結果

2.3.1 建立標準病毒株圖形

將 H1、H3、H5、H7、H9 各血清亞型的標準質體用 Lightcycler 儀器 複製出分型片段，運用HR-1 儀器分析產物的熔點曲線，經過標準化分析 發現各血清亞型的螢光量皆約在 82 ℃下降，無法直接用 PCR 的產物將 此5 種血清亞型區分開(如圖二(A))；在標準化分析後用 Derivative Plot 方 式分析，各血清亞型所產生的圖形在82 ℃至 84 ℃出現一個平滑的山峰 狀曲線，亦無法用Derivative Plot 分析法來區分(如圖二(B))。

因此，以H1 標準質體的 PCR 產物作參考產物與各血清亞型的 PCR 產物混合，藉由高低溫度變化所產生的異結構物的熔點曲線的改變來區 分不同的血清亞型。所產生的產物同樣經由HR-1 儀器作分析，經過標準 化分析與Derivative Plot 分析所得圖形如圖三(A)，結果在 Derivative Plot 分析中顯示經過混合之後的H1 標準質體在 82 ℃至 84 ℃呈現平滑的山峰 狀曲線；H3 標準質體的曲線會在 78 ℃略為上升，至 78.5 ℃下降，79.5 ℃ 之後開始平滑上升，至83 ℃的斜率增加呈現山峰狀曲線；而在 H7 的標 準質體曲線在79 ℃有一小突起，之後呈現山峰狀曲線，且在山峰尖端的 部分會呈現右斜切的特色；H5 與 H9 的標準質體呈現相同的圖形，在 82

℃至84 ℃之間會有兩波峰出現，不同於其他的血清亞型，但兩者無法用 此圖形區分開(如圖三(A))。將此實驗重複操作了數次皆得到相同的結

果，因此，證實所建構的標準質體能夠利用與H1 產物混合的方式區分出 H1、H3、H7 與 H5、H9 血清亞型(如圖三(B))。

2.3.2 建立完整分型流程

H5 與 H9 兩個血清亞型與 H1 標準質體混合之後呈現相同的雙波峰 圖形，無法用H1 混合的方式區分，所以再用 H5 標準質體去混合，異結 構物的曲線會與同結構物所產生的曲線不同；H9 標準質體與 H5 標準質 體混合之後產生的異結構物，會呈現兩個波峰，分別在81.5 ℃與 83 ℃，

且在81.5 ℃的波峰比 83 ℃的波峰小，為 H9 的特徵(如圖三(C))。

為避免不同序列的血清亞型產生相同的圖形，當某檢體用H1 標準質 體混合之後推測其所屬之血清亞型之後，應再用該血清亞型的標準質體 混合反應作確認，若為同一血清亞型，則為同結構物，所產生圖形為平 滑的山峰狀曲線，但若為異結構物，則圖形會有所改變。藉由上述的方 式建立了完整的區分血清亞型的流程(如圖四)。

2.3.3 偵測此檢驗方式的靈敏度

將 H3 的標準質體經過 10 倍的序列稀釋，換算成 copy number 為 2.8×10⁰至2.8×10⁸ copies，進行 real time PCR 反應，當 copy number 達到 2.8×10⁸時，僅需要約11.80 個循環就可以偵測到，而 copy number 降低到 28 個 copy 時的循環數約為 33.30，2.8 個 copies 的病毒數量仍然可以用 real

time PCR 的方式偵測出來(如圖五(A)(B)(C))。將這些 PCR 產物同樣與 H1 標準質體 PCR 產物混合之後用 HR-1 儀器分析 Derivative Plot，2.8×10³ 至 2.8×10⁸個 copies 所產生的圖形是相合的，2.8×10²個 copies 所產生的 圖形略為向右上偏，但H3 特有的勾狀特徵仍然非常明顯，但 28 個 copies 所產生的圖形在79 ℃所下降的幅度較小，且在 80 ℃上升的幅度較平(如 圖五(D))。因此，用這個檢驗方式約可以檢測到 2.8×10²個copies。

2.3.4 臨床檢體之檢驗

選取 2004 年至 2007 年台灣地區的 A 型流行性感冒病毒檢體，經過 萃取RNA、反轉錄反應與 real time PCR 反應，同樣與 H1 標準質體混合 後用HR-1 儀器分析，在 21 個檢體當中，檢驗出有 10 個檢體為 H1 亞型，

11 個檢體為 H3 亞型。在 10 個 H1 亞型的檢體中，2 個檢體的圖形與標 準 H1 圖形略為不同，分別為檢體 2004-4483 與 2004-7974，此 2 檢體在 81 ℃上升，82 ℃略為下降之後又在 83 ℃上升，形成一個略為凹陷的山 峰狀圖形(如圖六(A))；分析此 2 檢體的序列發現，在此段分型片段中，2 檢體皆具有1 個核苷酸的改變 (如圖六(E))。而 11 個 H3 亞型的檢體中，

1 個檢體(2004-R1048)的圖形與標準 H3 圖形不同，此檢體的圖形在 78.5

℃呈現略為下降的趨勢之後上升至81.5 ℃，接著斜率增加形成一個山峰 狀曲線(如圖六(A))，將此檢體與 H3 標準質體混合之後，在 81.6 ℃與 83 ℃

形成兩波峰曲線，與標準質體所產生的單一波峰不同如圖六(B)。將歸類 於 H3 亞型的檢體與 H3 標準質體混合，發現除了檢體 2004-R1048 的圖 形不同之外，還有檢體2007-T54 的圖形也與 H3 標準質體不同，在 81.8 ℃ 與83 ℃形成兩波峰曲線(如圖六(B))；將此 2 檢體分析序列之後發現在分 型片段中各有1 個及 2 個核苷酸的改變(如圖六(F))。

選 取 過 去 幾 年 所 用 之 疫 苗 病 毒 株 ， A/Beijing/262/95 ， A/New Caledonia/20/99，A/Panama/2007/99，A/Taiwan/1/86，A/Wellington/1/04 等五株，經由HR-1 儀器分析之後，A/Taiwan/1/86 在 81.2 ℃與 83 ℃形成 兩波峰曲線(如圖六(C))，分析其序列發現與 H1 亞型的序列相差 3 個核苷 酸(如圖六(E))。而另外 4 株疫苗病毒株所表現之圖形與 H3 標準質體所產 生 的 圖 形 相 似( 如 圖 六 (E)) ， 因 此 再 用 H3 標 準 質 體 混 合 ， 發 現 A/Wellington/1/04 與標準質體的圖形相同，而其他三株疫苗病毒株得到的 圖形與H3 標準質體圖形不同，其在 76.5 ℃上升至 77.8 ℃下降，接著在 78.5 ℃開始平滑上升至 81 ℃斜率改變，形成一山峰狀圖形(如圖六(D))；

分析此 4 株疫苗病毒株序列，發現 A/Wellington/1/04 的序列與標準質體 相同，而其他3 株疫苗病毒株序列與 H3 亞型相差 9 個核苷酸。

綜合病毒檢體與疫苗病毒株的檢驗結果發現，利用 HR-1 儀器分析的 方法可以將各血清亞型區分出來，若有核苷酸的突變也可以利用與相同 血清亞型的標準質體混合的方式測出。