第三章 結果
3.4 猪胸膜肺炎放線桿菌抗原基因質體於活體外 (in vitro)之表現
3.4.1 猪胸膜肺炎放線桿菌抗原基因質體於大腸桿菌 (TOP10) 之表現
個別以四種 DNA 疫苗轉化後之 E. coli 破菌後之蛋白質，進行 SDS-PAGE 後轉漬至 NC paper，以 anti-V5 抗體偵測目標蛋白後以 BCIP/NBT liquid substrate system 顯色，結果如圖 13。目標蛋白分子量加 上V5 與 His taq 的序列經過估算後，ApxIA 約為 115 kD，ApxⅡA 約為 107.5 kD，OmlA 約為 45 kD，HgbA 約為 110 kD，根據圖 13 的結果顯示，
以DNA 疫苗轉化後之 E. coli 表現出之目標抗原蛋白皆有表現。
3.4.2 猪 胸 膜 肺 炎 放 線 桿 菌 抗 原 基 因 質 體 於 猪 腎 細 胞 (LLC-PK1)之表現
個別以四種 DNA 疫苗轉染猪腎細胞 (LLC-PK1)後以 Neomycin (50μl/ml)進行篩選一週，將篩選後之細胞打破，進行 SDS-PAGE 分析 (圖 14)，然後再轉漬至 NC paper，以 anti-V5 抗體偵測目標蛋白後以 BCIP/NBT liquid substrate system 顯色，Western Blot 結果未能偵測到四種目標抗原 的表現 (圖 15)。
3.5 猪胸膜肺炎放線桿菌 DNA 疫苗所誘發之免疫反應
3.5.1 抗體反應
於免疫前 (第 0 天)、第一次免疫後 (第 13 天)、第二次免疫後 (第 21 天)採集之各組小鼠血清以 ELISA 測定小鼠血清對目標抗原蛋白 (ApxIA 組、ApxⅡA 組、OmlA 組、HgbA 組)或猪胸膜肺炎放線桿菌 (四 合一疫苗組、空載體組、市售疫苗組、PBS 組)之 Ig G 抗體效價，結果見 表6。
ApxIA 組、ApxⅡA 組、OmlA 組、HgbA 組對於各自目標抗原蛋白
之效價於第一次免疫後即有上升的趨勢，其中 ApxⅡA 組更達到了 204,800，第二次免疫後各組之抗體效價再度上升，其中 OmlA 組更達到 了 409600，結果顯示施打本實驗室所研發之四種 DNA 疫苗確實會於小 鼠體內表現出目標抗原蛋白。
空質體組與PBS 組對於猪胸膜肺炎放線桿菌的抗體效價在兩次免疫 後依然無上升的現象，市售疫苗組於第一次免疫後之抗體效價並無顯著 的改變，第二次免疫後抗體效價才明顯地攀升至800，四合一疫苗組於第 一次免疫後抗體效價便攀升至 1600，相較於市售疫苗有更佳的抗體效價 產生。
3.5.2 猪胸膜肺炎放線桿菌 DNA 疫苗對小鼠抵抗攻毒之保護效 果
於第二次免疫後10 天 (第 24 天)以 5 × 108 CFU 對小鼠進行點鼻攻 毒，攻毒後24 小時內每 6 小時紀錄小鼠之死亡率，24 小時後每 12 小時 紀錄小鼠之死亡率，共觀察5 天，結果見圖 16 及圖 17。
小鼠於攻毒後24 小時內發生大量死亡的現象，死亡的小鼠口鼻有流 血的現象，與猪隻感染猪胸膜肺炎放線桿菌的症狀相同，表示小鼠的死 亡確實是由於猪胸膜肺炎放線桿菌的感染所致，攻毒後的小鼠的存活若 能超過攻毒後24 小時，即可耐過病菌的侵襲而存活下來。
於本實驗中PBS 組、空載體組 (圖 17)及 HgbA 組 (圖 16)小鼠於攻 毒後24 小時內全數死亡。
市售疫苗組、ApxⅡA 組及 OmlA 組 (圖 16)小鼠攻毒後存活率為 25%，雖然成效不彰，但光靠一種蛋白抗原便能與市售之不活化菌體疫 苗擁有相同的效果，顯示以 ApxⅡA 與 OmlA 作為研發疫苗之抗原確實 有其發展性，另一方面反觀市售之不活化菌體疫苗於小鼠上之攻毒後存
活率僅有 25%，可見目前猪胸膜放線桿菌肺炎的防治確實有其困難性，
研發出更有效的疫苗更是當務之急。
目前科學家研發對抗猪胸膜肺炎放線桿菌的抗原中以 ApxI (圖 16) 最被重視，由於ApxI 有強烈的溶血性及細胞毒性，是最重要的致病因子 之一，本實驗 ApxIA 組於攻毒後之存活率為 50%，是四組 DNA 疫苗中 效果最佳的，比市售疫苗更能提供保護性的免疫反應。
四合一疫苗組 (圖 17)綜合了四種 DNA 疫苗，保護性如預期的為八組中 最高，小鼠攻毒後存活率為66%。
圖表
表1 培養基及培養液之配製
LB medium
10 g Tryptone, 5 g Yeast extract, and 10 g NaCl. Add H2O to 1 L. Autoclave, store at 4℃.
LB plate
10 g Tryptone, 5 g Yeast extract, 10 g NaCl, and 15g agar. Add H2O to 1 L. Autoclave, store at 4℃.
BHI medium
37 g Brain heart infusion powder (Bacto) . Add H2O to 1 L. Autoclave, store at 4℃.
BHI plate
37 g Brain heart infusion powder (Bacto) ,and 15g agar. Add H2O to 1 L. Autoclave, store at 4℃.
Medium 199
9.5 g medium 199 powder (Gibco)in 1 L H2O, store at 4℃.
表2 緩衝液及實驗試劑之配製
0.5 M EDTA pH8.0
18.6 g EDTA
(Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium) in 100 ml H2O, pH 8.3, store at room temperature.
1 M Tris pH6.8 121. 14 g Tris in 1 L H2O, pH 8.3, store at room temperature.
1.5M Tris pH8.8 181.71 g Tris in 1 L H2O, pH 8.3, store at room temperature.
10% SDS-PAGE separating gel
1.25 ml 40% Acryl/BIS 37:5:1 solution, 1.25 ml 1.5 M Tris (pH8.8), 50μl 10%
SDS, 2.395 ml H2O, 50 μl 10% APS,and 5 μl TEMED.
5% SDS-PAGE stacking gel
312.5 μl 40% Acryl/BIS 37:5:1 solution, 315 μl 1 M Tris (pH6.8), 25μl 10% SDS, 1.82 ml H2O, 25 μl 10% APS,and 2.5 μl TEMED.
ELISA blocking buffer 1 g skim milk powder in 20 ml TBST.
ELISA coating buffer
2.93 g NaHCO3,and 1.59 g Na2CO3. Add H2O to 1 L, pH 9.6, store at room
temperature.
ELISA substrate buffer
9.58μl Diethanolamine,and 0.01 g MgCl2 in 100 ml H2O, pH 8.3, store at room temperature.
EtBr 1g EtBr in 100 ml H2O, store in the dark.
Gel loading buffer (6X)
0.25 g bromophenol blue, 0.25 g xylene cyanol FF, and glycerol 30ml. Add H2O to 100 ml, store at 4℃.
Lysozyme reaction solution 20 mM Tris-HCl, pH8.0; 2 mM EDTA;
20 mg/ml lysozyme, store at -20℃.
Phosphate buffered saline
1.58 g Na2HPO4, 0.3 g KH2PO4, and 8.5 g NaCl in 1 L H2O, pH 7.4, store at room temperature.
SDS loading dye (2X)
100 mM Tris (pH 6.8), 200mM DTT, 0.2% bromophenol blue, 4% SDS, 20%
glycerol, store at -20℃.
TAE buffer (50X stock)
242 g Tris, 57.1 ml glacial acetic acid, and 100 ml 0.5 M EDTA. Add H2O to 1 L, pH 8.0, store at room temperature.
TBST (5X)
43.83 g NaCl, 30.25 g Tris, and 2.5 ml Tween-20. Add H2O to 1 L, store at room temperature.
Tris-glycine electrophoresis buffer (10X stock)
30.2 g Tris, 188 g glycine, and 100 ml 10% SDS. Add H2O to 1 L, store at room temperature.
Western blot transfer buffer
2.9 g glycine, 5.8 g Tris, 1.37 g SDS, and 200 ml methanol. Add H2O to 1 L, pH 8.3, store at room temperature.
表3 PCR 試劑
藥品名 劑量
A. pleuropneumoniae serotype 1 genomic DNA (140μg/ml) 1 μl
forward primer (10μM) 4 μl
reverse primer (10μM) 4 μl
dNTP (2.5 mM) 4 μl
cloned Pfu reaction buffer (10 X) 5 μl Pfu Turbo DNA polymerase or Taq DNA polymerase (2.5U/μl) 1 μl ddH2O to final total volume 50μl
表4 合成各基因片段所需之寡核苷酸引子
引子 基因序列 (5’ to 3’) 復性溫度 Tm (℃)
apxIA forward primer CACCATGGCTAACTCTCAGCTCGA 60 apxIA reverse primer AGCTGCTTGTGCTAAAGAATAA 60 apx
Ⅱ
A forward primer CACCATGTCAAAAATCACTTTGTCA 54 apxⅡ
A reverse primer AGCGGCTCTAGCTAATTG 54 omlA forward primer ATGAATATTGCAACAAAATTAATG 58 omlA reverse primer TTTTTTATCTTCTTTTGTGGTTG 58 hgbA forward primer CACCATGATTGTGATTAAGCTTCGTT 58 hgbA reverse primer GAAAGTAACCTCTGCGGTTA 58表5 四種抗原 DNA 定序結果與 NCBI 基因資料庫比對結果 抗原DNA Base NCBI 定序結果 胺基酸變化
apxIA 381 C T Gly→Gly
apx
Ⅱ
A 2536 A G Lys→Glu2539 A G Asn→Asp
2577 A G Thr→Thr
2632 A G Lys→Glu
2680 A G Lys→Glu
2699 G T Trp→Val
2770、2771 AA GG Lys→Gly
2790 A G Gln→Gln
2812 G A Ala→Thr
2833 A G Asn→Asp
omlA 985 T C Phe→Leu
1072 G A Ala→Thr
hgbA 完全相同
表6 各組小鼠血清之抗體效價
組別 免疫前 第一次免疫後 第二次免疫後
ApxIA <100 12800 51200
ApxⅡA 200 204800 204800
OmlA <100 51200 409600 HgbA <100 25600 51200
四合一疫苗 <100 1600 1600
空載體 <100 <100 <100
市售疫苗 <100 <100 800
PBS <100 <100 <100
除四合一疫苗組為三隻小鼠外，各組各以四隻小鼠血清進行 ELISA，檢 測。數值為小鼠免疫前、後之血清以二重複進行ELISA 檢測所得之結果，
前四組測試血清中抗體對目標抗原之效價，以OD405 > 0.32 判定為陽性反 應；後四組測試血清中抗體對猪胸膜肺炎放線桿菌之效價，以 OD405 >
0.27 判定為陽性反應。
圖1 猪胸膜肺炎放線桿菌各種血清型與 Apx 毒素基因型對照圖 (摘錄自 Frey, 1995)
各種血清型猪胸膜肺炎放線桿所包含之Apx 毒素基因型，A 為前 毒素結構蛋白基因，C 為活化蛋白基因，B、D 為毒素分泌相關之 構造蛋白基因。
圖2 猪胸膜肺炎放線桿菌接收鐵離子之路徑 (摘錄自：Bosse, 2002)
猪胸膜肺炎放線桿菌可利用位於外膜上的鐵離子限制因子接收含 鐵蛋白，TbpA 及 TbpB 可接收輸鐵蛋白 (transferrin)及血紅素 (haem) ； FhuA 可 接 收 siderophore ； HgbA 可 接 收 血 紅 蛋 白 (haemoglobin)， 鐵 離 子 限 制 因 子 接 收 含 鐵 蛋 白 後 將 鐵 離 子 經 TonB、ExbB、ExbB 複合體運送至位於膜間 (periplasm)之 AfuA，
再經由 AfuB、AfuC 複合體將鐵離子運送至細胞質中，供菌體利 用。
圖3 DNA 疫苗之作用機制
(摘錄自Weiner and Kennedy, 1999)
將抗原基因選殖入含有真核生物啟動子之載體中，製成 DNA 疫
苗，將DNA 注射入動物之肌肉中，DNA 疫苗進入到肌肉細胞中，
經轉錄、轉譯作用製造出抗原蛋白，抗原蛋白會主動分泌至細胞 外，APC 再經由吞噬作用 (phagocytosis)將抗原蛋白吞噬到細胞 內，再以 MHC class II-peptide 複合體呈現目標抗原，之後再被送 至細胞表面以接合TH cell，刺激免疫系統的驅動。
(a)
(b)
圖4 pcDNATM3.1 Directional TOPO vector 基因序列圖譜
(摘錄自：http://catalog.invitrogen.com/productImages/2000/1969.GIF https://catalog.invitrogen.com/productImages/2000/1972.JPG) 本實驗採用兩種能在哺乳類細胞表現之載體，圖a 為 pcDNATM3.1 Directional TOPO vector；圖 b 為 pcDNATM3.1 TOPO vector。T7 promoter 可於原核生物表現選殖入之基因。V5 epitope 與 6xHis 可 便 於 偵 測 或 純 化 重 組 蛋 白 。 PCMV 為 巨 細 胞 病 毒 (cytomegalovirus)之啟動子，可於哺乳動物細胞內表現重組蛋白。
Neomycin 可用於篩選轉染過之哺乳類細胞。Ampicillin 可用於篩 選轉化過之 E. coli。BGH pA 與 SV40 pA 提供轉錄後 mRNA 之 polyadenylation。
圖5 猪胸膜肺炎放線桿菌於 BHI plate 上之生長情形
圖6 以 PCR 擴增出之 apxIA、apx
Ⅱ
A、omlA、hgbA 基因片段Lane M：1 Kb DNA Ladder。Lane 1：apxIA DNA，全長 3066 bp。
Lane 2：apxIIA DNA，全長 2868 bp。Lane 3：omlA DNA，全長 1095 bp。Lane 4：hgbA DNA，全長 2844 bp。
圖7 pcDNAD-ApxIA 質體以限制酶 EcoR V 切割後之基因片段
Lane M：1 Kb DNA Ladder。Lane 1：pcDNAD-ApxIA 質體以限制 酶 EcoR V 切割成 7749 bp 與 831 bp 之 DNA 片段。
圖8 pcDNAD-ApxⅡA 質體與 pcDNA-OmlA 質體以限制酶切割後之基 因片段
Lane M：1 Kb DNA Ladder。Lane 1：pcDNAD-ApxIIA 質體以限 制 酶 BamH I 切 割 成 8382 bp 之 DNA 片 段 。 Lane 2 ： pcDNAD-ApxIIA 質體以限制酶 BamH I、EcoR V 切割成兩段分別 為5514 bp、2868 bp 之 DNA 片段。Lane 3：pcDNA-OmlA 質體 以限制酶 BamH I 切割成 6618 bp 之 DNA 片段。Lane 4：
pcDNA-OmlA 質體以限制酶 BamH I、EcoR V 切割成兩段分別為 5463 bp、1146 bp 之 DNA 片段。
圖9 pcDNAD-HgbA 質體以限制酶 EcoR V 切割後之基因片段
Lane M：1 Kb DNA Ladder。Lane 1：pcDNAD-HgbA 質體以限制 酶 EcoR V 切割成 7276 bp 與 1082 bp 之 DNA 片段。
圖 10 pcDNAD-ApxIA 質體定序結果與 NCBI 基因資料庫 ApxIA 基因 (Accession No. AF240779)比對結果
apxIA 基因總長 3069 bp。本實驗之 apxIA 基因序列第 381 個鹼 基與NCBI 基因資料庫 apxIA 基因 (Accession No. AF240779)不 同。
(a)
(b)
(c)
圖11 pcDNAD-ApxⅡA 質體定序結果與 NCBI 基因資料庫 apx
Ⅱ
A 基因 (Accession No. AF363362)比對結果apx
Ⅱ
A 基因基因總長 2871 bp。本實驗之 apxⅡ
A 基因與 NCBI 基因資料庫 apxⅡ
A 基因 (Accession No. AF363362)共有 11 個鹼 基不同，分別為第2536、2539、2577 個鹼基 (圖 a)，第 2632、2680、2699 個鹼基 (圖 b)，第 2770、2771、2790、2812、2833 個鹼基 (圖 c)。
(a)
(b)
圖 12 pcDNA-OmlA 質體定序結果與 NCBI 基因資料庫 omlA 基因 (Accession No. AB007572)比對結果
omlA 基因基因總長 1098 bp。本實驗之 omlA 基因與 NCBI 基因資 料庫 omlA 基因 (Accession No. AB007572)共有 2 個鹼基不同，分 別為第 985 個鹼基 (圖 a)，第 1072 個鹼基 (圖 b)。
圖13 DNA 疫苗轉化過之 E. coli 菌體總蛋白表現之西方點墨法分析。
Lane M：Prestained Protein Ladder
Lane 1：轉化入 pcDNAD-ApxIA 之 E. coli 菌體總蛋白。
Lane 2：轉化入 pcDNAD-ApxIIA 之 E. coli 菌體總蛋白。
Lane 3：轉化入 pcDNAD-OmIA 之 E. coli 菌體總蛋白。
Lane 4：轉化入 pcDNAD-HgbA 之 E. coli 菌體總蛋白。
Lane 5：轉化入空載體之 E. coli 菌體總蛋白。
Lane 6：無轉化入任何載體之 E. coli 菌體總蛋白。
圖14 DNA 疫苗轉染過之猪腎細胞 (LLC-PK1)總蛋白表現之 SDS-PAGE 分析。
Lane M：Prestained Protein Ladder
Lane 1：轉染入 pcDNAD-ApxIA 之猪腎細胞總蛋白。
Lane 2：轉染入 pcDNAD-ApxIIA 之猪腎細胞總蛋白。
Lane 3：轉染入 pcDNAD-OmIA 之猪腎細胞總蛋白。
Lane 4：轉染入 pcDNAD-HgbA 之猪腎細胞總蛋白。
圖15 DNA 疫苗轉染過之猪腎細胞 (LLC-PK1)總蛋白表現之西方點墨法 分析。
Lane M：Prestained Protein Ladder
Lane 1：轉染入 pcDNAD-ApxIA 之猪腎細胞總蛋白。
Lane 2：轉染入 pcDNAD-ApxIIA 之猪腎細胞總蛋白。
Lane 3：轉染入 pcDNAD-OmIA 之猪腎細胞總蛋白。
Lane 4：轉染入 pcDNAD-HgbA 之猪腎細胞總蛋白。
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第四章 討論
猪放線桿菌胸膜肺炎自1976 年起於台灣開始蔓延，此病主要靠空氣 與接觸傳染，各年齡層猪隻皆可能感染猪胸膜肺炎放線桿菌，但以感染 2~3 個月齡之幼猪為主，死亡率高，即使猪隻耐受過急性期，菌體可能會 藏匿在扁桃線的線窩 (crypt)之中，而使猪隻成為帶原者，進而感染其他 猪隻，此病目前尚無有效的治療方法，防治主要以免疫為首要，而由於 猪胸膜肺炎放線桿菌擁有15 種血清型，增加了免疫的困難度，目前市面 上的疫苗以不活化死菌疫苗為主，此類型的疫苗往往僅能減少猪隻的死
猪放線桿菌胸膜肺炎自1976 年起於台灣開始蔓延，此病主要靠空氣 與接觸傳染，各年齡層猪隻皆可能感染猪胸膜肺炎放線桿菌，但以感染 2~3 個月齡之幼猪為主，死亡率高，即使猪隻耐受過急性期，菌體可能會 藏匿在扁桃線的線窩 (crypt)之中，而使猪隻成為帶原者，進而感染其他 猪隻，此病目前尚無有效的治療方法，防治主要以免疫為首要，而由於 猪胸膜肺炎放線桿菌擁有15 種血清型，增加了免疫的困難度，目前市面 上的疫苗以不活化死菌疫苗為主，此類型的疫苗往往僅能減少猪隻的死