國立臺灣大學生命科學院生化科技學系 碩士論文
Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science
National Taiwan University Master Thesis
結合光動力殺菌與Fluconazole在白色念珠菌的治療效 果探討
Investigate the therapeutic potential by combining photodynamic inactivation and Fluconazole against
Candida albicans
黃儀真
Yi-Jhen Huang
指導教授﹕陳進庭 博士 Advisor: Chin-Tin Chen, Ph.D.
中華民國 105 年 7 月
July 2016
誌謝
在實驗室兩年忙碌的生活時光，時間快速飛逝，最重要的是感謝我的指導教 授陳進庭老師，對我在實驗方面以及做人處事態度上的教導與建議，使我從中獲 益良多，在研究的思考邏輯有相當大進步，給予我莫大幫助。
感謝我的口試委員林晉玄老師、吳亘承老師和簡雄飛醫師百忙之中撥空參加 我的畢業論文口試，並在口試的時候，提供了許多寶貴的意見與改正，使我的論 文可以更加的完整與嚴謹。
特別感謝台大植物病理與微生物學系的陳穎練老師提供實驗藥物以及台大 醫院的陳宜君醫師提供臨床抗藥性菌株，使我的研究可以順利進行。
感謝實驗室所有學長姊、學弟妹們兩年的陪伴，謝謝倍慈學姊、柏鈞學長、
睦晴學姊、沈縵學姊在實驗上的給予我相當多的指導和建議，讓我能適時調整我 的實驗方向，繼續往前邁進。也謝謝尉屏學姊，在我剛進實驗室的時候教導我許 多實驗技術、原理及儀器操作等，並和我分享生活上的瑣事。謝謝小琪、依依、
恆真，幫助我一起協助處理實驗室的大大小小事務，再次謝謝實驗室全體夥伴對 我的照顧和幫助。
最後謝謝我的爸爸、媽媽以及男朋友在這一路上的支持與鼓勵，沒有你們的 加油打氣，就沒有現在的我，讓我可以順利完成碩士學位，在未來還有許多要學 習的地方，期望保持這份努力，勇往向前，莫忘初衷。
黃儀真 2016/07
摘要
近年來真菌感染的患者日益據增，尤其以白色念珠菌(Candida albicans)最 為常見，而抗真菌藥物的過度頻繁使用，也引發抗藥性問題。因此許多研究開 始 尋 找 其 他 的 治 療 方 法 ， 像 是 兩 種 藥 物 的 合 併 使 用 等 。 光 動 力 殺 菌 (Photodynamic inactivation, PDI)是不同於以藥物治療微生物感染的方式，透過 光反應產生單態氧與自由基對微生物造成傷害。本研究以 PDI 結合 Fluconazole 的方式，期望透過 PDI 增強 Fluconazole 對白色念珠菌的殺菌效果，降低藥物 使用劑量，減少抗藥性產生機會。
在本研究中，發現 PDI 對於白色念珠菌之懸浮細胞具有殺菌效果，且 PDI 造成的 damage 程度越嚴重，菌體需要修復的時間就越長，越晚進入 log phase。
實驗結果也發現 PDI 結合 Fluconazole 能增強對白色念珠菌的殺菌效果，降低 藥物使用劑量。進一步發現以 TBO 0.1 mM 進行 PDI 後，如果不於 2 小時內加 入 Fluconazole，菌體會有修復損傷情形，無法達到增強殺菌效果。類似的增強 殺菌效果也在 PDI 結合 Posaconazole 的研究中發現。此外，結合 PDI 和 Fluconazole 對白色念珠菌的臨床抗藥性菌株，也會有協同性的殺菌效果。最後，
應用在白色念珠菌的生物膜殺菌上，無法像在懸浮培養上有明顯的增強殺菌效 果。未來將朝向生物膜表面的胞外聚合物破壞程度與藥物作用性質，探討如何 進一步結合 PDI 和 Fluconazole 來增強對生物膜的殺菌效果。
關鍵字：光動力殺菌；白色念珠菌；甲苯胺藍；氟康唑；生物膜
Abstract
In recent years, infection of pathogenic fungus, especially Candida albicans, has increased gradually in patients. Antifungal drugs have been frequently used to treat these infections; however, side effects of antifungal drugs as well as drug resistance gradually become serious issues. Therefore, it is important to find an alternative treatment modality for fungal infection. Photodynamic inactivation (PDI), combination of a nontoxic photosensitizer (PS) and light, could produce free radicals or singlet oxygen that are toxic to pathogens.
In this study, we found that the combination of PDI and Fluconazole could synergistically increase the antifungal activity against C. albicans. Compared to C.
albicans without PDI treatment, the growth curve of C. albicans survived from PDI
remained in lag phase longer and this retention correlated with the PDI dose.
Furthermore, we found that the augmented antifungal activity will decrease if the addition of Fluconazole was performed two hours after PDI. Similar augment antifungal activity was also found in the combination of PDI and Posaconazole.
Although higher TBO concentration is required to exert its PDI efficacy, the synergistic fungicidal efficacy was also found in drug-resistant strains.
Keywords：Photodynamic Inactivation; Candida albicans; TBO; Fluconazole; Biofilm
目錄
誌謝... i
摘要... ii
Abstract ... iii
目錄... iv
結果目錄... vi
第一章 緒論... 1
1.1 人類與微生物... 1
1.1.1 正常菌叢(Normal microbial flora) ... 1
1.1.2 伺機性感染(Opportunistic infection) ... 1
1.1.3 院內感染(Nosocomial infection) ... 1
1.2 白色念珠菌(Candida albicans)... 2
1.2.1 念珠菌菌血症(Candidemia) ... 3
1.2.2 念珠菌生物膜... 4
1.2.3 白色念珠菌生物膜之生成過程... 4
1.2.4 念珠菌生物膜的抗藥性機制... 5
1.3 光動力治療(Photodynamic therapy, PDT) ... 7
1.3.1 光動力治療發展與起源... 7
1.3.2 光動力治療作用機制... 8
1.3.3 光感物質... 9
1.3.4 光動力殺菌... 10
1.4 抗真菌藥物... 11
1.4.1 抗真菌藥物的種類... 11
1.4.2 抗真菌藥物的抗藥性... 14
1.5 研究動機與目的... 17
第二章 材料與方法... 18
2.1 藥品與儀器... 18
2.1.1 藥品... 18
2.1.2 儀器... 18
2.2 菌種來源與保存、活化... 19
2.2.1 菌種來源... 19
2.2.2 菌種保存與活化... 19
2.3 實驗方法... 19
2.3.1 藥物配製... 19
2.3.2 白色念珠菌懸浮菌體培養... 19
2.3.3 光動力殺菌... 20
2.3.4 白色念珠菌之生長曲線... 20
2.3.5 單獨 Fluconazole 殺菌效果 ... 20
2.3.6 光動力殺菌結合 Fluconazole 或 Posaconazole ... 21
2.3.7 光動力殺菌後，不同時間點加入 Fluconazole 培養 ... 21
2.3.8 白色念珠菌生物膜的光動力殺菌... 21
2.3.9 白色念珠菌生物膜光動力殺菌結合 Fluconazole ... 21
2.3.10 統計分析... 22
第三章 結果... 23
3.1 光感物質 TBO 對於白色念珠菌懸浮菌體的殺菌效果... 23
3.2 光動力作用下，對於白色念珠菌的生長曲線探討... 23
3.3 不同濃度 Fluconazole 對白色念珠菌的影響 ... 24
3.4 0.25
g/ml Fluconazole 增強光動力殺菌探討 ... 243.5 先培養 Fluconazole 後，在進行光動力作用的殺菌效果 ... 25
3.6 光動力作用後，Fluconazole 加入的時間點探討 ... 25
3.7 不同濃度 Posaconazole 增強光動力殺菌的效果 ... 26
3.8 Fluconazole 與 Posaconazole 增強白色念珠菌抗藥性菌株的光動力殺菌探 討... 26
3.9 光動力作用對白色念珠菌生物膜的殺菌效果... 27
3.10 Fluconazole 增強光動力在白色念珠菌生物膜的殺菌效果 ... 28
第四章 討論... 29
4.1 光動力殺菌對於白色念珠菌的殺菌效果探討... 29
4.2 Fluconazole 增強光動力殺菌的效果探討 ... 29
4.3 光動力殺菌結合 Posaconazole 對白色念珠菌殺菌效果的探討 ... 31
4.4 光動力殺菌結合 Fluconazole 對白色念珠菌抗藥性菌株的影響 ... 31
4.5 光動力殺菌結合 Fluconazole 對白色念珠菌生物膜的殺菌效果探討 ... 32
4.6 光動力殺菌和 Fluconazole 交互作用的探討 ... 33
第五章 結論與未來研究方向... 35
結果圖表... 36
附錄... 48
附錄一、白色念珠菌生物膜形成... 48
附錄二、光化學反應... 49
附錄三、TBO (Toluidine Blue O)的分子結構 ... 50
附錄四、Fluconazole 與 Posaconazole 的分子結構 ... 51
附錄五、光動力殺菌與 Fluconazole 對白色念珠菌之間交互作用 ... 52
參考文獻... 53
結果目錄
圖一、不同濃度 TBO 對白色念珠菌的光動力殺菌效果………36
圖二、光動力作用對白色念珠菌生長的影響………37
圖三、不同濃度 Fluconazole 增強光動力殺菌對白色念珠菌的殺菌效果………. 38
圖四、不同濃度 Fluconazole 對不同起始菌數白色念珠菌的影響………..…...…39
圖五、不同濃度 TBO 結合 Fluconazole 對白色念珠菌的殺菌效果………...40
圖六、不同濃度 Fluconazole 結合光動力殺菌對白色念珠菌殺菌的效果……….41
圖七、光動力作用後，不同的時間點加入 Fluconazole 對白色念珠菌的影響….42
圖八、不同濃度 Posaconazole 增強光動力殺菌對白色念珠菌的殺菌效果……..43
圖九、光動力殺菌結合 azole 類藥物對白色念珠菌抗藥性菌株的殺菌效果….44
圖十、不同濃度 TBO 結合 Fluconazole 對白色念珠菌抗藥性菌株的殺菌效果…45
圖十一、光動力殺菌對白色念珠菌生物膜的殺菌效果………46
圖十二、光動力殺菌結合 Fluconazole 對白色念珠菌生物膜的殺菌效果……….47
第一章 緒論
1.1 人類與微生物
1.1.1 正常菌叢(Normal microbial flora)
人類生活中的環境存在多種的微生物，其在人體內許多部位及組織共生的微 生物群統稱為正常菌叢(Normal microbial flora)，主要包括細菌、真菌、原蟲等。
人體健康與這些正常菌叢有著密不可分的關係，正常菌叢透過人體所供給的養分 及產生的代謝產物，藉由產生生物拮抗的作用抵抗外在病菌等方式，進而抑制外 來微生物的生長，減少對人體的傷害。此外，正常菌叢也可以合成營養物質供人 類使用，例如維生素、胺基酸、葉酸等，一但菌群與人體免疫系統無法維持平衡 的狀態，使正常菌叢群相改變，將會造成感染發生或營養缺失。尤其是在免疫力 低弱或免疫不全的患者，體內環境產生變化，平衡狀態失衡，造成致病菌獲得生 長優勢，而對人體表皮黏膜、組織產生感染，甚至引起全身性的致命性感染[1]，
因此人體的這些正常菌叢存在對人類正面及負面的影響，與人類生活息息相關。
1.1.2 伺機性感染(Opportunistic infection)
伺機性病原菌在正常健康的人並不會引發疾病，通常屬於正常菌群，這是由 於人體有良好的免疫系統，足以抵抗病原菌的入侵。但當人體免疫系統缺陷或免 疫力不足情況下，這些病原菌便有機會可以大量繁殖生長，引起感染而導致疾病 產生。服用免疫抑制性藥物者、癌症病患、愛滋病患比較容易有伺機性感染的發 生。以愛滋病患為例，在口腔大約有 90%為白色念珠菌(Candidiasis)所造成的感 染，除了口腔外，感染部位也常見在皮膚黏膜、生殖器官、呼吸道等[2,3]。
1.1.3 院內感染(Nosocomial infection)
院內感染（Nosocomial infection）是指在醫院或其他相關的醫療機構內受到 細菌、黴菌、原蟲等微生物的感染。感染的範圍除了住院病人外，到醫院檢查的
人或甚至醫生、護士等醫護人員都有可能受到感染，造成群聚性感染，其感染途 徑可能是透過人與人間的接觸、血液、飛沫、食物、藥物等等途徑，亦或是由昆 蟲或動物等中間宿主的傳染[4]。除此之外，院內感染常見的菌種有腸球菌屬 (Enterococcus species)、腸內菌屬(Escherichia coli、Salmonella 等)、黴菌(Candida species) 、 抗 藥 性 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 、 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 、 鮑 氏 不 動 桿 菌 (Acinetobacter baumannii)等[5]，這些菌種都具有高度的抗藥性。而院內感染的好發類型以血液
感染、肺炎感染、泌尿道感染、外科手術部位的感染最普遍常見，其不僅造成高 死亡率，也增加治療上的困難度以及病人住院天數的延長，使得醫療資源的負擔 更沉重，加劇病人身心痛苦。
隨著科技進步及醫療發展的日新月異，許多的藥物及醫療器材陸續開發上市，
使病人壽命能延長，但伺機性病原菌所造成的感染情況卻逐年增加，其中以真菌 感染最常見，尤其是念珠菌(Candida)的感染近幾年來已成為院內感染主要的病 因。根據西元 2014 年疾病管制局院內感染監視系統的統計資料發現[6]，在醫院 的院內感染病患中最常見的菌株前五名為 Candida species、Escherichia coli、
Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter baumannii，顯示 念珠菌屬是最常見的院內感染主要的真菌致病菌。
1.2 白色念珠菌(Candida albicans)
白色念珠菌是真核生物中的真菌，為念珠菌屬（Candida species）屬於 Ascomycota 門、Endomycetes 綱、Saccharomycetales 目，具有細胞壁，為絕對好 氧性。白色念珠菌具有三種生長型態分別是酵母型、假菌絲型、菌絲型，其中酵 母菌型態呈圓形或卵圓形，不具有莢膜，行出芽生殖，此型態較適合在血液中散 布。假菌絲型則呈瘦長橢圓形，而菌絲型呈平滑狀具有器官選擇性，容易侵入宿 主黏膜表皮層，造成感染致使疾病的產生[7]。
白色念珠菌能生長的 pH 值和溫度範圍很廣泛，普遍存在於黏膜、口腔、胃 腸道、生殖器等部位，為伺機性病原菌之一，屬於人體內的正常菌群，但當人的 免疫系統失去作用後，例如愛滋病患或接受免疫抑制藥物患者，白色念珠菌有機 會轉變成伺機性病原菌，便能不正常的大量繁殖，而引起黏膜感染或是全身性的 致命感染，感染範圍相當廣泛，從局部性感染(口腔、生殖道)延伸到全身性感染 (血液)。
另外，念珠菌屬的種類相當繁多，其中從這些感染患者中所分離出的致病菌 種又以 Candida albicans 最為常見[8]，其他的念珠菌屬如 Candida glabrata、
Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida krusei 則有逐年增加趨勢。念
珠菌屬透過宿主免疫系統的失調，分泌胞外分解酵素及黏附因子等，提供自身所 需的養分，這些特性使念珠菌屬能夠成為致病菌，造成感染的發生，而許多因素 也會影響其致病能力，包括細胞型態、脂質分解、黏附因子等。
1.2.1 念珠菌菌血症(Candidemia)
念珠菌感染產生的疾病有許多種，像是感染口腔的鵝口瘡、婦女的陰道炎等，
而這些感染所引起的疾病中，又以念珠菌菌血症(Candidemia)最嚴重，念珠菌菌 血症一般是指人體的血液系統受到念珠菌侵入性的感染，近幾年來念珠菌菌血症 在各地的醫院發生案例頻傳，造成相當高的致病率與死亡率[9]，根據台大醫院 從西元 1987 年至今的統計資料，念珠菌菌血症發生率有逐年增加的趨勢，而在 西元 2000 年的統計結果，觀察到約每 1 萬個出院的病人中，出現了 28 個念珠菌 菌血症患者 [10]，但是由於過度頻繁使用抗真菌藥物治療念珠菌感染，現今已 有抗藥性問題的產生。在臨床上常見的症狀有呼吸過速、突然的發燒、寒顫、心 搏過速、血壓低等類似細菌性敗血症的情況產生。
在免疫系統正常情況下，T 細胞會使念珠菌無法在表皮增生並進一步侵犯人 體，而吞噬細胞可以防止念珠菌更深入的侵犯導致血液感染；造成念珠菌血症感 染主要因素有三個：首先要有念珠菌的增生，像是在病人的皮膚、腸道等部位增
生(內源性)，或者是在呼吸器、導管、靜脈注射液等(外源性)。第二，病人的皮 膚或黏膜有缺陷產生，使念珠菌可透過缺陷侵入人體。第三，病人免疫系統失調，
使 T 細胞、吞噬細胞(Phagocytes)無法發揮作用，念珠菌便趁機侵入[11]。
1.2.2 念珠菌生物膜
生物膜是指在自然界中的微生物會隨機黏附於固體表面，透過攝取環境中的 養分來複製、生長及分泌胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances , EPS)，
形成非均質性的動態蕈狀結構[12]。在這當中微生物提供養分來協助生物膜的形 成，使其可以日漸茁壯。同樣的，生物膜對微生物來說具有保護作用，抵抗不利 環境。生物膜在環境中到處可見，與我們日常生活、飲食等皆息息相關，例如：
自來水輸送管線、食品設備等都會形成生物膜，生物膜也會出現在生物體上及醫 療相關器材，例如：牙菌斑、人工關節等。
念珠菌所造成的感染與形成生物膜有相當大的關連性，生物膜的形成對於許 多藥物有較高的抗藥性，再加上生物膜很難以完全根除，使得菌對藥物敏感性降 低，治療效果下降。另外，念珠菌生物膜好發於人工關節、心臟導管、導尿管、
血液透析管等人工醫療器材，對於治療造成相當大影響，嚴重時可能會危及患者 的性命[13]。
1.2.3 白色念珠菌生物膜之生成過程
白色念珠菌生物膜的生成過程大致上可分為四個時期[14]，如附錄一。
(1)早期─菌體黏附固體表面
一開始白色念珠菌在 1 至 2 小時以酵母菌型式黏附在固體表面，菌體黏附方 式以靜電力、氫鍵與基質鍵結，產生許多非專一性反應。接著，菌體透過專一性 的表現細胞表面的醣蛋白等附著分子，增強與基質間的附著能力。
(2)中期─形成微菌落(Microcolonies)
白色念珠菌開始大量增生，形成明顯的微菌落，經過 18~24 小時表現出不同 的細胞型態，包含酵母菌型、發芽管、菌絲型、假菌絲型，此時菌體會不斷分泌
胞外聚合物，使這些物質會覆蓋原本的菌落形成覆蓋膜，幫助菌體順利附著在固 體表面。
(3)成熟期
在成熟期，白色念珠菌生物膜結構中所分泌的胞外聚合物大幅度增加，整個 菌落被完整包覆，包含不同的細胞型態，形成具有高度異質性的構造[15]，這樣 的結構環境除了提供細胞的養分，也有移除代謝物的功能。
(4)菌體脫落
當生物膜環境不再適合生長，白色念珠菌會分泌某些酵素分解胞外聚合物，
使懸浮細胞可以脫離生物膜尋找更適合的環境生長。
1.2.4 念珠菌生物膜的抗藥性機制
生物膜相較於懸浮狀態菌體具有較高的抗藥性，許多院內感染的發生和生物 膜形成有相當大的關係，這當中念珠菌的生物膜對於抗真菌藥物容易產生抗藥性，
造成治療效果不彰，其詳細的原因與機制尚未被研究清楚，普遍認為生物膜抗藥 性的產生包括非常多的因素，像是藥物的穿透、過度表現藥物輸送幫浦、生物膜 內的形態變化、胞外聚合物的生成等，以下介紹幾類[16]。
(1)限制藥物穿透(Limited drug penetration)
生物膜外層是由細胞分泌的胞外聚合物所組成，提供了物理性的屏障，對細 胞有保護的作用，抵抗外界不利的環境因子，例如：pH 值變化、氧氣、滲透壓 改變使細胞通透性降低等，這些因素造成抗真菌藥物難以穿透、進入生物膜的內 部，降低治療的效果。此外，帶正電的抗菌藥物會結合到生物膜上帶負電的胞外 聚合物，減少藥物與菌體接觸的機會，讓藥物無法直接作用[17]。
(2)生理性適應-生長速率及營養限制(Physiological adaptation)
在生物膜內部的營養及氧氣會形成濃度梯度，一般來說，生物膜上層容易獲 得養分，大多是好氧菌，那由於底層的細胞不容易攝取到養分，長期處在饑餓狀 態下，細胞為了適應環境的變化，會透過調節特定基因的表現與改變代謝作用來
面對這些挑戰，這使得可能影響菌體對於藥物的感受性。而白色念珠菌組成生物 膜的結構有較高的異質性，因此內部菌體的生長速度不同，對藥物的感受性有相 當大的不同。目前的研究發現生長速度快的微生物，對於藥物敏感性大，而生長 速度緩慢的微生物，對藥物的耐受性較高，雖然生物膜生長速度較緩慢，但其抗 藥性是明顯的增加[18]。
(3)藥物輸送幫浦(Drug efflux pumps)
白色念珠菌主要有兩種藥物輸出幫浦，分別是 Major Facilitators Superfamily (MFS) 以及 ATP-Binding Cassette (ABC) Transporters。MFS 作用機制是透過質子 梯度將藥物輸送到細胞外，ABC transporters 則是使用水解 ATP 產生能量輸送藥 物。前人研究也發現藥物輸送幫浦的相關基因表現上升時，會使藥物輸送到菌體 外，無法累積在生物膜內，藥物失去作用，因而抗藥性產生[19]，和 MFS 相關 的基因則是 CaMDR1(Candida albicans Multidrug Resistance)，而 ABC transporters 相關的基因主要是 CDR1 和 CDR2(Candida Drug Resistance)。
(4)持留細胞(Persister cell)
Persister cell 存在於微生物當中，為假設性的細胞狀態，有許多不同的外型。
前人研究發現 persister cell 對於許多藥物有良好的耐受性，可能是造成抗藥性的 因素之一，白色念珠菌的生物膜被發現也有 persister cell 存在[20]。
(5)細胞間的聯繫(cell to cell communication)
生物膜內部的細胞彼此間會傳遞訊息分子，相互溝通協調，同時也啟動許多 基因表現，改變生理活性，這樣的機制稱為群體感應系統(quorum sensing)，有研 究認為群體感應系統會影響生物膜的抗藥性，訊息分子對於此系統相當重要，若 阻斷訊息分子傳遞便會使群體感應系統停止，因此抗藥性可能會下降[21]。
1.3 光動力治療(Photodynamic therapy, PDT) 1.3.1 光動力治療發展與起源
光動力治療主要是由光、氧氣和不具毒性的光感物質(photosensitizer, PS)所 組成，屬於光醫學的範疇[22]，追溯到數千年前，人類在三千年前的古埃及時代 便知道可以利用陽光來治療疾病，如皮膚上的白斑病(vitiligo)、牛皮癬(psoriasis)、
軟骨病(rickets)等，發現經由陽光照射後能達到治療效果。歷史上經科學家證實 光動力治療的先例在西元 1900 年，德國科學家奧斯卡．瑞伯(Oscar Raab)發現碇 紅（acridine orange）染劑加到草履蟲（Paramecium caudatum）上，經由特定波 長光照射下，會增加對草履蟲的死亡率，其毒性大於單獨碇紅及單獨光的影響 [23]。這當中光動力療法是一直到十九世紀末才被真正的重視及發展，而上述的 發現開啟了利用特定光源結合化學物質的作用方式能使細胞死亡的概念。丹麥科 學家尼爾斯．芬森(Niels Finsen)在西元 1901 年發現利用紅光可以治療天花 (smallpox) ， 減 少 天 花 膿 包 化 膿 並 使 其 脫 落 。 數 年 之 後 也 發 現 使 用 紫 外 光 (ultraviolet light)可以治療皮膚結核病(cutaneous tuberculosis)，因而在西元 1903 年獲頒諾貝爾醫學獎的殊榮[24]，為近代光動力治療的起源。
光動力治療應用在臨床上治療的第一個例子是科學家 Herman Von Tappeiner 及皮膚科醫師 A. Jesionek 以伊紅（eosin）作為光感物質經由照光，運用在局部 性皮膚癌治療(skin cancer)，並稱此治療為光動力作用(photodynamic action)[25]。
Hausmann 是第一個研究血紫質（Heamatoporphyrin，Hp）的科學家，西元 1910 年他發現結合照光後，對草履蟲及紅血球細胞具有毒性，造成其死亡；另外，塗 抹在老鼠的皮膚後照光，也會造成一定程度傷害。Policard 在西元 1924 年利用血 紫質偵測與診斷腫瘤的位置，發現血紫質有選擇性累積情形。Samuel Schwartz 在西元 1955 年合成血紫質衍生物(Hematoporphyrin derivative，HpD)，其光毒性 是血紫質的兩倍。到了西元 1960 年科學家 Lipson 和 Baldes 利用血紫質衍生物應 用於腫瘤的治療研究，發現血紫質衍生物使用的劑量較血紫質低。在西元 1972
年，Diamond 研究發現血紫質衍生物照光後能成功傷害神經膠質瘤細胞(glioma) [26]，這樣的發現被科學家認為光動力治療或許是癌症治療的新方向，帶來新的 契機。西元 1975 年，Dougherty 首先將血紫質衍生物注入活體動物的腫瘤接著照 光後發現能消除腫瘤，而且不會對周圍正常組織細胞造成傷害。隔年西元 1976 年，Kelly 和 Snell 將血紫質衍生物應用在膀胱癌(bladdercancer)治療上[27]，是 光動力治療首次在人體臨床上的試驗。因此，光動力治療逐漸成為科學家研究的 重點以及重要的癌症治療方式。
此後光動力治療已獲得越來越多國家政府相關部門的核准在臨床治療上的 應用。光動力治療在癌症臨床治療目前主要應用在肺癌、口腔癌、食道癌、皮膚 癌、支氣管癌、婦科之腫瘤、胃癌及腹腔內的惡性腫瘤等。除此之外，光動力治 療也可以治療非癌症上的疾病，例如黃斑退化症(Macular degeneration)、類風濕 性關節炎(Rheumatoid)、乾癬症(Psoriasis)、皮膚疾病、心臟冠狀動脈阻塞(Coronary artery)等。
1.3.2 光動力治療作用機制
光動力治療有三要素：光源、光感物質和氧氣，是一種利用不具毒性的光感 物質，經由特定波長的光，激發此光感物質，在有氧氣情況下，產生一連串的光 化學反應，最終產生高活性的單態氧與自由基，其毒性對目標物造成一定程度破 壞，達到治療效果[28]。光動力治療優點有不會傷害其他正常組織以及能和傳統 的化學治療及放射線治療合併使用，受到相當大的重視。
當位於基態（ground state）的光感物質經由特定波長的光源照射後，受到激 發的光感物質躍升成不穩定的激發單態（excited singlet state），激發單態可回復 至基態，或者經系統間跨越（intersystem crossing）形成兩個不成對電子軌域的 激發三態（excited triplet state），其主要有兩種光化學反應路徑機制分別為 type I reaction 及 type II reaction，如附錄二[28]
(1)Type I reaction
經光照射成為激發三態的光感物質，與周邊基質如細胞膜、粒線體等發生碰 撞，造成電子或氫離子的轉移，產生許多自由基(free radical)，包含氫氧自由基
（hydroxyl radical，OH‧）、超氧陰離子（superoxide anion，O2-‧）、過氧化氫
（hydrogen peroxide， H2O2）等，進而對細胞造成嚴重破壞。
(2)Type II reaction
成為激發態的光感物質，將能量直接轉移給周圍基態的氧分子，使其轉變為 單態氧分子(singlet oxygen)，不穩定的單態氧具有高度反應活性，容易與附近生 物分子如蛋白質、脂質、細胞膜、核酸等物質作用造成傷害，但單態氧只對在附 近周遭範圍內的生物分子造成傷害，是由於其存在週期短(lifetime：＜200 ns)以 及擴散移動距離短(distribution distance ＜45 nm)的因素。
1.3.3 光感物質
光感物質一般是毒性低、半衰期短且帶有芳香環的化學物質，芳香環特性是 能幫助激發三態維持較長時間。光感物質吸收特定波長的光後被激發，能將光能 轉 變 為 化 學 能 。 光 感 物 質 依 作 用 機 制 可 分 為 外 生 型 (exogenous) 及 內 生 型 (endogenous)，大多數的光感物質當受到光源激發後會直接進行光動力作用，屬 於外生型，少數為內生型，其為光感物質前驅物，是需要經由細胞代謝才會形成 具光感性質的產物，像是δ-ALA(δ-aminolaevulinic acid)，其本身並不具光感物 質的特性，是原血紅素生合成路徑的前驅物，必須經由細胞代謝才會產生具有光 感性質的原紫質(protoporphyrinⅨ，ppⅨ)，此外，原紫質也是原血紅素生合成的 速率決定步驟，因此外加δ-ALA 後，可以大量累積光感物質在細胞內，造成細 胞傷害。光動力治療的所使用光感物質的選擇需要對細胞的毒性低、激發三態維 持較久、對目標物具有專一性以及當光動力作用結束後，剩餘的光感物質要能快 速從生物體內排除。
本研究使用的光感物質為屬於外生型的 TBO (Toluidine Blue O)，本身為帶正 電的光感物質，其化學結構如附錄三，主要的吸收波長約為 630 nm。TBO 是在
醫學領域研究方面很常使用的組織切片、血液染劑，可將目標物染成藍色，例如 肥大組織、軟骨細胞或是電子顯微鏡的薄切片等。此外，TBO 也常使用在外科 手術上，即使濃度高達 1％(w/v)對人體組織細胞也不會產生毒性，研究發現使用 對細菌可以達到完全殺菌效果的 TBO 劑量，並不會對人類的纖維母細胞 (fibroblasts) 及角質細胞(keratinocytes)產生毒性[29]。Aoki A 等人在 2014 年發表 的文獻指出，利用 TBO 所進行的光動力作用，會產生較高的氫氧自由基[30]。
而光動力作用反應機制中的 Type I reaction 是透過電子的轉移產生許多自由基，
包含氫氧自由基、超氧陰離子、過氧化氫等，進而對細胞造成嚴重破壞，因此作 者認為 TBO 所進行的光動力作用中 Type I reaction 扮演重要角色。
1.3.4 光動力殺菌
光動力殺菌（Photodynamic inactivation，PDI）是指將光動力作用在微生物 所造成的感染，產生抑制或殺菌的效果，達到治療疾病目的。光動力殺菌的過程 是多重作用目標(multi-target)，光感物質會累積在菌體表面，透過特定波長光照 射激發後，產生單態氧及自由基對菌體產生毒性，造成不可逆的傷害，與大部分 的抗菌藥物作用方式不同。當光動力作用在細胞膜時，可能會發生像是蛋白質與 脂質間的交互作用增加、氧化磷脂質等化學反應，細胞膜完整性因而受到破壞，
造成離子通透性的增加或喪失細胞膜的流動性，再加上細胞膜是電子傳遞鏈及產 生能量的主要位置，當其受到破壞便可能有機會使微生物死亡。除此之外，有研 究發現光動力作用所產生的自由基會氧化菌體內的核酸，造成 DNA 斷裂，抑制 菌體的複製[31]。
光動力殺菌所使用的光感物質對人體細胞組織不容易造成傷害且其多重作 用目標的特性被認為菌體較不容易產生抗性，與抗生素等藥物殺菌的作用機制不 同，因此若能將光動力殺菌應用在局部或表層性傷口感染的治療，不僅可減少抗 菌藥物使用的次數，也能降低正常菌叢與抗菌藥物頻繁的接觸，進而減低抗藥性 產生的機會，避免抗藥性菌株的形成。
1.4 抗真菌藥物
1.4.1 抗真菌藥物的種類
念珠菌的感染是現今醫療方面相當棘手的問題，不僅感染個案逐漸增加且死 亡率相當高，目前針對治療念珠菌的感染大多是以抗真菌藥物為主，藥物種類的 選擇會根據感染菌種及病情嚴重程度來決定。念珠菌與人類皆屬於真核生物，若 使用對抗原核生物細菌的抗生素來治療念珠菌的感染並無法產生抗菌的作用，必 須是抗真菌的藥物才有治療的效果。抗真菌藥物需要考慮藥物對人體副作用產生 的嚴重性，故找尋適當的藥物是開發新的抗真菌藥物的契機，近年來臨床上治療 真菌感染的抗真菌藥物有越來越多種，下列主要介紹幾種常使用在治療全身性念 珠菌感染的藥物。
(1)Polyene 多烯類
多烯類(Polyene)是第一類抗真菌藥物，例如 Amphotericin B、Nystatin 等，
其中 Amphotericin B 是主要使用在治療嚴重及有致命危險的全身性念珠菌感染 且具有殺菌的作用的抗真菌藥物，為土壤中的放射線菌( Actinomycetes )─結節狀 鏈球菌(Streptomyces nodosus)所生成的發酵產物，西元 1956 年上市，其抗菌範圍 廣包括大多數會對人致病的真菌，主要的作用機制是和真菌細胞膜上的麥角固醇 (Ergosterol)結合，其為細胞膜的主要成分，這使得細胞內部物質的單價離子(Na+、 K+、H+、Cl−)滲透出，因而改變細胞膜的通透性，離子失去平衡，細胞膜形成孔 洞而導致細胞死亡[32]。Nystatin 結構及作用機制與 Amphotericin B 相似，具有 殺菌效果(fungicidal activity)，主要用於治療口腔黏膜的感染，其毒性及副作用限 制了藥物的使用。
此外，研究也發現哺乳動物的膽固醇(Cholesterol)結構與真菌細胞膜的麥角 固醇相似，造成 Amphotericin B 也可和哺乳動物細胞膜上的膽固醇結合，導致人 體的細胞膜穿孔，對人體產生毒性，衍生出藥物所造成的許多副作用，例如腎毒 性、發燒、嘔吐、呼吸急促、低血壓等。後續為了降低 Amphotericin B 的副作用，
而發展出將藥物包埋至微脂體(Liposomes)的形式，此形式不僅可降低藥物的副作 用，也能維持藥物的作用效果，但缺點是和 Amphotericin B 相比，成本過高[33]。
(2)Nucleoside analogue 核酸衍生物類
5- 氟 胞 嘧 啶 (5-Fluorocytosine, 5-FC) 又 稱 Flucytosine 是 一 種 氟 化 嘧 啶 (Fluoropyrimidine)，為 RNA 和 DNA 合成抑制劑，除了用於治療嚴重的全身性 念珠菌感染，也有治療癌症效果，如大腸癌。此藥物主要的作用機制是 5-FC 進 入到念珠菌菌體內，透過胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase)將無毒性的 5-FC 轉 變為具毒性的 Fluorouracil (5-FU)，5-FU 有兩種反應路徑，第一是再轉化成 5-fluorouridine monophosphate (5-FUDP)，最終形成 5-fluorouridine triphosphate (5-FUTP) ， 可 以 嵌入 RNA ， 進 而 影 響 蛋白質 的 形成 。 第二 ， 5-FU 轉化為 5-fluorodeoxyuridine monophosphate (5-FdUMP)抑制 DNA 合成路徑的重要酵素 thymidylate synthetase，因此 DNA 合成受到抑制[34]。
5-FC 於西元 1972 年上市，口服的吸收效果好，但是研究發現單獨使用 5-FC，
隱球菌(Cryptococcus neoformans)容易產生抗藥性，於是將 Amphotericin B 與 5-FC 兩者合併使用來治療隱球菌腦膜炎(cryptococcal meningitis)，經由臨床試驗 證實不易產生抗藥性[35]，目前已較少單獨使用在治療真菌的感染。5-FC 缺點還 有當菌發生突變或其他因素而無法生成胞嘧啶脫氨酶，菌就對此類藥物不具感受 性，造成治療效果下降，藥物使用受到限制，其也存在許多副作用問題，像是骨 髓機能損傷、肝細胞傷害、腹瀉等。由於哺乳類細胞缺乏胞嘧啶脫氨酶，故對於 真菌與人類細胞具有選擇性。
(3)Azole 唑類
Azole 類抗真菌藥物依化學結構的不同可分為 imidazole(如：Ketoconazole 及 Miconazole)和 triazoles(如：Fluconazole 及 Itraconazole)兩類，其作用機制是透過 抑制細胞色素 Cytochrome P450 中的酵素 Lanosterol14α-demethylase，而抑制麥 角固醇的合成，其為念珠菌細胞膜的主要成分，這使細胞膜的構造受到破壞，而
影響菌體的生長，而 azoles 類藥物被認為是屬於抑菌性 ( fungistatic ) 的抗真菌 藥物。第一個口服的 azole 類藥物是 ketoconazole，於西元 1981 年上市，主要 用於治療皮膚黏膜的真菌感染，也可作為腎上腺類固醇的抑制劑，但卻發現可能 有對肝腎傷害的副作用[36]。
Fluconazole 是第一個 triazoles 藥物，分子結構如附錄四，於西元 1990 年上 市，水溶性藥物且口服吸收效果好，再加上對人體產生的副作用少、抗菌範圍廣 泛，是目前臨床醫學上主要使用治療念珠菌感染的第一線藥物。對於治療多種真 菌感染，例如念珠菌病、球黴菌病、及皮囊黴菌病的成效大，由於 Fluconazole 藥物的大量使用，近幾年來研究發現念珠菌屬中的 Candida tropicalis、Candida krusei、Candida glabrata 的發生案例逐漸增加，主要是這些菌株對於 Fluconazole
的抗藥性產生，而導致治療疾病的效果降低，因此在臨床上 Fluconazole 需面臨 抗藥性產生的問題[37]。
Posaconazole 是新一代 triazole 類藥物，其分子結構與 Itraconazole 相似，分 子結構如附錄四，於西元 2006 年上市的脂溶性藥物，抗菌範圍廣泛，包括念珠 菌屬、隱球菌，常見的副作用有噁心、嘔吐等[38]。
(4)Echinocandin 棘白素類
Echinocandin 類藥物是新一代的抗真菌藥物，包括 Caspofungin、Micafungin 等。大多數的抗真菌藥物作用機制是針對真菌細胞膜的麥角固醇，Echinocandin 類藥物則是抑制真菌細胞壁主要成份β-(1,3)- D-glucan 的合成酶，使無法合成出 β-(1,3)- D-glucan，造成細胞壁結構支撐力變弱，結構受到破壞，滲透壓失去穩 定性，造成細胞壁破裂而菌體死亡，具有殺菌作用。念珠菌組成細胞壁的成分主 要有 Chitin、Mannoproteins 及 Glucan，Glucan 又可分為β-(1,3)- D-glucan 和β -(1,6)- D-glucan 兩種，以β-(1,3)- D-glucan 為主要成分，佔念珠菌細胞壁大約 30%~60%[39]。
Caspofungin 是第一個美國食品藥物管理局(FDA)通過的 Echinocandin 類藥
物，於 2001 上市，可用於治療各種真菌的感染，人體對其耐受性好再加上人體 不存在β-(1,3)- D-glucan 故副作用較其他類藥物少。常見的副作用像是發燒、噁 心、嘔吐等，和其他藥物交互作用較少、細胞毒性也小，提供治療新的選擇[40]。
1.4.2 抗真菌藥物的抗藥性
抗藥性是指在藥物治療微生物感染的情況下，存活下來的菌仍然在宿主體內，
這些菌可能具有抵抗藥物的能力，並且對宿主持續產生致病性而造成危害。抗藥 性的產生主要是宿主與致病菌間複雜的交互作用影響[41]，而目前的抗真菌藥物 所面臨問題與挑戰便是抗藥性的產生，除了造成治療效果成效不彰，也會對人類 造成威脅，並且增加社會及醫療成本。
另外，微生物對於藥物的感受性會因為不同的病原菌而有差異，也會因菌的 種類以及菌型態的不同，例如菌為個體、菌叢或是生物膜等會使其感受性不同。
像是以念珠菌屬來說，Candida glabrata 和 Candida krusei 對於 Fluconazole 藥物 的感受性相較於 Candida albicans 低，造成此現象可能就是因為菌種的基因型態 不同，使得對同一種藥物的感受性不同。若能了解藥物抗藥性產生的機制，可以 降低菌的抗藥性發生機率，提高治療的成效。下列介紹幾種常見的抗真菌藥物以 及菌株對其產生抗藥性的機制
(1)Polyene 多烯類─Amphotericin B
Amphotericin B 的作用機制是透過和真菌細胞膜上的麥角固醇結合，使細胞 內部離子滲透出，通透性改變，導致細胞死亡。由於有細胞毒性的缺點，臨床上 治療以短期為主，可能是抗藥性發生率低的原因。而抗藥性產生的機制，主要是 細胞膜上脂質含量的改變，像是抗藥性菌株中缺少合成麥角固醇的酵素，使麥角 固醇生成減少，其他的脂質取代麥角固醇使得細胞膜上脂質的含量組成改變，導 致藥物無法結合在細胞膜，抗菌作用便無法產生[42]。
(2)Nucleoside analogue 核酸衍生物類─Flucytosine(5-FC)
5-FC 的作用機制是透過胞嘧啶脫氨酶(Cytosine deaminase)將 5-FC 轉變為具
毒性的 Fluorouracil(5-FU)，最終形成 5-FUTP 或 5-FdUMP 而抑制 RNA、DNA 合 成。其抗藥性的產生主要有兩種機制：第一種是 5-FU 在轉化成 5-FUTP 過程中 的酵素失去活性，藥物無法產生作用，降低殺菌的效果[34]。第二種是 Cytosine deaminase 的基因突變，蛋白質活性減少，造成藥物轉化下降，5-FC 無法轉化成 5-FU，導致抗藥性的產生。
(3)Azole 唑類─Fluconazole
Fluconazole 的作用機制是透過抑制細胞色素 Cytochrome P450 中的酵素 Lanosterol 14α-demethylase，而抑制麥角固醇的合成，由於 azole 類藥物性質為 抑制真菌生長並非殺死真菌，故在此藥物治療下可能使抗藥性問題增加，其抗藥 性產生的機制分為四種[43]
(a)合成麥角固醇的酵素基因 ERG11
ERG11 基因是麥角固醇生成路徑中重要酵素 Lanosterol 14α-demethylase 的 目標基因，主要為表現 ERG11p。當 ERG11 基因突變或過度表現時，Lanosterol 14α-demethylase 活性增加，因而麥角固醇生成的數量增加，菌不會受到藥物影響 而減少麥角固醇的生成量。
(b)合成麥角固醇生成路徑中的其他酵素基因發生突變
麥角固醇對於真菌是相當重要的固醇類，是細胞膜的主要成分，其生合成路 徑有許多基因的參與，像是 ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG7 等，若這當中 的一個基因發生突變會影響麥角固醇的生成，造成抗藥性的產生。
(c)表達藥物輸出幫浦的相關基因過度表現
白色念珠菌主要有兩種藥物輸出幫浦 Major Facilitators Superfamily (MFS) 和 ATP-Binding Cassette Transporters(ABC transporters)。MFS 作用機制是藉由 質子梯度將藥物輸送到細胞外，ABC transporters 則是透過水解 ATP 產生能量輸 送 藥 物 。 而 表 現 MFS 相 關 的 基 因 是 CaMDR1(Candida albicans Multidrug Resistance)，表現 ABC transporters 相關的基因主要是 CDR1 和 CDR2 (Candida
Drug Resistance)。前人研究發現藥物輸出幫浦的基因過度表現時，會使在細胞內 的藥物不斷被輸送到細胞外，導致細胞內部的藥物濃度下降，造成藥物對菌無法 產生殺菌作用，被認為是抗藥性產生的主要原因[44]。
(d)細胞膜內固醇類的組成改變
固醇類為細胞膜主要成分之一，若菌產生變異進而會影響固醇組成分的改變，
降低細胞膜的通透性，影響藥物的作用效果，造成抗藥性的產生。
(4)Echinocandin 棘白素類─Caspofungin
Echinocandin 類作用機制是抑制真菌細胞壁成份β-(1,3)- D-glucan 的合成酶，
造成細胞壁結構破壞。其抗藥性產生的機制主要原因是由於 Echinocandin 類藥物 是透過與 FKS1 蛋白結合而發揮作用，而 FKS1 是一個與生成 Glucan 有關的蛋白 質，但是當 FKS1 基因發生突變，藥物和 FKS1 的結合位改變，藥物無法和 FKS1 結合，藥物因而失去治療效果[45] ，造成抗藥性的產生。
1.5 研究動機與目的
致病性真菌感染的案例已有逐年增加的趨勢，由於臨床上治療真菌感染藥物 的廣泛使用，使許多致病性真菌產生抗藥性。由於新藥的研發速度往往比不上微 生物產生抗藥性的速度，這使許多研究學者們開始嘗試開發新型的治療方式來對 抗微生物的感染。近年來有許多研究是將兩種抗真菌藥物合併使用於治療微生物 感染，希望藉此來提高治療效果。
在光動力殺菌作用的過程中，菌體不會對光動力作用產生抗性、對宿主影響 小以及誘發突變風險低等許多優點。然而光動力殺菌也會因為光源穿透能力的限 制，使得存在於深層組織中的病原菌有機會在治療之後存活下來，這些殘存下來 的病原菌，可能會繼續生長，進而對病患健康造成威脅。
為了解決光動力殺菌的光源穿透能力有限以及白色念珠菌對抗真菌藥物的 可能療效不彰或抗藥性等問題，本研究想要探討光動力殺菌結合現今常使用治療 念珠菌感染的抗真菌藥物 Fluconazole 或是另一種 azole 藥物 Posaconazole，能否 提高殺菌作用的效果以及減少藥物的使用劑量。此外，我們也將進一步探討抗藥 性菌株和標準菌株的生物膜型態下，PDI 結合 Fluconazole 是否也能夠提高殺菌 作用。希望透過將兩者結合發展出治療真菌感染的有效方法，期許日後能解決光 動力殺菌與現有抗真菌藥物所面臨的問題。
第二章 材料與方法
2.1 藥品與儀器 2.1.1 藥品
藥品名稱 來源
Toluidine Blue O (TBO) Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA) Fluconazole Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA)
Posaconazole Merck (Whitby, Ontario, Canada) 酵母蛋白腖葡萄糖培養基
（Yeast peptone dextrose, YPD）
Difco (Detroit, MI, USA)
洋菜膠 Agar，granulated Difco (Detroit, MI,, USA) 磷酸緩衝液
（Phosphate buffer saline, PBS）
Bio-kit (Barcelona, USA)
2.1.2 儀器
儀器名稱 來源
紫外光可見光光譜分析儀
UV-Visible spectrophotometer DU800
Beckman Coulter (CA, USA) 迴轉恆溫震盪培養箱
Orbital shaking incubator OS/500
Yihder Technology co (Taipei, Taiwan) 紅色發光二極體矩陣 Light emitting diode (LED)
30 mW/cm2，波長範圍為 630 ± 5 nm
工業技術研究院(ITRT), Tawian
316L 不銹鋼錠片 淇鋒企業股份有限公司
(Taipei, Taiwan )
2.2 菌種來源與保存、活化 2.2.1 菌種來源
菌種名稱/編號 來源
白色念珠菌
Candida albicans SC5314
台大生化科技系林晉玄老師提供
抗藥性白色念珠菌
Candida albicans 2008 no 22
台大醫院陳怡君醫師實驗室提供
2.2.2 菌種保存與活化
將欲保存之菌種培養至穩定期(stationary phase)，去除培養液，8000 rpm 離 心五分鐘，移除上清液再以 PBS 回溶清洗菌體，重複同樣的步驟三次，回溶之 菌液再加入 25%(V/V)無菌甘油(Glycerol)，分裝至 1.5 mL 微量離心管並密封，置 於-80℃冰箱保存。實驗操作期間，每個月定期取出凍菌活化於固態培養基，平 時固態培養基保存於 4℃冰箱。
2.3 實驗方法 2.3.1 藥物配製
取適量克數的 TBO 粉末溶於無菌二次水中，均勻溶解後以 0.22 μm PVDF 過濾膜過濾除菌，分裝入 1.5 mL 微量離心管，於 4℃下保存，並於配製後一星 期內使用，超過一星期後會重新配製新的一批。
秤取適量克數的 Fluconazole 粉末，加入適量的 DMSO 均勻溶解後，分裝入 1.5 mL 微量離心管於室溫下保存。
2.3.2 白色念珠菌懸浮菌體培養
從固態培養基中取單一菌落，再接種至 20 mL YPD 培養液中，於 37℃培養 箱中以 150 rpm 下振盪培養至菌體生長達 Log-phase，菌數約為 107 CFU/mL。
2.3.3 光動力殺菌
將培養好預定菌數的菌液，以 8000 rpm 進行離心 5 min，移除上清液再以 PBS 回溶清洗菌體，重複同樣的步驟三次；光感物質以 PBS 稀釋至所需目標濃 度的 2 倍，取不同濃度的光感物質溶液與菌液等體積混合，於室溫且避光下共同 培養 30 分鐘後，培養期間以 100 rpm 轉速震盪，避免菌體沉降。培養完畢後，
以 12000 rpm 進行離心 1 min，移除上清液，再以 PBS 回溶，並再次離心，重複 一次。將回溶之混合液取 200 μL 加到 96-well microplate 中，以紅光 LED (630 ± 5 nm，30 mW)進行照光，之後取出混合液，以 PBS 系列稀釋，將稀釋 液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，並換 算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.4 白色念珠菌之生長曲線
將光動力作用後的菌液收集至 1.5 mL 微量離心管中，取 200 μL 菌液加到 20mL YPD 培養液，於 37℃培養箱以 150 rpm 振盪培養，並在不同的培養時間 點(0、2、4、6、8、10、12 小時)取出菌液，測量吸光值(OD600)，同時以 PBS 序 列稀釋，將稀釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計 數菌落數，並換算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.5 單獨 Fluconazole 殺菌效果
將培養好預定菌數的菌液，以 8000 rpm 進行離心 5 min，移除上清液再以 PBS 回溶清洗菌體，重複同樣的步驟三次。以 PBS 配置不同濃度的 Fluconazole 溶液與菌液等體積混合，於 37℃培養箱共同培養 24 小時，培養期間以 150 rpm 轉 速震盪，避免菌體沉降。之後取出混合液，以 PBS 序列稀釋，將稀釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，並換算稀釋倍 率求出原菌數。
2.3.6 光動力殺菌結合 Fluconazole 或 Posaconazole
先 將 菌 液 經 過 光 動 力 作 用 後 ， 再 與 最 終 濃 度 2 倍 的 Fluconazole 或 Posaconazole 混合，於 37℃培養 24 小時後，取出混合液，以 PBS 序列稀釋，將 稀釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，
並換算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.7 光動力殺菌後，不同時間點加入 Fluconazole 培養
將菌液經過光動力作用後，加入 50 μL YPD 培養液，於 37℃培養箱以 150 rpm 振盪培養，並在不同的時間點(0、2、4、6、8、10、12 小時)加入 50 μL Fluconazole (最終濃度為 0.25 g/ml)培養 24 小時，取出菌液進行序列稀釋，將稀 釋液接種至 YPD 固態培養基上，於 37℃下靜置培養過夜，最後計數菌落數，並 換算稀釋倍率求出原菌數。
2.3.8 白色念珠菌生物膜的光動力殺菌
加入等體積培養好預定菌數 107 CFU/mL 的菌液至含有 disk 的 48-well plate，
於 37℃培養箱靜置培養 90 分鐘後，取出 disk 至新的 48-well plate，加入 350 μ L YPD 培養液於 37℃培養箱靜置培養 48 小時。時間到後取出 disk 至 48-well plate，
以 PBS 洗除未附著的白色念珠菌，並加入 350 μL 適當濃度之光感物質，避光 培養 30 分鐘，以紅光 LED (630 ± 5 nm，30 mW)給與所需照光能量 50 J 後，再 將 disk 置於 1 mL PBS 中 vortex 均勻，並序列稀釋、滴盤計數菌落數。
2.3.9 白色念珠菌生物膜光動力殺菌結合 Fluconazole
加入等體積培養好預定菌數 107 CFU/mL 的菌液至含有 disk 的 48-well plate，
於 37℃培養箱靜置培養 90 分鐘後，取出 disk 至新的 48-well plate，加入 350 μ L YPD 培養液於 37℃培養箱靜置培養 48 小時。時間到後取出 disk 至 48-well plate，
以 PBS 洗除未附著的白色念珠菌，並加入 350 μL 適當濃度之光感物質，避光 培養 30 分鐘，以紅光 LED (630 ± 5 nm，30 mW)給與所需照光能量 50 J 後，加
入 350 μL Fluconazole 培養 24 小時，再將 disk 置於 1 mL PBS 中 vortex 均勻，
並序列稀釋、滴盤計數菌落數。
2.3.10 統計分析
所有實驗皆至少會重複三次，實驗數據皆以平均值 ± 誤差值(mean ± SD，
standard error of the mean)表示，統計顯著差異經由 unpaired Student's t-test 分析。
P＜0.05 視為在統計上有顯著差異，當 P<0.05 標示為＊；當 P<0.01 標示為＊＊；
當 P<0.001 標示為＊＊＊。
將 PDI 結合 Fluconazole 實驗結果原始數據，以 SAS 統計分析軟體(Statistics Analysis System, SAS)進行分析，分析兩者是否具有協同性，當 P 值有顯著差異 時，代表兩者會互相影響，圖表可分辨互相影響的類型。
第三章 結果
3.1 光感物質 TBO 對於白色念珠菌懸浮菌體的殺菌效果
過去許多文獻發現光動力作用對於許多微生物具有良好的殺菌效果[46]。為 了瞭解光動力作用對於白色念珠菌的影響，首先將不同濃度的 TBO 與白色念珠 菌混合培養 30 分鐘以紅光 LED 照射 50 J/ cm2後，觀察光動力作用後的殺菌效 果。
實驗結果如圖一所示，當 TBO 濃度為 0.05 mM 時，白色念珠菌在經過光動 力效應後的菌數降低約 2 個 log 的菌數，然而，當 TBO 濃度為 0.1 mM 時，降低 約 3 個 log，在當 TBO 濃度高於 0.2 mM 時可達到完全殺菌的效果，由此可知光 動力殺菌對於白色念珠菌的殺菌能力隨著光感物質濃度提高而增加，在接下來的 研究中我們選用 0.05 mM 與 0.1 mM 作為後續實驗使用濃度。
3.2 光動力作用下，對於白色念珠菌的生長曲線探討
為了想知道白色念珠菌經光動力作用後存活的菌體是否受到損傷，我們藉由 觀察白色念珠菌在受到光動力作用後，白色念珠菌的生長曲線是否受到改變。本 實驗以 0.05、0.075、0.1 mM TBO 進行光動力作用，之後進行培養，取不同時間 點滴盤計數生菌數，在此將有無經 PDI 處理的菌固定起始菌數，以便觀察生長 曲線變化，其生長快慢並不是因為菌數不同所造成。
實驗結果如圖二，可以發現未經過 PDI 處理的白色念珠菌在培養 2 小時後 開始進入 log phase，而以 0.05 mM TBO 條件進行 PDI 的白色念珠菌，在培養 2 小時後開始進入 log phase，但整體曲線相比未經過 PDI 處理的有延遲的現象，
0.075 mM TBO 條件進行 PDI 時則是明顯發現在培養 4 小時後才開始進入 log phase。若以 0.1 mM TBO 條件進行 PDI 時，則明顯發現在培養 6 小時後開始進 入 log phase。由此實驗推論，經過 PDI 處理後的白色念珠菌其生長速度較未經 PDI 處理的生長速度慢，表示經過 PDI 處理後，damage 程度越嚴重情況下，未
被殺死的白色念珠菌需要進行細胞修復的時間就越長，才會開始進入 log phase。
3.3 不同濃度 Fluconazole 對白色念珠菌的影響
透過先前的實驗結果得知，光動力作用對於白色念珠菌具有良好殺菌效果，
再 加 上 目 前 臨 床 上 針 對 白 色 念 珠 菌 所 引 起 的 感 染 ， 治 療 的 藥 物 主 要 是 以 Fluconazole 最常使用。因此接下來想更進一步了解在 PDI 結合 Fluconazole 和單 獨 PDI 或單獨 Fluconazole 相比較，是否會增強對白色念珠菌的殺菌效果
實驗結果如圖三，當 TBO 濃度為 0.05 mM 時，光動力作用能降低白色念珠 菌生菌數約 1.5 個 log 值，接著與不同濃度 Fluconazole 培養，觀察到加入 1 g/ml 的 Fluconazole 能達到完全殺菌效果。而當 TBO 濃度為 0.1 mM，光動力作用能 降低菌數約 2.5 個 log 值，與不同濃度的 Fluconazole 培養後，發現只需要加入 0.25 g/ml 的 Fluconazole 就能達到完全殺菌，由實驗結果可以知道跟單獨 Fluconazole 比起來，PDI 後再結合 Fluconazole 確實有達到增強殺菌效果。
然而為了要釐清菌數多寡是否會影響 Fluconazole 的作用效果，因此本研究 欲 探討 不同 濃 度 Fluconazole 與不 同菌 數 的 白色 念珠 菌共 同培 養後， 觀察 Fluconazole 對於白色念珠菌是否具有細胞毒性，且作用效果是否受到菌數影響。
實驗結果如圖四，即使當 Fluconazole 濃度高達 1 g/ml 的情況下，白色念珠 菌的菌數並未受到明顯的影響。然而生菌數多寡是否會影響 Fluconazole 對白色 念珠菌的作用效果，實驗結果發現 Fluconazole 對白色念珠菌不同起始菌數皆無 明顯的殺菌效果。由此可知，不論 Fluconazole 濃度改變或是白色念珠菌起始菌 數的改變，皆無明顯影響白色念珠菌存活菌數。
3.4 0.25 g/ml Fluconazole 增強光動力殺菌探討
透過圖三的實驗結果得知道 PDI 結合 Fluconazole，確實能增強對白色念珠 菌的殺菌效果後，接著探討當隨著 TBO 濃度提高時，結合相同濃度的 Fluconazole 是否會提高 PDI 的殺菌效果。
實驗結果如圖五，在 TBO 0.075 mM 條件下進行 PDI 後，再加入 Fluconazole
0.25 g/ml 的濃度，與 control 相比約降低 2 個 log 值，和單獨 PDI 相比約降低 1 個 log。若以 TBO 0.1 mM 條件下進行 PDI，則在 Fluconazole 0.25 g/ml 有全殺 的效果，由此實驗結果可看出，藉著 TBO 濃度的提高來增強光動力效應，相同 的 Fluconazole 濃度確實能協同增加 PDI 的殺菌效果。
3.5 先培養 Fluconazole 後，在進行光動力作用的殺菌效果
透過前面實驗結果知道當先進行 PDI 再結合處理 Fluconazole 確實能提高殺 菌效果後，接下來本研究想探討若是先以 Fluconazole 培養白色念珠菌後再進行 PDI 是否會有相同作用效果。首先加入不同濃度的 Fluconazole 與白色念珠菌培 養 24 小時後，再以 0.05 mM 條件進行 PDI，觀察存活菌數。
實驗結果如圖六，發現先以濃度 1 g/ml 的 Fluconazole 處理白色念珠菌，
再施以光動力殺菌後，和 control 相比菌數降低約 2.9 個 log 值。顯示先進行 Fluconazole 處理再進行 PDI 相比先進行 PDI 再處理 Fluconazole 的作用效果，可 能是因為 PDI 會對白色念珠菌造成傷害，此時再加入 Fluconazole，使得受傷的 菌體來不及修復而死亡，因此先進行 PDI 再處理藥物的作用效果比先處理藥物 的效果顯著。
3.6 光動力作用後，Fluconazole 加入的時間點探討
由前面圖二生長曲線的實驗結果顯示經光動力作用處理後存活下來的白色 念珠菌依舊有受到某種程度的傷害，需要時間進行細胞修復，才能恢復正常的生 長狀態。當 damage 程度越嚴重，修復的時間就越長，才會進入 log phase；由於 PDI 結合 Fluconazole，能協同性的增強對白色念珠菌的殺菌效果。因此我們進一 步探討，白色念珠菌在受到 PDI 後，在不同時間點下加入 Fluconazole 進行培養，
觀察其是否還能達到完全殺菌的效果。
在此實驗選用 TBO 0.1 mM 條件對白色念珠菌進行 PDI，之後放入 37℃培 養箱培養，並且在 PDI 後不同時間點加入 0.25 g/ml Fluconazole 培養 24 小時後，
進行序列稀釋滴盤，於 37℃下培養過夜，最後計數菌落數。實驗結果如圖七所
示，觀察到單獨 PDI 後可使菌數降低約 2 個 log 值，直接加入 Fluconazole 培養 後，可以達到完全殺菌的效果，而當培養時間達至 4 小時後，再加入 Fluconazole 培養，發現無法達至完全殺菌，菌數約 3.9 個 log 值，隨著培養時間增加，加入 Fluconazole 培養，殺菌效果有降低的情形。
3.7 不同濃度 Posaconazole 增強光動力殺菌的效果
藉由前面圖三實驗結果知道當先進行 PDI 再結合處理 Fluconazole 確實能提 高殺菌效果後，接下來本研究想探討若是 PDI 結合其他 azole 類藥物是否也有相 同效果，因此使用另一種 azole 類藥物 Posaconazole，探討 PDI 結合 Posaconazole 是否也會增強殺菌效果。
實驗結果如圖八(A)所示，當 TBO 濃度為 0.05 mM 時，光動力作用能降低白 色念珠菌生菌數約 1.5 個 log 值，接著與不同濃度 Posaconazole 培養，觀察到加 入 1 g/ml 的 Posaconazole 能降低生菌數約 4 個 log 值。而當 TBO 濃度為 0.1 mM，
光動力作用能降低菌數約 2.5 個 log 值，與不同濃度的 Posaconazole 培養後，發 現加入 0.5 g/ml 的 Posaconazole 就能達到完全殺菌，如圖八(B)，由實驗結果可 知相比於單獨處理 Posaconazole，PDI 後再結合 Posaconazole 有達到增強殺菌效 果，此現象可能普遍存在於 azole 類的藥物。
3.8 Fluconazole 與 Posaconazole 增強白色念珠菌抗藥性菌株的光動 力殺菌探討
透過前面實驗結果得知先進行 PDI 後結合 azole 類藥物可以提高對白色念珠 菌標準菌株的殺菌效果。在此探討在抗藥性菌株上是否也有相同趨勢。
實驗結果如圖九，選用 0.1 mM 的 TBO 結合 0.25 g/ml Fluconazole 以及 TBO 0.1 mM 結合 0.5 g/ml Posaconazole，觀察對於白色念珠菌抗藥性菌株的殺菌的 效果，發現在 TBO 0.1 mM 條件下進行 PDI 後再加入 Fluconazole 0.25 g/ml，和 單獨 PDI 相比約降低 0.4 個 log 值。以 TBO 0.1 mM 條件進行 PDI 則加入
Posaconazole 0.5 g/ml 濃度下和單獨 PDI 相比約降低 1.2 個 log 值，實驗結果顯 示 PDI 結合 azole 藥物確實有提高抗藥性菌株對藥物的敏感性。
透過實驗結果圖九得知 PDI 結合 azole 藥物確實有提高抗藥性菌株對藥物的 敏感性。接著探討當隨著 TBO 濃度提高時，結合相同濃度的 Fluconazole 是否會 提高 PDI 對抗藥性菌株的殺菌效果。
實驗結果如圖十，與標準菌株相比對於光動力作用有不同耐受性的抗藥性菌 株，在 TBO 0.1 mM 條件下進行 PDI 後，再加入 Fluconazole 0.25 g/ml 的濃度，
與 control 相比約降低 0.8 個 log 值，和單獨 PDI 相比約降低 0.3 個 log 值。若以 TBO 0.2 mM 條件下進行 PDI，加入 Fluconazole 0.25 g/ml 的濃度，與 control 相比約降低 1.8 個 log 值，和單獨 PDI 相比約降低 1.3 個 log。以 TBO 0.4 mM 條 件下進行 PDI，則在加入 Fluconazole 0.25 g/ml 有全殺的效果，由此實驗結果可 看出，隨著 TBO 濃度的提高，相同的 Fluconazole 濃度確實能提高 PDI 的殺菌效 果，結果顯示當光動力作用能對菌體造成一定程度傷害後，再加入 Fluconazole 進行培養，Fluconazole 就能增強光動力殺菌達到完全殺菌效果。
3.9 光動力作用對白色念珠菌生物膜的殺菌效果
由前面實驗結果知道先進行 PDI 再結合處理 Fluconazole 確實能提高對白色 念珠菌懸浮菌體的殺菌效果，因此探討 PDI 結合 Fluconazole 是否也能提高對白 色念珠菌生物膜的殺菌效果，進而減少藥物使用劑量，且降低病原菌產生抗藥性 機會。首先探討光動力作用對於白色念珠菌生物膜的影響，將不同濃度的 TBO 與生物膜培養 30 分鐘，以紅光 LED 照射 50 J/ cm2後，觀察在光動力作用後的 殺菌效果。
結果如圖十一所示，當 TBO 濃度為 0.25 mM 時，白色念珠菌的生物膜菌數 降低約 1.5 個 log 值。當 TBO 濃度為 2.5 mM 時，降低約 2.6 個 log 值，然而，
隨著光感物質濃度提高，光動力殺菌對於白色念珠菌生物膜的殺菌效果沒有跟著 提高，即使濃度高達 10 mM 對白色念珠菌生物膜的殺菌能力並沒有顯著提高，
因此接下來選用 2.5 mM 作為後續實驗使用濃度。
3.10 Fluconazole 增強光動力在白色念珠菌生物膜的殺菌效果
藉由前面實驗結果發現 PDI 對於白色念珠菌殺菌能力在懸浮菌體需 TBO 0.1 mM 約降低 3 個 log 值，生物膜需 TBO 2.5 mM 約降低 2.6 個 log 值，在生物膜 所使用的光感物質濃度較懸浮菌體來的高如實驗結果圖十一。接下來的研究將進 一步探討 PDI 結合不同濃度 Fluconazole 對白色念珠菌生物膜的殺菌效果。
實驗結果如圖十二所示，當 TBO 濃度為 2.5 mM 時，光動力作用能降低白 色念珠菌生菌數約 2.5 個 log 值，再加入不同濃度 Fluconazole 培養，發現即使 濃度達到 200 g/ml Fluconazole 仍無法達到完全殺菌效果，可能與生物膜結構破 壞不完整藥物難以進入菌體或是藥物本身的性質有關，將於討論中詳細敘述。
第四章 討論
4.1 光動力殺菌對於白色念珠菌的殺菌效果探討
光動力殺菌是指將光動力作用在微生物上，達到殺菌的效果，其過程是多重 作用目標，透過特定波長光照射激發後，產生單態氧及自由基對菌體造成不可逆 的傷害[46,47]。
從本實驗結果證實，隨著 TBO 濃度越高，光動力殺菌效果越顯著(圖一)。
由圖二結果也觀察到，受到 PDI 處理的白色念珠菌生長曲線趨勢比起未經過 PDI 處理的其停留在 lag phase 的時間較長，且受到較強 PDI dose 所造成更大的 damage 程度，存活下來的菌體停留在 lag phase 的時間更長，顯示修復損傷的時 間越久，才開始進入 log phase 複製生長。而 Kato IT 等人在 2013 年所發表的文 獻中也指出 [48]，隨著照光劑量提高造成的更大程度的 damage，白色念珠菌停 留在 lag phase 的時間較長，才開始進入 log phase 複製生長。在本實驗結果也證 實隨著光感物質濃度提高也可以造成相似的結果。所以不管是照光劑量的提高或 是光感物質濃度提高皆能對白色念珠菌造成更大程度的 damage。先前許多研究 發現光動力殺菌對於革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌的綠膿桿 菌菌株，以及其臨床抗藥性菌株、真菌等微生物都具有殺菌效果[47,49,50]。但 是 PDI 是透過什麼訊息傳遞機制達到對白色念珠菌產生殺菌效果目前並不清楚，
過去文獻發現透過共軛焦螢光顯微鏡觀察以陽離子 porphyrin 為光感物質進行的 PDI 可以對白色念珠菌的細胞膜造成破壞[51]，因此日後實驗可以藉由經 PDI 後 觀察與白色念珠菌存活等相關重要基因表現是否會下降，探討 PDI 影響白色念 珠菌的相關訊息路徑的機制。
4.2 Fluconazole 增強光動力殺菌的效果探討
由實驗結果證實(圖三、圖五)Fluconazole 能增強光動殺菌對白色念珠菌的殺 菌效果，降低藥物使用劑量。此現象有可能是因為光動力作用後存活下來的菌數
比較少而只需要少量藥物濃度就可以達到殺菌效果的緣故，為了要釐清此現象，
我們將不同菌數的白色念珠菌與不同濃度的 Fluconazole 共同培養 24 小時，不論 Fluconazole 濃度改變或是白色念珠菌起始菌數的改變，皆無明顯影響白色念珠 菌存活菌數(圖四)。這些結果顯示，當菌體先進行光動力作用使產生傷害後，加 入 Fluconazole 有助於增強光動力作用的殺菌能力；而且菌體受到光動力傷害程 度越大，Fluconazole 所需的濃度越低，就能達到完全殺菌效果。若是改成先處 理 Fluconazole 再進行 PDI，實驗結果證實，先進行 PDI 後，再處理 Fluconazole 的作用效果較好(圖六)，推測可能原因為 PDI 會對白色念珠菌造成傷害，此時直 接再加入 Fluconazole，會使得這些受傷的菌體來不及修復而死亡，因此先進行 PDI 再處理藥物的作用效果比先處理藥物的效果顯著。
過去研究證實光動力殺菌有許多優點，包括菌體較不容易產生抗性、對宿主 影響小、誘發突變風險低以及比起藥物治療，能立即快速殺死微生物等。然而，
由於光源的穿透能力有所限制，使得存在於深層組織中的病原菌有機會在治療之 後存活下來，對病患健康造成威脅。目前臨床上常使用 Fluconazole 治療白色念 珠菌的感染，是一種抑菌性質的藥物[52]，但是在長期使用下，近年來抗藥性的 問題日益嚴重，發現念珠菌屬對於 Fluconazole 產生抗藥性有增加趨勢[53]，造成 臨床上的用藥劑量增加，因此發展新的方法治療念珠菌感染相當重要，以解決光 動殺菌及抗真菌藥物所面臨的問題。
為了進一步分析白色念珠菌經由光動力作用破壞後，需要多久時間讓受損的 菌體進行修復，加入 Fluconazole 會無法達到良好的殺菌效果，實驗結果證實，
先進行光動力作用後立即加入 Fluconazole、與光動力作用後培養第 2 小時再加 入 Fluconazole 培養 24 小時，都可以達到完全殺菌的效果。但當光動力作用後培 養至第 4 小時再加入 Fluconazole，則無法達到完全殺菌的結果(圖七)，而且越晚 加入 Fluconazole 培養，其殺菌效果有降低的趨勢；而未經過光動力作用的組別，
菌數並不會受到 Fluconazole 的作用而改變。推測菌體經過光動力作用破壞後，
如果給予一定時間讓受損的菌體進行修復，PDI 結合 Fluconazole 則無法達到良 好的殺菌效果。由於 Fluconazole 的作用機制是抑制合成麥角固醇的酵素，導致 無法合成細胞膜成分—麥角固醇，因此未來實驗可以探討經 PDI 後再加入 Fluconazole 增強殺菌效果，牽涉的可能相關訊息路徑機制，是否合成麥角固醇 的基因表現會受到兩者結合影響。
4.3 光動力殺菌結合 Posaconazole 對白色念珠菌殺菌效果的探討
在本研究選用 Posaconazole，主要是因為 Posaconazole 是臨床上治療念珠菌 感染的第二線用藥， 屬於新一代的 azole 類藥物[54]，藉此探討 PDI 結合 Posaconazole 是 否 也 會 增 強 殺 菌 效 果 ， 實 驗 結 果 證 實 進 行 PDI 後 再 結 合 Posaconazole 有達到增強殺菌效果，而且白色念珠菌受到光動力傷害程度越大，
Posaconazole 達到完全殺菌效果所需的濃度就越低(圖八)。因此此現象可能普遍 存在於 azole 類的藥物，至於其他類型的抗真菌藥物是否也會有這樣的現象，則 在未來可以再進一步透過 PDI 結合抗真菌藥物對白色念珠菌殺菌效果去證實。
4.4 光動力殺菌結合 Fluconazole 對白色念珠菌抗藥性菌株的影響
實驗結果證實，PDI 結合 azole 藥物，確實有提高抗藥性菌株對藥物的敏感 性(圖九、圖十)，可以看到在標準菌株只需要 TBO 0.1 mM 結合 0.25 g/ml Fluconazole 就能達到全殺效果，然而抗藥性菌株在 Fluconazole 0.25 g/ml 的濃 度下，則需要 TBO 0.4 mM 才能達到同樣的全殺效果，也可以看到相同濃度的 TBO 結合 Fluconazole 對於抗藥性菌株的殺菌效果相較於標準菌株低。這與過去 文獻發現菌株對於 Fluconazole 產生抗藥性原因可能是藥物輸送幫浦基因過度表 現有關[44]，可將外來物質快速排出菌體外，而 PDI 可能破壞了幫浦活性，而抗 藥性菌株在相同的 TBO 條件下受到光動力傷害程度較標準菌株小。因此藥物被 快 速 排 出 ， 導 致 需 要 以 較 高 濃 度 的 光 感 物 質 達 到 較 高 的 傷 害 ， 才 能 降 低 Fluconazole 使用劑量。
院內感染是現今醫療方面相當棘手的問題，且隨著抗菌藥物的廣泛使用，使
