緒論

A 型流行性感冒病毒依據病毒表面抗原 HA 及 NA 區分其血清型，目 前已知有16 種 HA 及 9 種 NA，較常感染到人類的血清亞型為: H1、H2、

H3 及 N1、N2，其他如 H5、H7、H9 為較常出現於禽鳥類的病毒 (Wright et al., 2001; Fouchier et al., 2005)。流行性感冒病毒為了逃避宿主的免疫系

統而常發生突變，其中以antigenic drift 的突變方式較為常見，病毒不斷 地進行基因點突變，累積大量的點突變而形成胺基酸的改變，所形成的 突變抗原可再感染宿主細胞，這樣的病毒容易引起地區性的流行；而較 為嚴重的突變稱為 antigenic shift，原本為禽鳥類的高病原性病毒因為接 受器的不同而不會感染至人類細胞，但是如果病毒經過中間宿主重新組 合基因 (reassortment)或病毒不經過中間宿主而自行進行大幅度的突變而 形成能感染人類的高病原性病毒，容易因免疫系統不認得此抗原而造成 大規模的流行，引起人類的疾病及死亡，西元1997 年在香港感染的 H5N1 病毒就為此例。因此，當季節進入流行性感冒病毒流行期時，快速診斷 出所感染的病毒為何種血清型是重要的。

目前臨床所使用於診斷流行性感冒病毒的方式可分為四大類: 分離 病毒，偵測病毒蛋白，偵測病毒核酸與血清學試驗；其中以細胞培養分

離病毒的方式最具敏感性，而其他三種方法的專一性較佳，為避免檢驗 的偽陽性與偽陰性，通常以合併兩種以上方式來偵測(Cox et al., 1999)。

而在區分血清亞型的部分，目前各實驗室所發展出來的方式大致上 可以分為兩類，第一類為PCR 的方式，針對各血清亞型的 HA 基因設計 具專一性的引子，在藉由 PCR 反應之後的產物大小來區分血清亞型(Chi et al., 2007; Wei et al., 2006)；或在 MP 基因上設計引子與探針，經過 Real

time PCR 方式放大分型片段之後，偵測其熔點曲線，再依據不同的血清 亞型擁有不同的熔點溫度來區分(Stone et al., 2004)。第二類為 microarray 的方式，在晶片上點上分型的序列片段，將檢體經過RT-PCR 後與帶有螢 光標記的特定片段反應，去除不具專一性結合之後再與晶片反應，最後R 進行呈色反應，判斷檢體之亞型(Townsend et al., 2006)。

但上述之方式，有些方式較為繁複，不適用於臨床上，有些較為昂 貴，或者敏感度不佳等原因，因此，本研究欲發展一套能快速且準確偵 測出病毒血清型的分子檢驗方式。

本研究中使用HR-1 儀器可直接分析 Lightcycler real time PCR 儀器所 使用的毛細管中的PCR 產物，其設備為每次偵測 1 根毛細管，可偵測的 體積範圍為5 µl ~ 20 µl，其中以 10 µl 的體積較為常用；若儀器的升溫速 率調整為0.3 /sec℃ ，只需要1 個小時就可以偵測 40-45 個檢體，且在分 析軟體界面上，一次可以分析 32 個檢體數量 (Idaho technology, Inc.

2003)。PCR 產物所產生的同結構物 (homoduplex)可經過高低溫循環反應 形成異結構物(heteroduplex)，而異結構物所產生的熔點曲線會與同結構 物不同，利用此原理可區分出不同的基因序列 (Liew et al., 2004)。許多 文獻利用 HR-1 可以區分單一核苷酸改變的原理來偵測基因的單核苷酸 多型態 (single nucleotide polymorphism, SNP) (Reed et al., 2004)，Zhou 等 人區分人類的HLA 的基因型以利血液幹細胞移植前的基因型配對 (Zhou et al., 2004)；Cheng 等人利用此原理區分 25 種臨床上重要細菌，幫助臨

床上的快速診斷、病人的抗生素使用等 (Cheng et al., 2006)。

本研究選取流行性感冒病毒基因中具高度保留性及演化性的M 基因 作為區分血清亞型的目標基因 (Ito et al., 1991; Reid et al., 2002)。實驗材 料以 2005 年台灣地區流行病毒株 H1 和 H3，以及 1997 年於香港爆發的 H5N1 病毒作為標準序列，用 Lightcycler Real time PCR 儀器複製病毒基 因的特定高度保留區域，並且使用High Resolution I (HR-1)儀器來檢驗臨 床檢體的血清型。