第三章 探討細胞中 Disabled2 蛋白參與流行性感冒病毒進行吞噬作用的
3.3.3 用免疫螢光染色法偵測病毒於接觸細胞後存在的位置，並
毒 RNA 的量
將 A549 細胞分於 3.5 公分 dish 中，分別感染流行性感冒病毒 (MOI
= 3)，將一盤細胞放置於 4 ℃當中，控制病毒不進入細胞，於 1 個小時後 收取細胞RNA 及做免疫螢光染色；其餘細胞放置一般的培養箱中培養，
分別於培養1、2、4、6、8、12 小時收取細胞 RNA，並且做免疫螢光染 色。
利用免疫螢光染色法及共軛膠顯微鏡觀察的結果發現病毒在 4 ℃培 養 1 個小時後，病毒位於細胞膜上，而一般培養箱中培養的細胞，在細 胞質中發現病毒顆粒的存在，而培養 2 個小時的細胞，在細胞質中有大 量的病毒顆粒；在培養 4 個小時的時間點，病毒進入到細胞核做複製及 轉錄的動作；而 6 個小時以後開始出核，擴散到細胞質及細胞膜上，準
備釋放出病毒顆粒 (如圖八)。
在細胞 RNA 的部分，比較各個時間點 (2、4、6、8 小時)流行性感 冒病毒的 RNA 量與細胞 β-actin 的比值，發現病毒於進入細胞後，隨著 時間的增加，細胞中的病毒的RNA 量也逐漸地增加 (如圖九)。
3.4 討論
目前病毒斑分析法觀察病毒產量實驗中，所需的病毒培養時間為 48 小時，若抑制或增加了吞噬作用的進行，很有可能會因長時間的培養而 看不出病毒數量的差別，所以，未來可收經過轉染試驗改變Dab2 蛋白表 現量後感染病毒的細胞，藉由免疫螢光染色法觀察病毒顆粒在不同時間 點所在的位置是否受Dab2 蛋白表現量改變的影響。
在抑制 Dab2 表現的實驗中發現，當轉染 Dab2 的 RNAi 時會抑制 Dab2 表現，同時抑制病毒的產生，而只轉染 pU6 質體時，也會抑制病毒斑的 產生，推測質體 pU6 可能就會影響病毒，若改變表現載體，有可能可以 繼續探討Dab2 在吞噬作用所扮演的角色。
而在大量表現 Dab2 蛋白的實驗中的西方墨點法結果看到，轉染質體 後12 小時會大量表現，但是到了 24 小時 Dab2 的表現量就明顯地降低，
但表現量開始降低的時間點未能從這個實驗結果看出，因此不能確定 Dab2 蛋白是否影響細胞吞噬作用；未來可以偵測轉染質體後 12 小時至 24 小時之間的 Dab2 蛋白表現量，以確定在達到表現量最大值時感染病 毒是否恰當。
3.5 結論
本實驗利用免疫螢光染色法偵測流行性感冒病毒約於 1~2 小時左右 出現於細胞質，4~6 小時進入細胞核，因此推測病毒感染後約在 4~6 小時 以前進行吞噬作用。另外感染改變Dab2 蛋白表現量的細胞，以病毒斑分 析法觀察，未發現病毒斑產生量的改變。目前觀察到的結果無法推測Dab2 蛋白是否影響流行性感冒病毒進行吞噬作用，進一步的研究仍在進行中。
圖表
圖一 分型引子的設計
將 H1、H3、H5、H7 與 H9 的 MP 基因序列做多重序列分析，選取較具 保留性的區域設計區分血清亞型的引子。最後將引子設計於279-417 核苷 酸上，如圖中劃底線區域。
A.
血清亞型所得的圖形會相合；(B)經由標準化運算與 Derivative Plot 運算 之後所得的圖形，各血清亞型皆在83 ℃產生一山峰狀圖形；(C)取各血清A.
圖三 建立各血清亞型之標準圖形
直 接 分 析 PCR 產物無法區分各血清亞型，因此將 PCR 產 物 經 過 heteroduplex 的高低溫反應，再經過 HR-1 分析。(A)(左)將各血清亞型的 PCR 產物與 H1 亞型標準質體混合之後所得經過標準化運算結果。(右)經 過標準化與Derivative Plot 運算，可將各血清亞型區分出，但 H5 亞型與 H9 亞型的圖形十分相近，無法藉由這個方法區分。(B)重複 5 次將各血清 亞型與 H1 亞型標準質體混合，得到各血清亞型之標準圖形。(C)因 H5 與H9 亞型無法區分，因此利用與 H5 亞型混合區分。
圖四 建立標準血清亞型區分流程
未知的檢體皆經由H1 亞型的標準質體混合進行初步區分，歸類檢體為何 種亞型之後，再利用該亞型之標準質體混合，就可得知該檢體之亞型，
並且可以檢驗檢體的序列是否與標準質體相同。
Unknown subtype of influenza A virus
HR-1 analysis HD / H1
H1
HD / H3 H3 Confirmed test
HD / H7 H7 Confirmed test
H5
H9 HD / H5
H5
HD / H9 H9 Confirmed test
A.
log (copy number/2.8)
2 3 4 5 7 8
0 1 6 9
179 bp
108 106 104 102 100 107 105 103 101 NTC
Copy number (×2.8)
圖五 偵測此檢驗方法之敏感度
將H3 亞型標準質體 10 倍序列稀釋後經過 real time PCR 反應。(A)將 H3 亞型標準質體經由10 倍序列稀釋與 Lightcycler real time PCR 反應，所得 到之反應循環數與螢光量對照表。(B)換算 H3 亞型標準質體濃度為 copy number 與 real time PCR 反應循環數對照表。(C)取部分 PCR 反應產物跑 3 %洋菜膠，產物大小皆為 179 bp。(D)將 PCR 產物與 H1 亞型標準質體 混合之後所得運算結果，28 個 copies 以下所測得的圖形會有些許不同。
A. B.
圖六 A 型流行性感冒病毒檢體與疫苗病毒株的檢驗
建立各血清亞型的標準曲線後，取臨床檢體做此檢驗方式的測試。(A)取 21 株病毒檢體與 H1 亞型標準質體混合之後分析，測出有 3 個檢體與標 準H1、H3 亞型的圖形有差異。(B)將歸類於 H3 亞型的病毒檢體與 H3 亞 型標準質體混合之後分析，可檢驗出與H3 標準質體序列不同的檢體。(C) 取5 株疫苗病毒株與 H1 亞型標準質體混合之後分析，測出 A/Taiwan/1/86 圖形較為特別，其他 4 株疫苗病毒株與 H3 亞型標準質體圖型相同。(D) 將歸類於 H3 亞型之疫苗病毒株與 H3 亞型標準病毒株混合，得到 A/Wellington/1/04 病毒株的圖形與 H3 亞型標準質體的圖形相同，而另 3 株疫苗病毒株的圖形不同。(E)(F)分析檢體與疫苗病毒株的序列，可得知 與標準質體圖型不同的病毒株在序列上都有改變。
(A)
(B)
(C)
(D)
圖七 改變 Dab2 蛋白表現量，用病毒斑分析法測試所產生的病毒數量有 無改變。
將pCI neo vector、pCI neo hDab2 與 pU6、pU6 siDab2 2112 分別送入 MDCK 細胞，改變 Dab2 的表現量後感染病毒，並偵測病毒產生量。(A) 測試Dab2 蛋白於轉染 RNAi 質體後的蛋白表現量，以 Actin 作為對照，
於24 小時的結果下降較為明顯。(B)轉染質體後用病毒斑分析法所做的結 果，只轉染載體的細胞與轉染Dab2 RNAi 的細胞所產生的病毒斑數量相 差不大，約為 0 至 5 顆，比只感染流行性感冒病毒的細胞所產生的病毒 斑數量少。(C)測試 Dab2 蛋白於轉染 pCI-neo hDab2 質體後的蛋白表現 量，以Actin 作為對照，於 12 小時的結果表現量上升較為明顯。(D)轉染 質體後用病毒斑分析法所做的結果，只轉染載體的細胞與轉染了pCI-neo hDab2 質體的病毒斑數量與只感染病毒的數量相差不大。(C: control，I:
Dab2 si2112，D: pCI-neo hDAB2，P: positive control，V: pU6 / pCI-neo)
(A) 4 ℃培養 1 小時
(B) 培養 1 小時
(C) 培養 2 小時
(D) 培養 4 小時
(E) 培養 6 小時
(F) 培養 8 小時
(G) 培養 12 小時
圖八 利用免疫螢光染色法標示病毒顆粒(綠色、黃色)，細胞核染 DAPI (藍 色)，再利用共軛膠顯微鏡觀察病毒於感染細胞之後所存在的位置。
(A)細胞於感染病毒後，放置 4 ℃培養 1 個小時，病毒顆粒大部分位於細 胞膜上，未進入細胞當中。(B)細胞於感染病毒後培養 1 個小時，病毒已 開始進入細胞。(C)培養 2 個小時，病毒擴散於整個細胞質。(D)培養 4 個 小時，病毒大部分進入細胞核當中。(E)、(F)培養 6 至 8 個小時，病毒開 始準備離開細胞，聚集於細胞膜附近。(G)培養 12 個小時後，病毒存在 的位置較為廣泛，細胞質、細胞膜、細胞核中都可發現病毒顆粒的存在。
flu/actin ratio
0 50 100 150 200 250
2 hr 4 hr 6 hr 8 hr
圖九 於感染流行性感冒病毒後不同時間點收取細胞的 RNA，偵測病毒 RNA 的量。
將A549 細胞感染病毒之後的 2、4、6、8 小時收細胞的 RNA，以 real time RT-PCR 方式偵測細胞中病毒含量，發現隨著時間的增加，病毒 RNA 量 也隨著增加，此結果與圖八的細胞染色結果相符合。
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