3-1.實驗動物
本研究採用Sprague Dawley (SD)雄性大鼠，體重介於 300-350 公克之 間，購自國科會動物中心。實驗鼠飼養於中國醫藥大學動物中心，飼養 室濕度保持在55 ± 5%，室溫維持在 22 ± 2ºC 之間，且一天中光照-黑暗
各 12 小時。所有老鼠實驗前一天禁食但可自由喝水。本研究所有實驗
過程與步驟均遵循中國醫藥大學動物中心委員會之規範守則。
3-2.實驗室藥品與儀器
(1) Chloral hydrate (Merck, Germany) (2) Hematoxylin (Merck, Germany)
(3) 0.9% NaCl (永豐化學工業股份有限公司，台灣) (4) Paraformaldehyde (Merck, Germany)
(5) Sucrose (GERBU, Biotechink GmbHD-69251, Gaiberg) (6) Heparine (南光化學製藥股份有限公司，台灣)
(7) PE-50 tube (晶龍科技儀器有限公司，台灣) (8) EDTA tube (BD Franklin Lakes NJ, USA)
(9) 3-0 nylon monofilament (晶龍科技儀器有限公司，台灣) (10) KUBOTA 6900 (KUBOTA Co., Japan)
(11) Blood pressure monitor (Columbus instruments, BP-2, USA) (12) Rectal thermometer (晶龍科技儀器有限公司，台灣)
(13) Cryostat (SHANDON, UK)
(14) Sterotactic flame (Stoelting Co., USA )
3-3.中大腦動脈阻塞模型
本實驗採用管腔內套繩(intraluminal suture)阻塞中大腦動脈如先前所
述(116)。簡要敘述，老鼠以氯合水醛(chloral hydrate, 400 mg/kg bw)腹腔注
射麻醉，PE-50 管插入右股動脈偵測心跳及血壓，抽取股動脈血進行血 液氣體(blood gas)及血糖(blood sugar)分析。另一 PE-50 管則插入股靜脈 可進行阿魏酸(FA) (Sigma, Cat:12870-8 , USA)之注射給藥。接著進行頸 部中切暴露頸總動脈(common carotid artery)及內頸動脈(internal carotid artery)，將翼顎動脈(pterygopalatine artery)分支處綁緊，將尖端以火燒鈍 且覆蓋 poly-L-lysine (Sigma, USA)之 3-0 尼龍套繩從外頸動脈(external carotid artery)經由頸總動脈進入內頸動脈達 20~25 公釐深處，阻塞中大 腦動脈基部血流。中大腦動脈阻塞 90 分鐘後，將 3-0 尼龍套繩緩慢抽出
進行再灌流。再灌流 24 小時，老鼠進行神經學行為評估。而在中大腦
動脈阻塞前，我們於右大腦表面中大腦動脈血流分布處(囪門側面至 2.5 mm 及囪門後至 2.0 mm 處)磨骨鑽洞，並以都卜勒血流測量儀(DRT4, Moor Instruments Inc. Wilmington, USA)偵測梗塞區表面之中大腦動脈血 流，都卜勒血流測量儀呈現血流由阻塞前 500 單位以上降至阻塞後 100
內頸動脈暴露，但中大腦動脈並未阻塞；2) control 組：中大腦動脈阻 塞90 分鐘，再灌流 24 小時；3) FA60 組：同control 組，但於中大腦動 脈阻塞的同時靜脈注射60 mg/kg (bw) FA；4) FA80 組：同 FA60 組，但 於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射80 mg/kg FA；5) FA100 組：同 FA60 組，但於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射100 mg/kg FA；6) DFA 組：
同control 組，但於中大腦動脈阻塞後 30 分鐘靜脈注射 100 mg/kg FA。
(2).生理指標偵測
動脈血液(包括有 pH、 pO2及pCO2)、血糖、平均動脈壓(mean arterial blood pressure; MABP)和心跳速率(heart rate)分別於中大腦動脈阻塞前 10 分鐘、缺血後 90 分鐘及再灌流 10 分鐘偵測。
(3).圖示中大腦動脈阻塞模型
(4).神經學狀態評估
再灌流 24 小時後，每隻老鼠由不知實驗分組狀況之研究人員進行神
經學狀態評估。神經學缺陷分數(neurological deficit-score)範圍 0 至 18 分，包括有運動(motor)、感覺(sensory)、平衡(balance)及反射(reflex)如
前所述(117)。簡要敘述：運動試驗包括將老鼠放置在地板上(不能走直線
記錄為1 分; 向麻痺側繞圈圈記錄為 2 分; 轉向麻痺側不能行走記錄為 3 分)及抓起老鼠尾巴(左前肢彎曲記錄 1 分;左後肢彎曲記錄 1 分;頭側彎超 過 10 度記錄 1 分)。感覺試驗包含有鬍鬚觸覺試驗(缺損記錄 1 分)及前 腳抓力試驗(缺損記錄 1 分)。橫樑平衡試驗包括：老鼠停在橫樑一側記 錄為1 分；如停在橫樑一側有一腳下垂無法抓住橫樑則記錄為 2 分；如
停在橫樑一側有二腳下垂無法抓住橫樑則記錄為3 分；試圖停留在橫樑
上但最終掉下來(停留在橫樑時間超過 40 秒) 記錄為 4 分；試圖停留在 橫樑上但最終掉下來(停留在橫樑時間少於 20 秒) 記錄為 5 分；完全無
法停留在橫樑上，立即掉落橫樑記錄為6 分；反射缺損及活動異常試驗
包括有耳道刺激反射試驗(pinna reflex) 缺損則記錄 1 分；眼角刺激反射 試驗(corneal reflex) 缺損則記錄 1 分；驚嚇反射試驗 (startle reflex) 缺損 則記錄1 分；有抽搐異常動作(seizure) 則記錄 1 分。
(5).圖示神經學狀態評估
(6).評估腦梗塞面積
神經學狀態評估之後，老鼠經深度麻醉後犧牲。鼠腦迅速取出置放於 腦模型中切成厚度為 2 mm 之腦冠切片，將腦冠切片於 37ºC 下以 2%
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC, Merk, Germany)染色 15 分鐘。
腦 切 片 依 不 同 染 色 分 成 白 色 的 梗 塞 區 及 紫 紅 色 的 非 梗 塞 區 。 以 microscopic image-analysis software (Image-Pro plus, USA)計算前 6 片腦 切片之梗塞面積，最後計算梗塞面積與全部腦切片面積的比率。
(7). 實驗 A 流程圖
3-4-1-B.實驗 B (1).分組
SD 雄性大鼠隨意分成 3 組，每組 6 隻。分組如下：1) sham 組：右 頸總動脈及內頸動脈暴露，但中大腦動脈並未阻塞；2) control 組：中
大腦動脈阻塞90 分鐘，再灌流 2 小時；3) FA100 組：同 control 組，但 於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射100 mg/kg FA。
(2). Hydroethidium 原位染色及 Hoechst 染色
於中大腦動脈阻塞前 10 分鐘從股靜脈打入 0.5 ml 之 hydroethidium solution (1mg/ml)，老鼠於再灌流 2 小時麻醉且犧牲，老鼠以 200 ml 0.9%
之生理食鹽水及200 ml 4%之福馬林(paraformalaldehyde, pH 7.4)經心臟 灌流，鼠腦迅速取出再以4%福馬林固定隨後以 30% sucrose 脫水三天，
以包埋劑包埋之後至切片機切成厚度15 µm 之腦切片。接著腦切片於暗 室 中 以 2.5×10-3 mg/ml Hoechst 33258 (Molecular Probes) 溶 於 PBS solution 中培養 15 分鐘當背景染色，再以水溶性封片膠(Calbiochem, Oncogene, Germany) 封 片 。 Hydroethidium 可 被 超 氧 陰 離 子 氧 化 成 oxidized hydroethidine。腦切片以共軛焦螢光顯微鏡(Leica TCS SP2)偵測 oxidized hydroethidine (excitation 510-550 nm and emission 610-650 nm)陽 性細胞於皮質及紋狀體梗塞區表現情形。
(3). ICAM-1 、 MPO 及 NF-κB (p50) 免 疫 組 織 化 學 分 析 染 色 (Immunohistochemistry staining; IHC)
選 取 相 鄰 hydroethidium 染 色 之 腦 切 片 ( 每 組 n=5) 以 Dulbeaco’s phosphate buffered saline (1 × DPBS, Sigma, USA)潤濕，以 0.3%之 H2O2 / methanol 溶液浸泡 15 分鐘去除內生性抗氧化酶活性。腦切片於室溫下 以10% normal animal serum (Zymed, San Franciso, CA, USA)培養 20 分 鐘。接著腦切片在4ºC 以一抗(ICAM-1 1:100 dilution, Santa Cruz; MPO 1:500 dilution, Cell Science Inc.; NF-κB (p50) 1:250 dilution, Santa Cruz) overnight，再以二抗及 avidine-biotin peroxidase complex (ABC kit, Zymed,
CA, USA)培養。腦切片以 3, 3’-diaminobenzidine (DAB)試劑呈色，再以 hematoxylin 當背景染色，最後以封片膠(SP 15-500, New Jersey, USA)封 片並置於顯微鏡(Olympus, BX50F4, Japan)下計數定量。
(4) Hydroethidium 原位染色及 Hoechst 染色示意圖(118)
3-4-1-C.實驗 C (1).分組
共有18 隻雄性 SD 大鼠隨意分成 3 組，每組 6 隻。分組如下：1) sham 組：右頸總動脈及內頸動脈暴露，但中大腦動脈並未阻塞；2) control 組：中大腦動脈阻塞90 分鐘，再灌流 24 小時；3) FA100 組：同 control 組，
但於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射100 mg/kg FA。
(2). ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50 )免疫組織化學分析染色
再灌流 24 小時，老鼠麻醉犧牲進行心臟灌流，鼠腦迅速取出，並切
成厚度為 15 µm 之腦切片，接著進行 ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50) 之免疫組織化學分析染色分析，染色方法及步驟如前所述。
(3). ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50 )免疫組織化學分析染色示意圖(8)
(4).實驗 B、C 流程圖
3-4-2.第二階段 (1).分組
本實驗SD 雄性大鼠任意分成三組：FA 組、control 組及 sham 組。老 鼠於FA 組中進行中大腦動脈阻塞同時靜脈注射 100 mg/kg FA，阻塞 90 分鐘後，老鼠於再灌流2 小時、10 小時、24 小時及 36 小時分批犧牲；
老鼠於 control 組除了不給予 FA 外，其餘實驗步驟均與 FA 組相同；老 鼠於 sham 組除了不梗塞中大腦動脈血流外，其餘實驗步驟均與 control 組相同。
(2).生理指標
在實驗過程中，老鼠均以電熱毯加熱保溫，且肛溫維持在37.0±0.5ºC 之間。並於缺血前10 分鐘及缺血後 90 分鐘偵測動脈血中 pH、pO2、pCO2
及血糖值。
(3). RNA 萃取
暫時性中大腦動脈阻塞90 分鐘後，老鼠(n=4)於再灌流 2 小時犧牲且 迅速將腦取出。本實驗採用acid guanidinium thiocyanate-water saturated phenol-chloroform mixture 法(119)於鼠腦兩側皮質及紋狀體(囪門前 1.7 至 囪門後4.3mm)進行 RNA 萃取。步驟如下，腦組織取出後稱重並置入適 量denaturing solution (4M guanidinium thiocyanate, 25mM sodium citrate (pH 7.0) and 0.5% (w/v) sodium lauroyl sarcosinate)。組織均質後依序加入 2M sodium acetate (pH 4.0) 、 water-saturated phenol (pH 4.0) 及 chloroform/isoamyl alcohol mixture (49:1, v/v)，然後將此混合液置放於冰 上15 分鐘。以 14000 rpm 轉速 4ºC 下離心 15 分鐘取上層水液層(aqueous phase)。將上層水液層再進行兩次 leder phenol (內含 water-saturated phenol (pH 4.0)、chloroform 及 isoamyl alcohol mixture；比例為 25:24:1) 萃取。取出上層懸浮液(supernatant)加入等量之 ice-cold isopropanol 並貯 存於-70ºC 下至少 15 分鐘。以 14000 rpm 轉速 4ºC 下離心 5 分鐘，沉澱 物(pellet)以 DEPC-treated 之去離子水溶解並貯存於-70ºC 冰箱中。
(4). 半 定 量 反 轉 錄 - 聚 合 酶 鏈 式 反 應 (Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction;RT-PCR)
1 μg RNA 加入含有 0.5 μg/μl oligo dT、10mM dNTP (Promega) 及 DEPC-treated 去離子水之溶液(總共 13 μl)中，於 65ºC 的水箱中培養 5 分鐘。接著加入內含 4 μl 之 5× first-strand buffer (Promega)、1 ul of 0.1 M DTT (Promega)、1 μl of 40 U/μl RNasin (Promega)及 1 μl of 200 U/μl superscript ш (Invitrogen)混合液，於 37ºC 下培養 45 分鐘，95ºC 下培養
5 分鐘及 4ºC 下培養 5 分鐘進行反轉錄反應。2 μl 之反轉錄產物(cDNA) 加入 48 μl 內含 10 μM primer (ICAM-1、 Mac-1、IL-1β、TNF-α 或 GAPDH) (Invitrogen) (Table 1)、10 mM dNTP (Promega)、10× PCR buffer (Promega) 、 25 mM MgCl2 (Promega) 、 5 U/μl Go Taq (Promega) 及 DEPC-treated 去離子水進行聚合酶鏈式反應。而聚合酶鏈式反應初始以 94ºC 進行 12 分鐘變性(denaturation)，接著 94ºC 下 1 分鐘，55ºC 下 1 分 鐘，72 ºC 下 2 分鐘及最後在 72ºC 下進行最後延長 6 分鐘，總共進行 33 或35 循環(Table 3-1)。聚合酶鏈式反應產物於 2% agarose gel 下進行電 泳，再以EtBr 染色。聚合酶鏈式反應產物以 Gel-Pro Analyzer Software 進行定量分析，產物值相對於GAPDH 產值為最後之百分比值。
Table 3-1. Primer sequences
Primers (5’→3’) Cycles Product size (bp)
ICAM-1 33 234
Table 3-1. 續
Primers (5’→3’) Cycles Product size (bp) Sense:
CACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG Antisense:
GTCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA
TNF-α 35 196
Sense:
GTAGCCCACGTCGTAGCAAAC Antisense:
TGTGGGTGAGGAGCACATAGTC
GAPDH 33 452
Sense:
ACCACAGTCCATGCCATCAC Antisense:
TCCACCACCCTGTTGCTGTA
(5).半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應示意圖(119)
(6).免疫組織化學分析染色
經過90 分鐘中大腦動脈阻塞後，老鼠於再灌流 2 (n=6)、10 (n=5)、
24 (n=6) 及 36 小時(n=3) 分批深度麻醉犧牲。老鼠以 200 ml 之 0.9%生 理食鹽水及 200 ml 之 4%福馬林(paraformalaldehyde, pH 7.4)經心臟灌 流，鼠腦迅速取出再以 4%福馬林固定隨後以 30% sucrose 脫水三天，以
包埋劑包埋之後至切片機切成厚度 15 µm 之腦切片。腦切片以內含有
0.01% Tween-20 之 Dulbeaco’s phosphate buffered saline(Sigma, USA)潤濕 再以3% 之 H2O2/methanol 溶液浸泡 15 分鐘以去除內生性抗氧化酶活性 (endogenous peroxidase activity)。腦切片以 10% normal animal serum (Zymed, CA, USA)於室溫下培養 20 分鐘，接著分別以 anti-Mac-1 (1:200 dilution, Chemicon)室溫下培養 1 小時； anti-4-HNE (1:400 dilution, MHN-100P, JaICA) 4ºC 下 overnight ； anti-8-OHdG (1:100 dilution,
MOG-020P, JaICA) 4ºC 下 overnight。另外，我們選取再灌流 10 小時及 36 小時犧牲之腦切片分別以 rabbit anti-active caspase 3 (17kD, 1:100 dilution, Chemicon)及 mouse anti-NeuN (1:200 dilution, Chemicon)於 37ºC 下培養1.5 小時。接著以二抗及 avidine-biotin peroxidase complex (ABC kit, Zymed, CA, USA)培養，再以 3,3’-diaminobenzidine (DAB)呈色，最 後以hematoxylin 培養(active caspase 3 及 NeuN 等一抗之腦切片除外) 當背景染色。完成染色之腦切片以封片膠(Assistant-Histokitt, Germany) 封片，並在顯微鏡(Axioskop 40, Zeiss)下計數免疫陽性細胞之表現。取 相鄰 control 組之腦切片進行去除一抗培養之免疫組織化學分析當成 Mac-1、 4-HNE 及 8-OHdG 之 negative control 染色；另外取相鄰 sham 組 之 腦 切 片 進 行 去 除 一 抗 培養 之 免 疫 組 織 化 學 分 析 當 成 NeuN 之 negative control 染色。
(7).免疫組織化學分析染色示意圖(120)
(8).細胞凋亡染色分析 (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay; TUNEL)
TUNEL 分析用於確認半陰影區及梗塞核心區之細胞核 DNA 斷裂 (DNA fragmentation) 。 TUNEL 染 色 依 廠 商 說 明 書 步 驟 進 行 (Calbiochem)。簡要敘述，取出先前免疫組織化學分析之相鄰腦切片於 室溫下以20 µg/ml proteinase K 培養 20 分鐘，以 TBS 潤濕後以 1×TdT equilibration buffer 室溫下培養 30 分鐘，然後於 37ºC 下以 TdT labeling reaction mixture 培養 1.5 小時。加入 stop solution 和 blocking buffer 後，
腦切片於室溫下以 1×conjugate solution 培養 30 分鐘，再以 DAB kit 呈 色。最後腦切片以methyl green 當背景染色。
(9).細胞凋亡染色分析示意圖(121)
(10).免疫組織化學分析雙重染色
將先前以免疫組織化學分析法染 active caspase 3 之腦切片於室溫下 以 normal blocking serum (Vector)培養 25 分鐘。接著腦切片以 mouse anti-NeuN (1:200 dilution, Chemicon )一抗於 37ºC 下培養 1.5 小時，以 DPBS 清洗。再以 diluted biotinylated secondary antibody 及 ABC-AP reagent (AK-5002, Vectastain) 培 養 。 腦 切 片 以 alkaline phosphatase substrate solution (SK-5300, Vector Blue)染色、亮乾再以封片膠封片 (Assistant-Histokitt, Germany) ， 切 片 中 之 免 疫 陽 性 細 胞 以 顯 微 鏡 (Axioskop 40, Zeiss)計數偵測。而 negative control 染色則是在相鄰 control 組腦切片上以去除 active caspase 3 及 NeuN 等一抗進行和上述相
將先前以免疫組織化學分析法染 active caspase 3 之腦切片於室溫下 以 normal blocking serum (Vector)培養 25 分鐘。接著腦切片以 mouse anti-NeuN (1:200 dilution, Chemicon )一抗於 37ºC 下培養 1.5 小時，以 DPBS 清洗。再以 diluted biotinylated secondary antibody 及 ABC-AP reagent (AK-5002, Vectastain) 培 養 。 腦 切 片 以 alkaline phosphatase substrate solution (SK-5300, Vector Blue)染色、亮乾再以封片膠封片 (Assistant-Histokitt, Germany) ， 切 片 中 之 免 疫 陽 性 細 胞 以 顯 微 鏡 (Axioskop 40, Zeiss)計數偵測。而 negative control 染色則是在相鄰 control 組腦切片上以去除 active caspase 3 及 NeuN 等一抗進行和上述相