討論

本實驗設計分型的引子於 MP 基因，此基因具有高度的保留性，文 獻中將H1N1、H3N2、H1N2、H2N2、H5N1 與 H9N2 的 MP 基因做序列 的比對，具有高於80 %的相同性 (Stone et al., 2004)，且分析 2004 至 2005 年感染到人類與禽鳥類H5N1 亞型病毒株的 HA 基因與 MP 基因，發現以 演化樹的方式運算，兩基因是共同演化的 (The World Health Organization Global Influenza Program Surveillance Network, 2005)，因此本實驗選取 MP 基因作為分型的目標基因。

在運用HR-1 軟體分析時，經過標準化分析之後所得之圖形或是經過 Difference Plot 分析之圖形皆可以區分出各血清亞型，但圖形的上升或下 降的幅度可能會因不同批次的實驗而有些微的改變，而經過 Derivative Plot 運算出來的圖形較具重複性，且在不同批次實驗之間的差異性為最 小，因此選用經過標準化分析後再利用Derivative Plot 運算出來的圖形作 為標準的區分模式。

根據文獻所述，利用晶片的方式，所能偵測到的最低數值約為0.7 ng (Townsend et al., 2006)，換算成病毒數量約為 10⁸個病毒；而利用 PCR 產 物大小區分血清亞型的方式，因不同的實驗方式而其能偵測到的病毒數 量約為10²至10⁵個病毒 (Chi et al., 2007; Wei et al., 2006; Stone et al., 2004)；而本實驗能夠準確地檢測到 2.8×10²個病毒，敏感性可達到目前已

發展出的檢驗方式的最小值。

臨床檢體的檢驗通常需要在短時間內得到結果，文獻中指出若使用 micorarray 的方式，約需要 12 個小時判斷其亞型 (Townsend et al., 2006)；

而使用設計於 M 基因上的 probe 所分析出來的熔點曲線區分亞型的方式 約需要6 個小時完成判讀 (Stone et al., 2004)；設計引子於 H5N1 血清亞 型的HA 與 NA 基因，經過一般 PCR 反應，將 PCR 產物跑膠確定亞型的 方式約需要5 個小時確定亞型 (Wei et al., 2006)；而本實驗所需要的時間 僅約需要4 小時就可以判讀完成結果，相較於其他的方式，HR-1 是較為 方便且快速的方式。

分析檢體的序列發現，10 個 H1 亞型檢體中有 2 個檢體具有 1 個核 苷酸序列突變，其與 H1 亞型標準質體混合之後，就可以明顯地區分出 來，此結果顯示，1 個以上的核苷酸序列改變就可以用 HR-1 分析出來。

而11 個 H3 亞型檢體中有 2 個檢體的序列有改變，分別是檢體 2004-R1048 具有 1 個核苷酸改變，檢體 2007-T54 具有 2 個核苷酸改變，但在與 H1 亞型標準質體混合的圖形當中，檢體 2004-R1048 的圖形與 H3 亞型標準 質體相差較大，而檢體 2007-T54 的圖形能與 H3 亞型標準質體相合。觀 察 H3 亞型標準質體與此 2 檢體的序列，H3 亞型標準質體的序列為 6 個 G 和 C 所組成的序列，是為緊密的 3 氫鍵結合的區域，而 2004-R1048 所 突變的核苷酸為C 轉變成 T，接著 5 個 G 和 C 所組成的核苷酸序列，推

測緊密的3 氫鍵鍵結破壞掉一個，進行熔點曲線分析時，檢體 2004-R1048 的PCR 產物在溫度比較低的地方就被解離開來，而造成圖形的不同。而 檢體2007-T54 的序列雖然具有 2 個核苷酸的突變，但鄰近的核苷酸未有 富含 G 或 C 的序列，因此推測此為檢體與 H3 亞型標準質體的差異不大 的原因。