽底部 (陰極)依序疊上海綿、3M 濾 紙、以電泳分離蛋白質後之SDS-PAGE 膠體、nitrocellulose (NC) paper、
3M 濾紙、海綿、海綿，各層需先以 transfer buffer 浸濕，各層之間不可 有氣泡存在，蓋上轉換槽頂蓋 (陽極)，將轉漬槽豎立，於轉漬槽中注 滿transfer buffer，輕輕拍打轉換槽以趕出殘存之氣泡，接上電源以 20 mA 進行 electrotransfer 1.5 小時，而後將 NC paper 取出，浸泡於 blocking buffer (表 2)中作用 1 小時，以 20 ml TBST (表 2)沖洗 3 次，每次 5 分鐘，
將 NC paper 浸泡於 20 ml 與 alkaline phosphatase 連結的 anti-V5 抗體 (1:5000, Invitrogen)中作用隔夜，以 20 ml TBST 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，
將NC paper 浸泡 10 ml alkaline phosphatase buffer (表 2)中 5 分鐘，加 入1 ml BCIP/NBT liquid substrate system (Sigma)，待 NC paper 上之蛋 白質顯色而背景顏色尚未太深前移除buffer，將 NC paper 浸置於 ddH2O 中。