4.1 光動力殺菌對於白色念珠菌的殺菌效果探討
光動力殺菌是指將光動力作用在微生物上，達到殺菌的效果，其過程是多重 作用目標，透過特定波長光照射激發後，產生單態氧及自由基對菌體造成不可逆 的傷害[46,47]。
從本實驗結果證實，隨著 TBO 濃度越高，光動力殺菌效果越顯著(圖一)。
由圖二結果也觀察到，受到 PDI 處理的白色念珠菌生長曲線趨勢比起未經過 PDI 處理的其停留在 lag phase 的時間較長，且受到較強 PDI dose 所造成更大的 damage 程度，存活下來的菌體停留在 lag phase 的時間更長，顯示修復損傷的時 間越久，才開始進入 log phase 複製生長。而 Kato IT 等人在 2013 年所發表的文 獻中也指出 [48]，隨著照光劑量提高造成的更大程度的 damage，白色念珠菌停 留在 lag phase 的時間較長，才開始進入 log phase 複製生長。在本實驗結果也證 實隨著光感物質濃度提高也可以造成相似的結果。所以不管是照光劑量的提高或 是光感物質濃度提高皆能對白色念珠菌造成更大程度的 damage。先前許多研究 發現光動力殺菌對於革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌的綠膿桿 菌菌株，以及其臨床抗藥性菌株、真菌等微生物都具有殺菌效果[47,49,50]。但 是 PDI 是透過什麼訊息傳遞機制達到對白色念珠菌產生殺菌效果目前並不清楚，
過去文獻發現透過共軛焦螢光顯微鏡觀察以陽離子 porphyrin 為光感物質進行的 PDI 可以對白色念珠菌的細胞膜造成破壞[51]，因此日後實驗可以藉由經 PDI 後 觀察與白色念珠菌存活等相關重要基因表現是否會下降，探討 PDI 影響白色念 珠菌的相關訊息路徑的機制。
4.2 Fluconazole 增強光動力殺菌的效果探討
由實驗結果證實(圖三、圖五)Fluconazole 能增強光動殺菌對白色念珠菌的殺 菌效果，降低藥物使用劑量。此現象有可能是因為光動力作用後存活下來的菌數
比較少而只需要少量藥物濃度就可以達到殺菌效果的緣故，為了要釐清此現象，
我們將不同菌數的白色念珠菌與不同濃度的 Fluconazole 共同培養 24 小時，不論 Fluconazole 濃度改變或是白色念珠菌起始菌數的改變，皆無明顯影響白色念珠 菌存活菌數(圖四)。這些結果顯示，當菌體先進行光動力作用使產生傷害後，加 入 Fluconazole 有助於增強光動力作用的殺菌能力；而且菌體受到光動力傷害程 度越大，Fluconazole 所需的濃度越低，就能達到完全殺菌效果。若是改成先處 理 Fluconazole 再進行 PDI，實驗結果證實，先進行 PDI 後，再處理 Fluconazole 的作用效果較好(圖六)，推測可能原因為 PDI 會對白色念珠菌造成傷害，此時直 接再加入 Fluconazole，會使得這些受傷的菌體來不及修復而死亡，因此先進行 PDI 再處理藥物的作用效果比先處理藥物的效果顯著。
過去研究證實光動力殺菌有許多優點，包括菌體較不容易產生抗性、對宿主 影響小、誘發突變風險低以及比起藥物治療，能立即快速殺死微生物等。然而，
由於光源的穿透能力有所限制，使得存在於深層組織中的病原菌有機會在治療之 後存活下來，對病患健康造成威脅。目前臨床上常使用 Fluconazole 治療白色念 珠菌的感染，是一種抑菌性質的藥物[52]，但是在長期使用下，近年來抗藥性的 問題日益嚴重，發現念珠菌屬對於 Fluconazole 產生抗藥性有增加趨勢[53]，造成 臨床上的用藥劑量增加，因此發展新的方法治療念珠菌感染相當重要，以解決光 動殺菌及抗真菌藥物所面臨的問題。
為了進一步分析白色念珠菌經由光動力作用破壞後，需要多久時間讓受損的 菌體進行修復，加入 Fluconazole 會無法達到良好的殺菌效果，實驗結果證實，
先進行光動力作用後立即加入 Fluconazole、與光動力作用後培養第 2 小時再加 入 Fluconazole 培養 24 小時，都可以達到完全殺菌的效果。但當光動力作用後培 養至第 4 小時再加入 Fluconazole，則無法達到完全殺菌的結果(圖七)，而且越晚 加入 Fluconazole 培養，其殺菌效果有降低的趨勢；而未經過光動力作用的組別，
菌數並不會受到 Fluconazole 的作用而改變。推測菌體經過光動力作用破壞後，
如果給予一定時間讓受損的菌體進行修復，PDI 結合 Fluconazole 則無法達到良 好的殺菌效果。由於 Fluconazole 的作用機制是抑制合成麥角固醇的酵素，導致 無法合成細胞膜成分—麥角固醇，因此未來實驗可以探討經 PDI 後再加入 Fluconazole 增強殺菌效果，牽涉的可能相關訊息路徑機制，是否合成麥角固醇 的基因表現會受到兩者結合影響。
4.3 光動力殺菌結合 Posaconazole 對白色念珠菌殺菌效果的探討
在本研究選用 Posaconazole，主要是因為 Posaconazole 是臨床上治療念珠菌 感染的第二線用藥， 屬於新一代的 azole 類藥物[54]，藉此探討 PDI 結合 Posaconazole 是 否 也 會 增 強 殺 菌 效 果 ， 實 驗 結 果 證 實 進 行 PDI 後 再 結 合 Posaconazole 有達到增強殺菌效果，而且白色念珠菌受到光動力傷害程度越大，
Posaconazole 達到完全殺菌效果所需的濃度就越低(圖八)。因此此現象可能普遍 存在於 azole 類的藥物，至於其他類型的抗真菌藥物是否也會有這樣的現象，則 在未來可以再進一步透過 PDI 結合抗真菌藥物對白色念珠菌殺菌效果去證實。
4.4 光動力殺菌結合 Fluconazole 對白色念珠菌抗藥性菌株的影響
實驗結果證實，PDI 結合 azole 藥物，確實有提高抗藥性菌株對藥物的敏感 性(圖九、圖十)，可以看到在標準菌株只需要 TBO 0.1 mM 結合 0.25 g/ml Fluconazole 就能達到全殺效果，然而抗藥性菌株在 Fluconazole 0.25 g/ml 的濃 度下，則需要 TBO 0.4 mM 才能達到同樣的全殺效果，也可以看到相同濃度的 TBO 結合 Fluconazole 對於抗藥性菌株的殺菌效果相較於標準菌株低。這與過去 文獻發現菌株對於 Fluconazole 產生抗藥性原因可能是藥物輸送幫浦基因過度表 現有關[44]，可將外來物質快速排出菌體外，而 PDI 可能破壞了幫浦活性，而抗 藥性菌株在相同的 TBO 條件下受到光動力傷害程度較標準菌株小。因此藥物被 快 速 排 出 ， 導 致 需 要 以 較 高 濃 度 的 光 感 物 質 達 到 較 高 的 傷 害 ， 才 能 降 低 Fluconazole 使用劑量。
院內感染是現今醫療方面相當棘手的問題，且隨著抗菌藥物的廣泛使用，使
得院內感染的菌種出現抗藥性問題，尤其白色念珠菌也出現許多抗藥性菌株[55]，
因此若能將 PDI 結合 Fluconazole 應用於治療抗藥性菌株上，使其成為不同於抗 真菌藥物治療的方法，對病患會是一大幫助。未來可以朝向探討藥物輸送幫浦相 關基因 CDR1 和 CDR2 或 CaMDR1 在 PDI 結合 azole 藥物後表現量是否會下降，
因而證實幫浦活性受到影響，藥物不會被快速排出，可以達到殺菌效果。
4.5 光動力殺菌結合 Fluconazole 對白色念珠菌生物膜的殺菌效果探 討
在微生物感染人類的疾病中，生物膜型式的感染占相當大部分，許多研究已 證實生物膜的形成使白色念珠菌對於許多抗真菌藥物有較高的抗藥性，增加臨床 上治療的困難度[56,57]。
由實驗結果得知(圖十一)，發現要對白色念珠菌生物膜造成一定程度傷害，
所需要的光感物質濃度比懸浮菌體高出許多，約高出 10 倍。然而，在實驗結果 圖十二中，發現 Fluconazole 無法增強 PDI 對於白色念珠菌生物膜的殺菌效果。
這一結果可能與下列兩個原因有關。
第一個原因可能和生物膜的胞外聚合物有關，可能是由於 1. PDI 無法完全 破壞胞外聚合物，或是 2. 胞外聚合物受到破壞但無破壞在生物膜內部的細胞，
而導致實驗不符合預期結果。生物膜外層是由細胞所分泌多聚醣的胞外聚合物所 組成，胞外聚合物提供了生物膜物理性的屏障，這造成抗真菌藥物難以滲透、進 入到生物膜深處，又或者是胞外聚合物上的部分負電荷會和一些具有正電荷的藥 物進行結合，治療的效果受影響，因此胞外聚合物對於白色念珠菌生物膜的高抗 藥性現象，扮演重要的角色[58]。過去文獻也發現到，光動力作用所產生的單態 氧或自由基等氧化物可以對生物膜外層的胞外聚合物進行非專一性氧化攻擊，造 成胞外聚合物受損[59]，因而光動力作用能增加藥物與菌體結合的機會。
因此可以嘗試利用觀察生物膜經過 PDI 結合 Fluconazole 處理後的 MIC 值是 否和未經過任何處理的控制組相同，相同則代表菌體無受到 PDI 影響；又或者
是將經過 PDI 結合 Fluconazole 處理後生物膜打散後做生長曲線是否和未經過任 何處理的控制組相同，觀察生物膜內的細胞是否受到 PDI 影響。
第二個原因則可能和 Fluconazole 藥物本身的性質有關，前人的許多文獻發 現到白色念珠菌生物膜對於 Fluconazole 有較高的抗藥性[60,61]。所以若是 PDI 結合 Fluconazole 對於白色念珠菌的懸浮菌體和生物膜型式都能產生殺菌效果，
降低藥物使用的濃度，並提升殺菌效果，那在臨床治療上將會是非常具有實用價 值。
針對上述可能的原因，目前我們嘗試解決的是將 PDI 結合其他屬於殺菌性 質的抗真菌藥物，例如：Caspofungin，其作用機制是抑制真菌細胞壁主要成份 β-(1,3)- D-glucan 的合成酶，使無法合成出β-(1,3)- D-glucan，造成細胞壁結構 受到破壞，細胞壁破裂因而菌體死亡，也有文獻指出 Caspofungin 對於白色念珠 菌生物膜具有良好的作用效果[62,63]，探討看是否是由於藥物本身性質有關。或 者透過掃描式雷射共軛焦顯微鏡觀察胞外聚合物破壞程度，也可以增加光照劑量 提升光動力作用效果將胞外聚合物破壞完整，增加藥物與菌體結合機會，因此未 來計畫將朝這 2 個方面去探討，找出可能原因為何。
4.6 光動力殺菌和 Fluconazole 交互作用的探討
近幾年來念珠菌屬的感染發生率有逐年遞增趨勢，且一直是院內感染常見菌 種的第一名，尤其又以白色念珠菌最常見[6]。這和藥物的頻繁使用有相當大關 係，導致許多菌株出現抗藥性，許多學者也開始找尋新的治療方法，但開發新的
近幾年來念珠菌屬的感染發生率有逐年遞增趨勢，且一直是院內感染常見菌 種的第一名，尤其又以白色念珠菌最常見[6]。這和藥物的頻繁使用有相當大關 係，導致許多菌株出現抗藥性，許多學者也開始找尋新的治療方法，但開發新的