2.1 藥品與儀器 2.1.1 藥品
藥品名稱 來源
Toluidine Blue O (TBO) Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA) Fluconazole Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA)
Posaconazole Merck (Whitby, Ontario, Canada) 酵母蛋白腖葡萄糖培養基
（Yeast peptone dextrose, YPD）
Difco (Detroit, MI, USA)
洋菜膠 Agar，granulated Difco (Detroit, MI,, USA) 磷酸緩衝液
（Phosphate buffer saline, PBS）
Bio-kit (Barcelona, USA)
2.1.2 儀器
儀器名稱 來源
紫外光可見光光譜分析儀
UV-Visible spectrophotometer DU800
Beckman Coulter (CA, USA) 迴轉恆溫震盪培養箱
Orbital shaking incubator OS/500
Yihder Technology co (Taipei, Taiwan) 紅色發光二極體矩陣 Light emitting diode (LED)
30 mW/cm2，波長範圍為 630 ± 5 nm
工業技術研究院(ITRT), Tawian
316L 不銹鋼錠片 淇鋒企業股份有限公司
(Taipei, Taiwan )
2.2 菌種來源與保存、活化 2.2.1 菌種來源
菌種名稱/編號 來源
白色念珠菌
Candida albicans SC5314
台大生化科技系林晉玄老師提供
抗藥性白色念珠菌
Candida albicans 2008 no 22
台大醫院陳怡君醫師實驗室提供
2.2.2 菌種保存與活化
將欲保存之菌種培養至穩定期(stationary phase)，去除培養液，8000 rpm 離 心五分鐘，移除上清液再以 PBS 回溶清洗菌體，重複同樣的步驟三次，回溶之 菌液再加入 25%(V/V)無菌甘油(Glycerol)，分裝至 1.5 mL 微量離心管並密封，置 於-80℃冰箱保存。實驗操作期間，每個月定期取出凍菌活化於固態培養基，平 時固態培養基保存於 4℃冰箱。
2.3 實驗方法 2.3.1 藥物配製
取適量克數的 TBO 粉末溶於無菌二次水中，均勻溶解後以 0.22 μm PVDF 過濾膜過濾除菌，分裝入 1.5 mL 微量離心管，於 4℃下保存，並於配製後一星 期內使用，超過一星期後會重新配製新的一批。
秤取適量克數的 Fluconazole 粉末，加入適量的 DMSO 均勻溶解後，分裝入 1.5 mL 微量離心管於室溫下保存。
2.3.2 白色念珠菌懸浮菌體培養
從固態培養基中取單一菌落，再接種至 20 mL YPD 培養液中，於 37℃培養 箱中以 150 rpm 下振盪培養至菌體生長達 Log-phase，菌數約為 107 CFU/mL。
2.3.3 光動力殺菌
將培養好預定菌數的菌液，以 8000 rpm 進行離心 5 min，移除上清液再以 PBS 回溶清洗菌體，重複同樣的步驟三次；光感物質以 PBS 稀釋至所需目標濃 度的 2 倍，取不同濃度的光感物質溶液與菌液等體積混合，於室溫且避光下共同 培養 30 分鐘後，培養期間以 100 rpm 轉速震盪，避免菌體沉降。培養完畢後，
以 12000 rpm 進行離心 1 min，移除上清液，再以 PBS 回溶，並再次離心，重複 一次。將回溶之混合液取 200 μL 加到 96-well microplate 中，以紅光 LED (630 ± 5 nm，30 mW)進行照光，之後取出混合液，以 PBS 系列稀釋，將稀釋 液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，並換 算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.4 白色念珠菌之生長曲線
將光動力作用後的菌液收集至 1.5 mL 微量離心管中，取 200 μL 菌液加到 20mL YPD 培養液，於 37℃培養箱以 150 rpm 振盪培養，並在不同的培養時間 點(0、2、4、6、8、10、12 小時)取出菌液，測量吸光值(OD600)，同時以 PBS 序 列稀釋，將稀釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計 數菌落數，並換算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.5 單獨 Fluconazole 殺菌效果
將培養好預定菌數的菌液，以 8000 rpm 進行離心 5 min，移除上清液再以 PBS 回溶清洗菌體，重複同樣的步驟三次。以 PBS 配置不同濃度的 Fluconazole 溶液與菌液等體積混合，於 37℃培養箱共同培養 24 小時，培養期間以 150 rpm 轉 速震盪，避免菌體沉降。之後取出混合液，以 PBS 序列稀釋，將稀釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，並換算稀釋倍 率求出原菌數。
2.3.6 光動力殺菌結合 Fluconazole 或 Posaconazole
先 將 菌 液 經 過 光 動 力 作 用 後 ， 再 與 最 終 濃 度 2 倍 的 Fluconazole 或 Posaconazole 混合，於 37℃培養 24 小時後，取出混合液，以 PBS 序列稀釋，將 稀釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，
並換算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.7 光動力殺菌後，不同時間點加入 Fluconazole 培養
將菌液經過光動力作用後，加入 50 μL YPD 培養液，於 37℃培養箱以 150 rpm 振盪培養，並在不同的時間點(0、2、4、6、8、10、12 小時)加入 50 μL Fluconazole (最終濃度為 0.25 g/ml)培養 24 小時，取出菌液進行序列稀釋，將稀 釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，並 換算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.8 白色念珠菌生物膜的光動力殺菌
加入等體積培養好預定菌數 107 CFU/mL 的菌液至含有 disk 的 48-well plate，
於 37℃培養箱靜置培養 90 分鐘後，取出 disk 至新的 48-well plate，加入 350 μ L YPD 培養液於 37℃培養箱靜置培養 48 小時。時間到後取出 disk 至 48-well plate，
以 PBS 洗除未附著的白色念珠菌，並加入 350 μL 適當濃度之光感物質，避光 培養 30 分鐘，以紅光 LED (630 ± 5 nm，30 mW)給與所需照光能量 50 J 後，再 將 disk 置於 1 mL PBS 中 vortex 均勻，並序列稀釋、滴盤計數菌落數。
2.3.9 白色念珠菌生物膜光動力殺菌結合 Fluconazole
加入等體積培養好預定菌數 107 CFU/mL 的菌液至含有 disk 的 48-well plate，
於 37℃培養箱靜置培養 90 分鐘後，取出 disk 至新的 48-well plate，加入 350 μ L YPD 培養液於 37℃培養箱靜置培養 48 小時。時間到後取出 disk 至 48-well plate，
以 PBS 洗除未附著的白色念珠菌，並加入 350 μL 適當濃度之光感物質，避光 培養 30 分鐘，以紅光 LED (630 ± 5 nm，30 mW)給與所需照光能量 50 J 後，加
入 350 μL Fluconazole 培養 24 小時，再將 disk 置於 1 mL PBS 中 vortex 均勻，
並序列稀釋、滴盤計數菌落數。
2.3.10 統計分析
所有實驗皆至少會重複三次，實驗數據皆以平均值 ± 誤差值(mean ± SD，
standard error of the mean)表示，統計顯著差異經由 unpaired Student's t-test 分析。
P＜0.05 視為在統計上有顯著差異，當 P<0.05 標示為＊；當 P<0.01 標示為＊＊；
當 P<0.001 標示為＊＊＊。
將 PDI 結合 Fluconazole 實驗結果原始數據，以 SAS 統計分析軟體(Statistics Analysis System, SAS)進行分析，分析兩者是否具有協同性，當 P 值有顯著差異 時，代表兩者會互相影響，圖表可分辨互相影響的類型。