材料與方法

2.2.1 材料來源

TEMPase Hot Start DNA Polymerase 購自 Ampliqon (Denmark)；

Lightcycler Capillaries (20µl)購自 Roche Applied Science (Germany)；

LCGreen I Gene Scanning Reagents 購自 Idaho technology (Utah, USA)；

M-MLV Reverse Transcriptase 購自 Invitrogen (Carlsbad, CA)；RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor 購自 Invitrogen (Carlsbad, CA)；Gel / PCR DNA Fragments Extraction Kit 購自 Geneaid (Taiwan R.O.C.)；

QIAquick PCR purification kit 購自 QIAGEN (Valencia, CA)；QIAquick Gel Extraction kit 購自 QIAGEN (Valencia, CA)；QIAGEN one step RT-PCR kit 購自QIAGEN (Valencia, CA)

2.2.2 序列比對與引子的設計

從 NCBI 的資料庫當中，收集自 2004 至 2007 年 A 型流行性感冒病 毒株H1、H3、H5 的 M 基因序列，利用 Jemboss 軟體系統將所收集的序 列作多重序列比對分析(multiple sequence alignment)，選取比對結果中具 高度保留性的區域，並且比較此區域中序列是否可區分出不同的血清亞 型。最後選取序列 238-417 作為區分血清亞型的 PCR 區域。設計引子為 IFU-F: 5’ GCGAGGACTGCAGCGTAGAC ’3 ， 以 及 IFU-R: 5’

TGAGACCCATGCAACTGGCAAG’ 3，PCR 產物大小應為 179 bp。

2.2.3 萃取病毒 RNA

取 140 µl 病毒液用 QIAamp® Viral RNA Mini Kit 抽取病毒 RNA，

試劑組中試劑AVL 可分離出病毒 RNA，再利用 carrier RNA 將病毒 RNA 沾附於過濾膜上，經過清洗的動作洗去其餘的雜質，最後溶二次水50 µl。

2.2.4 RT-PCR

2.2.4.1 配製反轉錄反應所需之試劑

每個反應包含5X RT buffer，20 mM dNTP，2.5 µM IFU-F 引子，20 U RNaseOUT，100 U M-MLV RTase，及 2 µl 病毒 RNA，補二次水至 20 µl，

於42 ℃水浴槽反應 1 小時。反應完成後，以 QIAquick PCR purification kit 去除多餘的引子，試劑組中試劑 PB 可抓住反轉錄產物沾附於過濾膜上，

經過試劑PE 洗去殘留雜質之後，溶二次水 20 µl。

2.2.4.2 配製聚合酶連鎖反應所需之試劑

每個反應包含10X Reaction buffer，10 mM dNTP，2.5 µM 引子 IFU-F 及2.5 µM IFU-R，2.5 U YEA DNA polymerase 及 5 µl cDNA，補水至 25 µl，

以94 ℃反應 5 分鐘，接著 94 ℃，30 秒，55 ℃，30 秒，72 ℃，30 秒進 行35 次循環反應，再以 72 ℃反應 7 分鐘。最後配置 3 % agarose gel，將 PCR 產物跑膠確定 PCR 產物的大小。

2.2.5 LightCycler Real-time PCR

選用 Roche 所研發的 LightCycler Real Time PCR system 進行及時偵 測聚合酶連鎖反應，可即時偵測反應產物的螢光量，所使用的染劑為 LCGreen Melting Dye，具有嵌入雙股 DNA 兩個配對核酸之間的特性，相 較於嵌入雙股DNA 小螺旋(minor groove)中的 SYBR Green Dye，LCGreen Melting Dye 具有較高的敏感性。配製即時反應聚合酶連鎖反應所需之試 劑，每個反應包含10X Reaction Buffer (含 20 mM 鎂離子)，2 mM dNTP，

2.5 mg / ml BSA，10X LC green® I melting dye，5 µM IFU-F / R 引子，2.5 U TEMPase Hot Strat DNA Polymerase，及 2 µl cDNA (或 1 pg 標準質體)，

最後補水至體積10 µl；Real-time PCR 反應條件為 94 ℃反應 10 分鐘，再 以94 ℃，10 秒，55 ℃，15 秒，72 ℃，30 秒，進行 40 個循環反應，最 後從50 ℃升溫至 95 ℃偵測反應產物的熔點曲線。

2.2.6 利用 High-Resolution-1 分析

設定 HR-1 分析的溫度範圍為 70~90 ℃，升溫的速率為 0.1 / sec℃ ， 固定冷卻的溫度為60 ℃。分析數據以溫度範圍分別為 77~78 ℃，87~88

℃，並以H1 標準質體混合 H1 標準質體所分析的曲線為分析依據，取 5 %

~ 20 %的螢光量作溫度的標準化。若與 H3 混合的檢體則須設定分析溫度 範圍為76~77 ℃，87~88 ℃，並以 H3 標準質體與 H3 標準質體混合所分

析出的曲線為分析依據取 5 % ~ 20 %的螢光量作溫度的標準化。進行 Difference plot 分析，以 H1 標準質體混合 H1 標準質體所分析的曲線為分 析依據，並且截取77~85 ℃為分析的溫度範圍。

2.2.7 Heteroduplex

紀錄 PCR 結果的 Ct 值以及 Rn 值，以總體積為 12 µl，Rn 值比例為 1 : 1 在 eppendorf 中混合，取 10 µl 混合後產物置入毛細管中，以溫度 95

℃，1 秒，40 ℃，10 秒，進行 10 個反應循環，再進行 HR-1 分析。

2.2.8 構築標準質體

2.2.8.1 H1、H3、H5 亞型的分型片段

將 H1、H3(A/Taiwan/482/2005)、H5(A/Hong Kong/156/1997)標準病 毒株 RNA 各取 1 µl 進行反轉錄作用及聚合酶連鎖反應做出分型特定片 段。反應完成後，將反應產物以3 % agarose gel 核酸電泳分離，利用 Gel / PCR DNA Fragments Extraction Kit 將 agarose 中的 PCR 產物純化出來，

溶二次水20 µl；

2.2.8.2 H7、H9 亞型的分型片段

合 成 H7 (A/Canada/rv504/2004 (H7N3)) 、 H9 (A/HK/2108/2003 (H9N2))M 基因的分型特定片段正負股。將合成的正負股各取 3 µg 加入 10X Reaction buffer，20 mM dNTP，2.5 U Taq polymerase，補二次水至體

積25 µl，反應條件為 94 ℃，30 秒，65 ℃，20 分鐘；將反應產物稀釋 100 倍，取1 µl 加入 10X Reaction buffer，10 mM dNTP，2.5 µM 引子 IFU-F 及2.5 µM IFU-R，2.5 U Taq polymerase，最後補二次水至體積為 25 µl，

以94 ℃，30 秒，55 ℃，30 秒，72 ℃，30 秒進行 35 次循環反應，再以 72 ℃反應 7 分鐘。反應完成後，將反應產物以 3 % agarose 核酸電泳分離，

利用Gel / PCR DNA Fragments Extraction Kit 將 agarose 中的 PCR 產物純 化出來，溶二次水20 µl。

2.2.8.3 合成各血清亞型的標準質體

取3 µl 純化產物與載體 pGEM T easy 進行質體選殖，將反應產物塗 佈於含有Ampicillin 50 µg / ml 的 LB agar plate 上，於 37 ℃培養箱中培養 16 至 18 小時後，挑單一菌落以 3 ml 含 100 µg / ml Ampicillin 的 LB broth 培養於37 ℃培養箱中，以 150 rpm 轉速培養 16 至 18 小時後用 High Speed Plasmid Mini Kit 抽取細菌質體 DNA。