阿魏酸對腦缺血-再灌流損傷大鼠之抗炎症、抗氧化作用及其機轉之探討;The Anti-Inflammatory and Antioxidative Effects and Mechanisms of Ferulic acid on Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

全文

(1)中國醫藥大學中國醫學研究所博士論文. 指導教授：謝慶良教. 授. 共同指導教授：唐娜櫻副教授. 論文題目阿魏酸對腦缺血-再灌流損傷大鼠之抗炎症、抗氧化作用及其機轉之探討 The Anti-Inflammatory and Antioxidative Effects and Mechanisms of Ferulic acid on Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats. 研究生：程錦宜. 中華民國九十七年十二月.

(2) 目錄第一章前言-------------------------------------------------------------------. 1. 第二章文獻探討------------------------------------------------------------- 5 2-1. 傳統醫學對缺血性腦中風之論述------------------------------- 5 2-1-1.病因病機之歷史沿革 -------------------------------------------- 5 (1).唐宋以前時期 ----------------------------------------------------- 5 (2).金元時期 ----------------------------------------------------------- 6 (3).明清時期 ----------------------------------------------------------- 6 2-1-2.治則 ----------------------------------------------------------------- 7 2-2. 缺血性腦中風之現代研究---------------------------------------- 7 2-2-1.臨床表現 ----------------------------------------------------------- 7 2-2-2.病理機轉 ----------------------------------------------------------- 8 2-2-3.臨床治療 ----------------------------------------------------------2-3. 阿魏酸之現代研究 -----------------------------------------------2-3-1.前言 ----------------------------------------------------------------2-3-2.阿魏酸之理化性質 ----------------------------------------------2-3-3.阿魏酸及其衍生物之體內代謝--------------------------------2-3-4.阿魏酸藥理作用 -------------------------------------------------(1).抗氧化及清除自由基 -------------------------------------------(2).中樞神經保護作用 ----------------------------------------------(3).心血管保護作用 -------------------------------------------------(4).肝臟保護作用 ----------------------------------------------------(5).胃腸消化道保護作用 -------------------------------------------(6).抗癌病變作用 ----------------------------------------------------(7).治療糖尿病作用 -------------------------------------------------(8).抗細胞凋亡作用 -------------------------------------------------(9).抗內皮素-1 作用 --------------------------------------------------. 9 10 10 10 11 12 12 14 16 17 18 18 19 20 21. 第三章材料與方法---------------------------------------------------------3-1.實驗動物 -------------------------------------------------------------3-2.實驗室藥品與儀器 -------------------------------------------------3-3.中大腦動脈梗塞模型 ----------------------------------------------3-4.實驗步驟 -------------------------------------------------------------3-4-1.第一階段又分為實驗 A、B 和 C -----------------------------3-4-1-A.實驗 A ----------------------------------------------------------(1).動物分組 -----------------------------------------------------------. 22 22 22 23 23 23 23 23. iv.

(3) (2).生理指標偵測 ----------------------------------------------------(3).圖示中大腦動脈梗塞模型 -------------------------------------(4).神經學狀態評估 -------------------------------------------------(5).圖示神經學狀態評估 -------------------------------------------(6).評估腦梗塞面積 -------------------------------------------------(7).實驗 A 流程圖----------------------------------------------------3-4-1-B.實驗 B-----------------------------------------------------------(1).分組 ----------------------------------------------------------------(2). Hydroethidium 原位染色及 Hoechst 染色 ------------------(3). Hydroethidium 原位染色及 Hoechst 染色示意圖 ---------(4). ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50 )免疫組織化學分析染色 ---------------------------------------------------------------------3-4-1-C.實驗 C-----------------------------------------------------------(1).分組 ----------------------------------------------------------------(2). ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50 )免疫組織化學分析染色 ---------------------------------------------------------------------(3). ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50 )免疫組織化學分析染色示意圖---------------------------------------------------------(4).實驗 B、C 流程圖-----------------------------------------------3-4-2.第二階段 -----------------------------------------------------------(1).分組 ----------------------------------------------------------------(2).生理指標 ----------------------------------------------------------(3). RNA 萃取---------------------------------------------------------(4).半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應-------------------------------(5).半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應示意圖----------------------(6).免疫組織化學分析染色-----------------------------------------(7).免疫組織化學分析染色示意圖--------------------------------(8).細胞凋亡染色分析 ----------------------------------------------(9).細胞凋亡染色分析示意圖--------------------------------------(10).免疫組織化學分析雙重染色 ---------------------------------(11).免疫組織化學分析雙重染色示意圖 ------------------------(12).第二階段實驗流程圖 ------------------------------------------3-5.統計分析 -------------------------------------------------------------第四章結果------------------------------------------------------------------4-1. 第一階段實驗結果---------------------------------------------4-1-1. 生理指標---------------------------------------------------------4-1-2. FA 對再灌流 24 小時後腦梗塞面積之影響 ---------------v. 24 24 25 25 26 26 26 26 27 27 28 28 28 29 29 30 30 30 30 31 31 34 34 35 36 36 37 37 38 38 39 39 39 40.

(4) 4-1-3. FA 對再灌流 24 小時後神經學行為缺陷之影響 ---------4-1-4. FA 對再灌流 2 小時後 oxidized hydroethidine 螢光染色陽性細胞表現之影響------------------------------------------4-1-5. FA 對再灌流 2 小時後 ICAM-1、MPO 及 NF-κB(p50) 陽性細胞表現之影響------------------------------------------4-1-6. FA 對再灌流 24 小時後 ICAM-1、MPO 及 NF-κB(p50) 陽性細胞表現之影響------------------------------------------4-2. 第二階段實驗結果---------------------------------------------4-2-1. 生理指標---------------------------------------------------------4-2-2. FA 對再灌流 2 小時後 ICAM-1 及 Mac-1 mRNA 表現之影響------------------------------------------------------------4-2-3. FA 對再灌流 2、10、24 及 36 小時後 Mac-1、4-HNE 及 8-OHdG 陽性細胞表現之影響---------------------------4-2-4. FA 對再灌流 2、10、24 及 36 小時後 TUNEL 陽性細胞表現之影響---------------------------------------------------4-2-5. FA 對再灌流 10 小時後 active caspase 3 及 active caspase 3-NeuN 陽性細胞表現之影響 -------------------------------4-2-6. FA 對再灌流 36 小時後 NeuN 陽性細胞表現之影響 ----. 42 42 44 45 49 49 51 53 54 60 60. 第五章討論------------------------------------------------------------------- 67 第六章結論------------------------------------------------------------------- 74 參考文獻 ----------------------------------------------------------------------- 75 英文摘要 ----------------------------------------------------------------------- 96 附錄附錄附錄附錄. (1) (2) (3) (4). 腦缺血-再灌流損傷之機轉圖---------------------------------第一階段討論之機轉圖----------------------------------------第二階段討論之機轉圖----------------------------------------第一、二階段之綜合機轉圖-----------------------------------. vi. 98 99 100 101.

(5) 圖目錄 Figure 4-1. Effect of ferulic acid on cerebral infarct in ischemiareperfusion injured rats -------------------------------------------Figure 4-2. Representative photograph showed the brain coronal section located on the posterior bregma 0.92 mm position---Figure 4-3. Effect of ferulic acid on oxidized hydroethidine fluorescent stain positive cells at 2 h of reperfusion ----------Figure 4-4. Effect of ferulic acid on the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) immunoreative vessels at 2 h and 24 h of reperfusion ----------------------------------------------------Figure 4-5. Effect of ferulic acid on the nuclear factor-κB (NF-κB) and myeloperoxidase (MPO) cells at 24 h of reperfusion ---------Figure 4-6. The expression of ICAM-1 and Mac-1 mRNA in the ischemic areas of the cortex and striatum were detected at 2 h of reperfusion --------------------------------------------------Figure 4-7. Representative photograph showed the brain coronal section located on the posterior bregma 0.92 mm position--Figure 4-8. Representative photographs depicted the expression of Mac-1 in the penumbra and ischemic core areas at 10, 24, and 36 h of reperfusion ------------------------------------------Figure 4-9. Representative photographs depicted the expression of 4-HNE in the penumbra and ischemic core areas at 10, 24 and 36 h of reperfusion ------------------------------------------Figure 4-10. Representative photographs depicted the expression of 8-OHdG in the penumbra and ischemic core areas at 10, 24 and 36 h of reperfusion. --------------------------------------Figure 4-11. Photographs depicted the distribution of TUNEL cells in the penumbra and ischemic core areas at 10, 24 and 36 h of reperfusion------------------------------------------------------Figure 4-12. Representative photographs depicted active caspase 3 and NeuN expression in the penumbra area at 10 h of reperfusion---------------------------------------------------------Figure 4-13. Representative photographs depicted NeuN expression in the penumbra and ischemic core areas at 36 h of reperfusion----------------------------------------------------------. vii. 41 43 44. 45 47. 52 55. 56. 57. 58. 59. 61. 62.

(6) 表目錄 Table 3-1. Primer sequences --------------------------------------------------- 32 Table 4-1. Comparison of physiological parameter among the groups--- 39 Table 4-2. The expression of oxidized hydroehtidine, ICAM-1, MPO and NF-κB immunoreactive (positive) cells (vessels) --------- 48 Table 4-3. Physiological parameters ------------------------------------------ 50 Table 4-4. The effects of ferulic acid on Mac-1, 4-HNE, 8-OHdG and TUNEL positive cells ---------------------------------------------- 63 Table 4-5. The effects of ferulic acid on active caspase 3 and NeuN-labeled cells ------------------------------------------------- 65. viii.

(7) 縮寫對照表. 1. BBB: Blood brain barrier 2. BW: Body weight 3. ET-1: Endothelin-1 4. FA: Ferulic acid 5. ICAM-1: Intercellular adhesion molecule-1 6. LFA-1: Lymphocyte function associated antigen-1 7. Mac-1: Macrophage -1 antigen 8. MPO: Myeloperoxidase 9. NeuN: Neuronal nuclei 10. NF-κB: Nuclear factor-κB 11. RT-PCR: Reverse transcriptase-polymerase chain reaction 12. TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPbiotin nick end labeling 13. 4-HNE: 4-hydroxy-2-nonenal 14. 8-OHdG: 8-hydroxy- 2′- deoxyguanosine. ix.

(8) 阿魏酸對腦缺血-再灌流損傷大鼠之抗炎症、抗氧化作用及其機轉之探討研究生：程錦宜指導教授：謝慶良教授單位：中國醫學研究所中文摘要當歸與川芎於傳統中醫藥用於治療腦中風已有數個世紀之久，而阿魏酸為當歸、川芎之主要成分之一，具有神經保護的效用。本實驗最主要目的在於探討阿魏酸對於腦缺血-再灌流損傷大鼠之抗炎症及抗氧化損傷效用及其機轉。老鼠於中大腦動脈梗塞 90 分鐘後分別進行再灌流 2、 10、24 及 36 小時。第一階段於再灌流 24 小時進行腦梗塞面積及神經學缺陷評估；另外再灌流 2 小時進行超氧陰離子偵測，再灌流 2 及 24 小時進行細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、過氧化骨髓酶(MPO)及核因子-κB (NF-κB)等免疫陽性細胞(血管)之評估。第二階段於再灌流 2 小時偵測 ICAM-1 及巨噬细胞-1 抗原(Mac-1) mRNA 之表現；再灌流 2、10、24 及 36 小時偵測 Mac-1、 8-氫氧 2'-去氧鳥糞核糖(8-OHdG)、4-羥烯酸 ( 4-HNE)、 active caspase 3、神經元核抗原(NeuN) 及 TUNEL 陽性細胞。結果顯示於中大腦動脈梗塞的同時給予阿魏酸劑量 80、100 mg/kg bw，再灌流 24 小時可有效地降低梗塞面積及神經學缺陷分數。阿魏酸 (100 mg/kg bw)於再灌流 2 小時可有效地抑制超氧陰離子於腦實質梗塞區的表現且可顯著抑制紋狀體梗塞區 ICAM-1 免疫陽性血管及 ICAM-1、Mac-1 mRNA 之表現；再灌流 24 小時可降低 ICAM-1 及 NF-κB 於皮質和紋狀體梗塞區之表現，同時亦可於皮質梗塞區調降 MPO 免疫陽性細胞；再灌流 10、24 及 36 小時於半陰影區及梗塞區可顯著抑制 Mac-1、 4-HNE 及 8-OHdG 陽性細胞之表現，再灌流 10 小時半陰影及再灌流 24、36 小時半陰影區及梗塞區可顯著抑制 TUNEL 陽性細胞之表現；另外可於再灌流 10 小時半陰影區降低 active caspase 3 的表現及再灌流 36 小時於半陰影區及梗塞區顯著提升 NeuN 陽性細胞的表現。結論為阿魏酸於再灌流 24 小時具有降低腦梗塞面積及神經學缺陷之 1.

(9) 療效，而其神經保護機轉包括再灌流早期超氧陰離子及 ICAM-1 mRNA 抑制作用，而此抗氧化及抗炎症效用可於再灌流晚期進一步抑制 NF-κB、活化微膠細胞/巨噬細胞、氧化損傷及氧化損傷相關之細胞凋亡。關鍵詞：阿魏酸；細胞間黏附因子-1(ICAM-1)；核因子-κB(NF-κB)； 8氫氧 2'-去氧鳥糞核糖(8-OHdG)； 4-羥烯酸(4-HNE)；細胞凋亡. 2.

(10) 第一章前言. 中風(stroke)為目前造成病患死亡及殘疾(disability)之主因，經統計約六分之一的人口在一生中會歷經至少一次的腦中風(1)。在美國腦中風為第三大死因，每年約有七十萬人罹患腦中風，其中有二十萬人為再發性 (recurrent attack)(2)(3) 。2007 年在台灣約有一萬二千餘人死於腦血管疾患，高居台灣十大死因第三位，如以性別區分則男性居第三位，而女性居第四位，如以年齡分析發現 65 歲以上佔腦血管疾患死亡總數之 78.6% (4). ，可見腦血管疾患實為老年人主要死因之一。在西方國家中，腦中風. 患者有 80%為局限性缺血性腦中風(focal cerebral ischemia)，其中大部分為中大腦動脈阻塞所致；另 20%為出血性腦中風(hemorrhages)(1)(5)。臨床上缺血性腦中風及續發缺血腦中風(recurrent ischemic stroke)危險因子有高血壓 (hypertension) 、糖尿病 (diabetes) 及高膽固醇血症 (hypercholesterolemia)(6)。目前對治療急性缺血性腦中風病患較為清楚有效的藥物為 tissue plasminogen activator (t-PA)(5)，但 t-PA 在臨床應用上有嚴苛的限制及很窄的治療窗口(therapeutic time window)(腦梗塞發生 3 小時內使用)。目前在暫時性腦缺血動物模型中發現有效之神經保護藥物超過 700 種，除了還在進行臨床試驗之自由基清除劑(free-radical-trapping agent) NXY-059 外，其餘的神經保護劑在臨床上尚無足夠證據證實有效 (1)(5). ，可知臨床治療缺血性腦中風目前仍無突破性進展，因而尋找具有. 潛力之藥物對抗腦缺血損傷實為當務之急。接著探討急性腦缺血-再灌流之病理機轉，腦缺血後炎症反應 (inflammatory response)及氧化損傷(oxidative stress)扮演著重要惡化腦損傷的角色(7)，而於各式暫時性中大腦動脈阻塞模型中發現抑制炎症反應之治療策略則具有神經保護效用 (8)(9) 。腦缺血事件誘發細胞激素 1.

(11) (cytokines) 的產生，而細胞激素進一步促發 intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)、 P-selectins 及 E-selectins 等黏附因子的產生，而黏附因子可進一步促進活化白血球(activated leukocytes)黏附及滲透至血管內皮細胞，活化白血球通過血管壁進一步遷移至腦實質梗塞核心區 (9-13). 。而活化白血球為腦缺血-再灌流期間活性氧族群(reactive oxygen. species; ROS)產生之主要來源(14)。ICAM-1 為分子量 76-110 kDa 之單一鏈糖蛋白(glycoprotein)且為免疫球蛋白 supergene family 的一員，可提供 ligand 接合表現於活化白血球上之 CD11a/CD18 (lymphocyte function associated antigen-1；LFA-1) 及 CD11b/CD18 (macrophage-1 antigen； Mac-1)(15-17)。Mac-1 為 β2-integrin，呈異質性雙聚體蛋白質(heterodimeric protein)包含有 α (CD11b) and β (CD18)次單元，Mac-1 呈現於活化白血球表面上可誘發白血球與內皮細胞間之黏附作用(18-20)。活化白血球滲透入血管壁進一步遷移至梗塞核心區，而活化白血球於腦實質分布表現可以 myeloperoxidase (MPO)標記加以確認(16)。活化白血球在黏附的過程中造成腦梗塞區微血管阻塞 (microvascular plugging) 及腦 - 血管障壁 (blood-brain barrier; BBB)的損傷，惡化續發性腦損傷(17)(21)。另有研究報告指出 Mac-1 亦可作為腦梗塞區內微膠細胞/巨噬細胞(microglia / macrophages)之活化標記(22-24)。而微膠細胞/巨噬細胞於腦實質遷移至梗塞核心過程中會釋放大量神經損傷產物，包含有活性氧族群、一氧化氮 (NO)、細胞激素及脂質過氧化產物(lipid peroxidation products)，進一步惡化續發性腦損傷(25-27)。Nuclear factor-κB (NF-κB)為一 proinflammatory 之轉錄因子，平時結合 IκBα 成非活化態之異合體(heterodimmer ; p50/p65) 存在於細胞質中。而活化 NF-κB (p50/p65) 接著轉移至細胞核調控 IL-1β、TNF-α 及 IL-6 等細胞激素基因以及 ICAM-1 和 E-selectin 等黏附因子基因(28)(29)。由此可知，NF-κB 亦可藉由 ICAM-1 途徑惡化白血球 2.

(12) 之滲透作用。先前許多研究報告指出抗 ICAM-1 抗體、ICAM-1 基因剔除或抑制活化白血球可藉由阻斷活化白血球-內皮細胞作用而達降低腦梗塞體積之效用(17)(30-34)。在急性腦缺血-再灌流損傷模型中，細胞壞死 (necrosis)及細胞凋亡(apoptosis)為主要細胞死亡型態(25)。進一步分析得知活化微膠細胞/巨噬細胞釋放大量自由基於腦缺血-再灌流期間攻擊神經細胞重要成分，包括脂質、蛋白質及 DNA，造成細胞核 DNA 氧化及脂質過氧化(lipid peroxidation) (35)(36)。其中超氧陰離子(superoxide anions) 最先由粒腺體產生，在細胞內快速轉變成過氧化氫，隨後轉換成具高度神經細胞毒性的氫氧自由基(hydroxyl radical)(37)，而 2′-deoxyguanosine 之 C-8 位置被氫氧自由基所取代，形成 G:C to T:A 之反轉突變 (transversion mutation) (36)(38)。目前於細胞 DNA 及脂質所熟知的氧化損傷標記分別為 8- 氫氧 2'- 去氧鳥糞核糖 (8-hydroxy-2′-deoxyguanosine; 8-OHdG)及 4-羥烯酸(4-hydroxy-2-nonenal ; 4-HNE)。8-OHdG 主要產生於暫時性腦缺血損傷之神經細胞核，而神經細胞核中累積大量未修復的 DNA 氧化損傷最終導致細胞癌化或凋亡(38-40)。4-HNE 為損傷神經元核周質(neuronal perikarya)之氧化產物，可從細胞中未飽和脂肪酸鏈中釋出，經由脂質過氧化造成細胞膜上轉運子(membrane transporters)喪失功能，最後導致細胞凋亡(41-43)。先前研究報告指出具有抑制活化白血球/ 微膠細胞之藥物於腦缺血-再灌流損傷中可經由降低炎症反應及氧化損傷相關之細胞凋亡(oxidative stress-related apoptosis)而達到神經保護 (neuroprotection)的效用(25)(44)。阿魏酸(ferulic acid; FA; 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid)為當歸 (Anglica sinensis (Olivi) Didl.)、川芎(Ligusticum chuoanxiong Hort.)之主要有效成分之一 (當歸及川芎生藥分別內含約 0.38%及 0.31%之阿魏酸)(45)，而當歸、川芎於傳統中醫藥治療腦中風已數世紀之久。先前研究 3.

(13) 指出 FA 於自發性高血壓鼠模型中可顯著去除超氧陰離子及促進血管擴張(vasodilatation)(46)；另外 FA 於 amyloid 致發模型中可於 hippocampal CA1 區域抑制 IL-1β 的顯現(47)；FA 亦可於中大腦動脈阻塞大鼠模型中具有降低腦梗塞之神經保護效用 (48) ；且具有抗炎症反應 (anti-inflammation) 、自由基清除 (free radical scavenger) 及抗氧化 (antioxidation)效用(49)。但確切的神經保護機轉至今仍不明。因而本研究最主要目的在於探討 FA 於暫時性中大腦動脈阻塞大鼠中之腦梗塞療效及其對於重要神經損傷因子：超氧陰離子、ICAM-1、活化白血球(MPO) 及 NF-κB 之調控情形。進一步探討在腦缺血-再灌流損傷期間 FA 於半陰影區(penumbra)及梗塞核心區(ischemic core)對於微膠細胞/巨噬細胞、氧化損傷(8-OHdG、4-HNE)及氧化損傷相關之細胞凋亡之抑制效用。. 4.

(14) 第二章文獻探討. 2-1.傳統醫學對缺血性腦中風之論述 2-1-1.病因病機之歷史沿革 (1).唐宋以前時期《內經》中類似中風病的記載相當多，有“偏枯”、“薄厥”、“大厥”、 “卒中”等，但無中風的確切病名。如《靈樞‧刺節真邪篇》：“虛邪偏客于身半，其入深，內居榮衞，榮衞稍衰，則真氣去，邪氣獨留，發為偏枯。”；《素問‧生氣通天論》：“陽氣者，大怒則形氣絶，而血菀于上，使人薄厥。”；《素問‧調經論》：“血之與氣，并走于上，則為大厥，厥則暴死，氣復返則生，不返則死。”；《素問‧本病論》：“久而化郁，即大風摧拉，折損鳴亂。民病卒中偏痺，手足不仁。” 《內經》認為中風主因為人體正氣先虛，外來風邪入于肌腠，侵及經脈，以致營衞氣血運行受阻，進而五臟六腑氣血運行失常，氣血運行逆亂而發為中風(50-56)。漢代張仲景最早在《金匱要略》中以中風單獨列節，首創中風病名，並對中風有詳細的論述：“夫風之為病，當半身不遂，或但臂不遂者，此為痺，脈微而數，中風使然”。另外於《金匱要略‧中風厲節病》有詳盡描述“邪在于絡，肌膚不仁；邪在于經，即重不勝；邪入于腑，即不視人，邪入于臟，舌即難言，口吐涎。”張仲景總結指出中風病發生後，病情較輕者，邪在于絡脈，故見半身不遂；若病邪進一步深入臟腑，則昏不識人(56)。隋‧巢元方《諸病源候論‧中風候》載：“中風者，風氣中于人也…其為病者，藏于皮膚之間，內不得通，外不得泄。其入經脈，行于五臟者，各隨臟腑而生病焉。”唐‧孫思邈《千金方‧諸雜風狀》載：“風邪客于肌膚，虛癢成風遂瘙瘡，風邪入深，寒相搏則肉枯，邪客半身入深，真氣去則偏枯。”大致與張仲景之說並無大異。宋代醫家 5.

(15) 亦延續了內虛外中之說。《濟生方‧中風論治》載：“營衞失度，腠理空虛，邪氣乘虛而入，及其感也，半身不遂。”由此可知唐宋之前主張中風病之病因病機為內虛邪中之外風論(54)(55)(57)。. (2).金元時期唐宋之後，尤其是金元時期，對中風病之病因病機有了大轉變。劉完素、李東垣、朱丹溪等醫家分別提出了對中風的不同認識。劉完素采擷《素問》病機十九條而創“六氣皆從火化”首創火熱中風說，認為“心火暴甚，水不制火”為中風病之發生主因。李東垣則提出正虛本病之中風說，《醫學發明》載：“故中風者，非外來風邪，乃本氣病也。凡人年逾四旬，氣衰者，多有此疾。”朱丹溪於《丹溪心法‧中風》載：“多是溼土生痰，痰生熱，熱生風也。”認為中風病主痰溼。另外薛己論中風為“陽化內風”；張子和論中風為“風從火化”。大體來說，唐宋之後外風論受質疑，尤其金元時期之醫家已確立中風內風論(58-61)。. (3).明清時期此時內因學說在中風病病因的認識中已處於主導的地位。明‧張景岳著《景岳全書》創“非風”論，明確指出中風非外感風邪所致，而是內傷裏証。葉天士認為中風為“陽化內風”；吳謙認為是風、火、痰所致；王清任《醫林改錯》則云：“元氣既虛，必不能達于血管，血管必停留而瘀”，創氣虛血瘀之說。清‧張伯龍著《類中秘旨》記載“血衝腦氣筋，謂人身知覺專由于腦”，得出“水火內動，肝風上揚，血氣並走于上”的結論；張山雷則對外風說進行全盤否定，強調中風之病機為內風暴動，血氣上衝于腦；張鍚純《醫學衷中參西錄》對氣血衝腦說做了進一步的闡釋，提出“肝中所寄相火，掀然暴發，挾氣血而上衝腦，以致昏厥”。明 6.

(16) 清時期中風病因病機學說各家紛立，中西互參，此時中風內風論深化豐富，且已發展到一個全面的層次(50)(55)。. 2-1-2.治則根據統計，於中風的症候分類中，氣虛血瘀型佔了絶大部分約佔中風分型之 73%以上，氣虛血瘀為缺血性腦中風之主要原因(62)。因而活血化瘀法治療缺血性腦中風為傳統中醫之最主要治則。活血化瘀藥物當歸、川芎常使用於治療缺血性腦中風，現代醫學研究發現活血化瘀中藥具有擴張血管、改善腦梗塞區血液循環、保護腦神經細胞、清除自由基、抗脂質氧化及抑制腦神經元之凋亡等(62-65)。. 2-2.缺血性腦中風之現代研究 2-2-1.臨床表現急性腦缺血損傷包括有突然產生神經學缺陷，通常包含有言語困難 (dysphasia)、構音困難(dysarthria)、半側盲(hemianopia)、虛弱(weakness)、運動失調(ataxia)、感覺喪失(sensory loss)及表情莫然(neglect)，這些症狀一般呈現單側，病患意識正常或輕微呈現模糊。這些症狀呈現嚴重程度通常和病患的年齡、是否伴隨有心臟疾患和糖尿病以及和梗塞面積大小有密切關聯(5)。據臨床統計嚴重之中大腦動脈阻塞佔所有缺血性腦中風病患近 10%，而這些病患通常伴有程度不同之腦水腫及高死亡率，臨床除了呈現上述症狀外亦有眼睛歪斜(eye deviation)及因腦疝而導致神經學症狀逐漸惡化。臨床發現腦疝明顯產生於腦中風第二天至第四天之間 (66). 。根據統計西方社會缺血性腦中風三十天之死亡率大約在 10 至 17%. 之間(5)。. 7.

(17) 2-2-2.病理機轉缺血性腦中風主要由腦細胞能量耗盡(energy depletion)到細胞死亡之一連串病理事件，其中病理因子包括有細胞間興奮性胺基酸、自由基的生成及炎症反應(5)。在腦缺血數分鐘內，梗塞核心之腦血流急遽下降導致細胞形成永久性缺氧去極化(anoxic depolarization)。而在細胞能量耗竭及離子恆定崩解下於梗塞核心區形成細胞壞死(necrosis)；另一方面，圍繞在梗塞核心周遭的是半陰影區(penumbra)主要是藉由側支循環部分維持細胞的代謝(67)。當血流再次流入缺血梗塞區時，證據顯示此時產生一連串再灌流損傷，其中包括微小血管中活化白血球及巨噬細胞之聚集、黏附及滲透，血小板的聚集以及黏附細胞的顯著表現。隨後形成腦血管障壁(blood-brain barrier)損傷，促發細胞激素(cytokines)、一氧化氮(NO)、 cyclooxygenase 及自由基的產生(67)。進一步研究得知再灌流損傷誘發黏附細胞如 ICAM-1、P-selectin 及 E-selectin 顯現於內皮細胞，而活化白血球表面接上 integrins 如 LFA (CD11a/CD18)及 Mac-1 (CD11b/CD18)進行滾動、黏附至內皮細胞，而在腦缺血-再灌流損傷數小時中活化白血球聚集於腦梗塞區微小血管，進一步結合紅血球、纖維蛋白(fibrin)及血小板形成栓塞子(plugging)阻塞微小血管血流，於再灌流期間形成”no-reflow” 現象惡化腦梗塞損傷 (67)。活化白血球進入腦梗塞區吞噬壞死細胞碎片 (necrotic debris)過程中釋放大量細胞激素(cytokines)、chemokines 及自由基進一步惡化神經細胞，而在這炎症反應過程中 NF-κB 轉錄因子於炎症基因表達及調控上扮演相當重要的角色(68)(69)。另外前面提及在腦缺血數分鐘內梗塞核心細胞能量耗竭及細胞膜缺氧去極化，導致細胞內鈉離子的堆積，大量水分子進入細胞，形成細胞內水腫(intracellular edema)；此外腦血管障壁損傷致使血管壁通透性增加，管腔內蛋白質及液體流出管腔外組織間隙，形成血管性水腫(vasogenic edema)。而導致腦血管障壁 8.

(18) 損傷的切確原因仍不完全了解，目前研究指出和一些病理因子如 aquaporins、自由基、proteases、炎症細胞、bradykinin、血管內皮成長因子及 NO 的生成有密切關聯(66)。. 2-2-3.臨床治療目前已知臨床治療急性缺血性腦中風大致有兩類藥物：血栓溶解藥物 (thrombolytics)及抗血小板(antiplatelet)。而 tissue plasminogen activator (t-PA)是目前臨床唯一證實有效治療急性腦梗塞之血栓溶解劑，但 t-PA 在臨床應用上有嚴苛的限制及很窄的治療窗口(time window)，一般需在梗塞發生後三小時內給予 (1)(2)(5)(67) 。而目前臨床使用抗血小板藥物有 aspirin 、 ticlopidine 、 clopidogrel 、及 extended-release dipyridamole (ER-DP)。於缺血性腦中風發生 48 小時內使用 aspirin，且連續使用 2 星期可降低續發缺血性腦中風，據統計 aspirin 可降低 15-25%再發中風的機率(3)(5)(6)。另外 anticoagulation 藥物如 warfarin 可於心因性栓塞缺血性腦中風(cardioembolic ischemic stroke)、transient ischemic attack (TIA)或陣發性心房顫動(paroxysmal atrial fibrillation)等特殊情況下給予可避免病患續發中風(secondary stroke)(3)(6) ，而預防續發性腦中風 aspirin 優於 warfarin(6)。在栓塞中風模型中，血栓溶解劑如 t-PA 和神經保護藥物如 NMDA 受體拮抗劑 MK801 結合治療可同時降低梗塞面積及改善神經學症狀(68)。至於腦水腫，目前臨床上常用的高滲透藥物(hyperosmotic agents) 為 mammitol 和 glycerol(66)(68) 。在局限性腦缺血動物實驗中，低溫 (hypothermia)治療可顯著降低梗塞面積及改善神經學表現。在動物實驗機轉研究中，發現低溫治療可有效降低細胞能量耗竭、腦-血管障壁損傷、腦水腫、自由基產生、興奮性胺基酸釋放、炎症反應及細胞凋亡 (5)(66)(70). 。臨床一般急性腦中風低溫治療為 32ºC 至 35.5ºC 之間，持續時 9.

(19) 間為 4 小時(70)，臨床發現低溫治療開始於中風發生 6 小時內，且持續超過 120 小時可降低腦水腫致發之梗塞損傷(66)。另外在實驗模型中腦缺血損傷後神經再生(neurogenesis)因子如 epidermal growth factor (EGF)、 brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 及 glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)，以及 ICAM-1、E-selectin 和 P-selectin 拮抗劑可有效降低腦缺血損傷(2)(67)(71)。以中藥治療臨床缺血性腦中風方面，目前以紫雲英(Milk vetch)、脈絡寧(Mailuoning)、銀杏(Ginkgo biloba)、川芎嗪(Ligustrazine)、丹參(Danshen agents)、血塞通(Xuesetong)、葛花素(Puerarin)及刺五加 (Acanthopanax)等有較多的研究及較多的實驗病人數，但針對治療缺血性腦中風療效而言，這些中藥仍缺乏有系統的分析及客觀有力的佐證(72)。. 2-3.阿魏酸之現代研究 2-3-1.前言阿魏酸(ferulic acid; FA)來自於多種植物的一種酚酸，在細胞壁中與多糖和蛋白質結合成為細胞壁骨架。阿魏酸為阿魏、當歸及川芎主要成分之一，此外亦存在於木賊、升麻、梓白皮、芍藥、蜂膠及酸棗仁等中藥，阿魏酸在當歸中的含量豐富，且大多數從當歸中提取，因而又稱為當歸素(73-76)。另外食物、水果及蔬菜如米糠、蕃茄及玉米亦普遍存在有阿魏酸 (77)，因而阿魏酸可說是人類飲食中含量最豐富的酚酸抗氧化物之一 (78). ，進一步研究發現在穀類(cereals)食物中阿魏酸最普遍存在的形態是. 阿魏酸糖酯(ferulic acid sugar esters)，體外研究發現亦具強烈抗氧化能力 (79). 。. 2-3-2.阿魏酸之理化性質 10.

(20) 阿魏酸化學名為 3-甲氧基-4-羥基肉桂酸 (4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid)，結構式如下：. 阿魏酸分子式為 C10H10O4，分子量為 194.18，結構式上有順式和反式兩種產物，順式(cis)為黃色油狀物，反式(trans)為斜方針結晶，一般使用大多為反式。熔點為 170~171.5 ºC，阿魏酸見光易分解，有強抗氧化性(76)。. 2-3-3.阿魏酸及其衍生物之體內代謝 Rondini 等(80)以純阿魏酸餵食 SD 大鼠，發現餵食後半小時血漿中主要呈現 FA-sulfate 結合態衍生物(約 50%)，而 1.5 小時後尿液中阿魏酸排除達最大量，且以 FA-sulfate 結合態為主要排出形態(約佔 40%)。結果可知純阿魏酸可在大鼠體內快速被吸收，且在尿液排出前其主要代謝形態為 FA-sulfate 衍生物。Zhao 等(79)分別餵食大鼠阿魏酸及阿魏酸酯類，發現阿魏酸組之大鼠血漿有較高之純阿魏酸及結合態阿魏酸 (FA-glucuronide、FA-sulfate 及 FA-sulfoglucuronide)含量，但在血漿中持續存在的時間卻比阿魏酸酯類組短。此結果顯示阿魏酸及阿魏酸酯類在體內之生體利用率(bioavailability)主要是取決於糖體(saccharide moiety) 的存在與否。Zhao 等(78)研究發現阿魏酸可被大鼠胃快速吸收，吸收之阿魏酸則大部分運送到肝臟進一步代謝成結態如 FA-sulfate 、 11.

(21) FA-glucuronide 及 FA-sulfoglucuronide，最終至腎以結合態排泄掉。 Rondini 等(81)將 SD 大鼠分組，每日分別餵食大鼠含有純阿魏酸(5.15 mg FA/kg body weight (bw))及小麥麩(wheat bran) (4.04 mg FA/kg bw)食物持續 10 天，發現小麥麩組比純阿魏酸組血漿中存在更強之抗氧化活性。進一步分析發現阿魏酸以 arabinoxylans bonds 存在於食物中，食入體內 24 小時後可增加其存在組織器官之含量，且尿液排除阿魏酸量亦顯著下降。結果顯示小麥麩中存在之阿魏酸有較好的生體利用率，可有效地保護器官組織對抗包括初始自由基攻擊所產生之病理損傷。另一方面 Adam 等(82)研究發現阿魏酸存在榖類中反而具較低之生體利用率，可能是因所含纖維質(fiber)鍵結 arabinoxylans 及 ligins 阻礙代謝所致。. 2-3-4.阿魏酸藥理作用 (1).抗氧化及清除自由基氧自由基攻擊細胞重要成分包括蛋白質、酶及核酸，造成酶活性喪失，影響受體及細胞膜離子通道，引發 DNA 鍵斷裂，最終導致細胞壞死或凋亡。阿魏酸結構中有酚羥基，具有抗氧化活性，為清除自由基之功能基團，對於過氧化氫(H2O2)、超氧自由基(O2‫、)־‬氫氧自由基(OH‫)־‬ 及過氧化亞硝基(ONOO‫)־‬均有強烈的清除作用(73)(83-85)。Rukkumani 等(86) 每日餵食大鼠 20%酒精(7.9 g/kg bw)及高脂食物(15% heated sunflower oil) (內含大量多元不飽和脂肪酸)持續 45 日，結果發現血漿中氧化標記：硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substance)、過氧化氫(hydroperoxides)以及銅和鐵蛋白(ferritin)顯著上升，另一方面抗氧化酶包括 superoxide dismutase、catalase、glutathione peroxidase 則明顯下降。治療組(分 2 組)則除了每日餵食與造模組相同食物外，另分別餵食阿魏酸 20 mg/kg bw 及 40 mg/kg bw，發現治療組可有效降低血漿中氧化標記 12.

(22) 含量及提升抗氧化酶表現。結論為阿魏酸可有效地保護組織系統對抗酒精及多元不飽和脂肪酸所致發之氧化損傷(oxidative stress)。張璇等 (87) 將 SD 大鼠結紮兩側頸總動脈 60 分後鬆綁進行再灌流致發視網膜缺血再灌流損傷，治療組為再灌流剛開始時及每 24 小時鼠尾靜脈注射阿魏酸(40 mg/kg bw)，發現造模組視網膜組織 malondialdehyde 含量於再灌流 1-24 小時顯著上升，而 superoxide dismutase 於 6-24 小時明顯下降。阿魏酸治療組則於再灌流 6-24 小時間可顯著降低 malondialdehyde 及提升 superoxide dismutase 表現，顯示阿魏酸於大鼠視網膜再灌流期間可抑制自由基及細胞膜脂質過氧化的產生。Sudheer 等(88)於大鼠周邊血中分離出淋巴球(lymohocytes)加入 3 mM 尼古丁暴露 1 小時，治療組(分 5 小組) 同時間加入阿魏酸劑量分別為 10、50、100、150 及 300 µM，得知 150 µM 效用最顯著。進一步分析發現造膜組顯著提升脂質過氧化指標: thiobarbituric acid reactive substance 及 hydroperoxide、DNA 之損傷，同時顯著降低了內生性抗氧化酶: superoxide dismutase (SOD)、catalase (CAT)、glutathione peroxidase (GPx)、reduced glutathione (GSH)、Vitamin A、E 及 C。而阿魏酸治療組(150 µM)則可有效降低大鼠周邊血淋巴球之脂質過氧化、DNA 損傷及提升內生性抗氧化酶之含量。研究報告指出以雌 albino Wister 大鼠給予皮下注射尼古丁(nicotine) 劑量為 2.5 mg/kg bw，連續注射 22 週產生尼古丁致發之組織損傷，治療組(分三小組)則同一時間以胃管每日給予不同劑量 10、20 及 40 mg/kg bw 連續 22 週。分析血中乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase) 、鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase)及組織(肺、肝及腎)之脂含量(包含 cholesterol、free fatty acid、triglycerides 及 phospholipids)，得知造模組顯著上升，而阿魏酸 20 mg/kg bw 治療組則顯著調降了上述之損傷標記。進一步分析發現阿魏酸可藉由抗氧化及抗高血脂效用來抑制由尼古丁所誘發之組織損傷(89)；而 13.

(23) 另一研究亦發現於尼古丁致發 Wistar 大鼠組織毒性模型中(每天皮下注射尼古丁劑量為 2.5 mg/kg bw，一週 5 天，連續注射 22 週)，而治療組(分二小組)則同一時間分別餵食阿魏酸劑量為 20 mg/kg bw 及 N-乙醯半胱氨酸(N-acetylcysteine)劑量為 150 mg/kg bw。結果造模組於血液、肺及肝等組織發現脂質過氧化表現顯著上升，而內生性 superoxide dismutase、catalase、glutathione peroxidase 及 reduced gluthione 含量均顯著下降，另外在肺及肝組織則顯著表現 cyclooxygenase-2 及 NF-κB。阿魏酸及 N-乙醯半胱氨酸治療組則可有效地降低血液、肺及肝之脂質過氧化標記：lactate dehydrogenase 及 alkaline phosphatase，降低血中 DNA single stranded break 及 micronuclei 含量，同時抑制了肺、肝組織之 cyclooxygenase-2 及 NF-κB 表現，此外亦提升了血液、肺及肝之內生性抗氧化酶之含量。可知阿魏酸可藉由調降脂質過氧化、炎症反應、DNA 損傷及提升內生性抗氧化酶之效用對抗尼古丁所致發之組織損傷(90)。. (2).中樞神經保護作用 Wang 等(48)以管腔內阻塞 SD 大鼠之中大腦動脈 2 小時後進行再灌流為腦缺血-再灌流損傷模型，治療組則於缺血期間腹腔注射阿魏酸(100 mg/kg bw)，再灌流 2 小時明顯降低腦缺血損傷，並於再灌流 6 小時到 72 小時間顯著提升 extracellular signal regulated kinase (ERK)陽性細胞於梗塞區表現，推論阿魏酸可能藉由提升 ERK 之表現達到降低腦缺血損傷之效用。Wenk 等(91)以 lipopolysaccharide (250 ng)打入大鼠第四腦室致發 chronic neuroinflammation 為模型，造模組於 14 天後於大鼠顳葉 (temporal lobe)中微膠細胞(microglia)顯著活化。治療組則每日皮下注射阿魏酸(30 mg/kg bw)持續 14 天，發現可顯著抑制微膠細胞活化，此外阿魏酸亦具有對抗 lipopolysaccharide 致發之氧化損傷及清除氫氧 14.

(24) (hydroxyl radical)自由基之效用。Jin 等(47)以 amyloid β25-35 (Aβ) (10 µl)注射 SD 大鼠腦室致發 neurotoxicity 為模型，7 天後海馬迴 CA 區內星狀細胞(astrocyte)明顯活化及滲透，此外 IL-1β、IL-1β mRNA、p38 MAPK 亦顯著表現，而 phospho-ERK 及 phospho-Akt/PKB 則顯著下降。造模前 3 星期每日餵食阿魏酸劑量 50、100 及 250 mg/kg bw(分 3 組)，造模後再持續餵食 1 星期可有效抑制星狀細胞活化及 IL-1β、IL-1β mRNA、p38 MAPK 之顯現，另一方面則提升了 phospho-ERK 表現。可知阿魏酸可藉由抑制 p38 MAPK 及提升 phospho-ERK 表現路徑，於 Aβ 致發腦損傷模型中具有神經保護效用。Wang 等(49)以管腔內阻塞 SD 大鼠中大腦動脈 2 小時後進行再灌流為腦缺血-再灌流損傷模型，治療組則於阻塞前 2 小時給予腹腔注射阿魏酸(100 mg/kg bw)，再灌流 24 小時可顯著改善神經學缺陷及抑制 postsynaptic density-95 (PSD-95)於皮質及紋狀體梗塞核心區之表現，而 PSD-95 與離子通道、神經突觸活動及細胞內訊息傳遞調節有關，腦缺血後 PSD-95 促發神經細胞 excitotoxicity 導致細胞死亡，推論阿魏酸可藉由抑制 PSD-95 表現達到腦缺血後神經保護之效用。姜科聲等(92) 以 ICR 小鼠雙側頸總動脈結紮 30 分再灌流 60 分為腦缺血-再灌流損傷模型，治療組則以阿魏酸(800 mg/kg bw)於缺血前連續灌胃七天，於再灌流 1 小時發現可顯著降低腦組織 malondialdehyde 含量及提升 superoxide. dismutase. 表現，可知阿魏酸藉由降低. malondialdehyde/superoxide dismutase 比值，抑制氧化自由基的損傷及其引發之脂質過氧化反應。周琴等(93)(94)以管腔內阻塞 Wistar 大鼠之中大腦動脈 2 小時後進行再灌流為腦缺血-再灌流損傷模型，治療組(分 2 組)於再灌流後分別即刻給予腹腔注射 25%當歸注射液(20 ml/kg bw)、阿魏酸 (100 mg/kg bw)，得知當歸組與阿魏酸組於再灌流 7 天及 14 天均可顯著改善神經學行為、降低腦梗塞體積及腦含水量(腦水腫)，且發現當歸與 15.

(25) 阿魏酸效用相近，推測阿魏酸可能是當歸治療腦缺血再灌流損傷之主要有效成分。. (3).心血管保護作用 Fu 和 He(95)於體外心肌細胞先行前置缺氧(preconditioning) (先缺氧 30 分再給氧 30 分，重覆進行 3 次)，接著缺氧 3 小時，再給氧 1 小時為實驗模型，治療組為前置缺氧後缺氧造模前 20 分鐘給阿魏酸(最終濃度 1.68 mmol/L)，歷經缺氧 3 小時後再度給氧，1 小時後可明顯抑制 lactate dehydrogenase、creatine kinase、malondialdehyde，同時提升 superoxide dismutase 及 glutathione peroxidase 之表現。Yogeeta 等 (96) 施予大鼠 isoproterenol (ISO) (150 mg/kg bw, i.p.)二天造成心肌壞死為模型，發現造模組心肌及血清明顯提升溶小體水解蛋白酶(lysosomal hydrolases) (包括 β-D-glucuronidase、β-D-galactosidase、β-D-N- acetyl glucosaminidase、acid phosphatase 及 cathepsin-D)，同時提升血漿中乳酸(lactate)濃度及心肌細胞膜磷酸酶(phosphatases) (包括 Na+-K+ ATPase、Ca2+ ATPase 及 Mg2+ ATPase)。而治療組則於造模前給予餵食阿魏酸(20 mg/kg bw)及抗壞血酸 (ascobic acid) (80 mg/kg bw)連續 6 天，得知阿魏酸及抗壞血酸協同治療可藉由抗氧化損傷效用，降低心肌溶小體水解蛋白酶及細胞膜磷酸酶之含量，進一步分析得知阿魏酸及抗壞血酸可經由直接清除自由基機轉，來達到心肌梗塞壞死後之保護效用。另一研究亦給予 ISO (150 mg/kg bw, i.p.)二天致發大鼠心肌毒性，造模組顯著降低粒腺體呼吸鏈酶(NADH dehydrogenase 及 cytochrome c oxidase)活性、tricarboxylic acid cycle enzymes、粒腺體抗氧化酶及粒腺體磷脂質(phospholipids)，另一方面則顯著增加粒腺體脂質過氧化及粒腺體內胆固醇、三酸甘油脂及 free fatty acids 含量。而治療組則於造膜前給予餵食阿魏酸(20 mg/kg bw)及抗壞血 16.

(26) 酸(ascobic acid) (80 mg/kg bw)連續 6 天，則可顯著降低上述異常，復元心肌細胞損傷後之粒腺體功能(97)。Yogeeta 等(98)以上述相同大鼠心肌損傷模型，得知造模組血清及心肌組織之三酸甘油脂、總胆固醇、游離氨基酸(free fatty acids)及游離、酯化胆固醇均顯著增加，此外降低心肌組織之磷脂質及脂質代謝酶(lipid metabolizing enzymes)。而造膜前給予餵食阿魏酸(20 mg/kg bw)及抗壞血酸(ascobic acid) (80 mg/kg bw)連續 6 天，則可顯著改善上述異常。綜上可知阿魏酸及抗壞血酸對 ISO 致發心肌細胞脂質代謝異常具有保護效用。. (4).肝臟保護作用 Srinivasan 等 (99) 以 CCl4 (3ml/kg bw)皮下注射大鼠致發肝損傷為模型，發現造模組肝細胞活化指數 (alanine transaminase 、 aspartate transaminase、alkaline phosphatase 及 γ-glutamyl transferase)及脂質過氧化指標(thiobarbituric acid reactive substance、hydroperoxides、nitric oxide 及 protein carbony content)分別於血漿及肝組織中顯著増加，另一方面抗氧化酶(superoxide dismutase、catalase、glutathione peroxidase 及 reduced glutathione)則於肝組織內顯著下降。治療組則每日餵食阿魏酸(20 mg/kg bw)連續 90 天發現可有效地降低血漿中肝細胞活化指數及肝組織中之脂質過氧化指標，另可明顯恢復肝組織內抗氧化酶含量。可知阿魏酸於 CCl4 致發肝細胞損傷模型中扮演明顯抗氧化效用。Srinivasan 等(77)以分離大鼠肝細胞暴露至 γ 射線(γ-radiation) 1 小時誘發損傷為實驗模型，發現肝細胞 DNA 損傷隨著 γ 射線暴露劑量(1、2 及 4 Gy)增加而加重，此外硫代巴比妥酸反應物亦顯著增加，另一方面 reduced glutathione、 Vitamin A、E、C、尿酸及藍包漿素(ceruloplasmin)則明顯下降。給藥組(分三組)則於造模前分別加入阿魏酸 1、5 及 10 µg/ml 可顯著抑制硫代巴比 17.

(27) 妥酸反應物的產生及 DNA 損傷，另外可顯著提升抗氧化酶(reduced glutathione) 、Vitamin A、E、C、尿酸及藍包漿素之含量，其中最有效劑量為 10 µg/ml。結果得知事先給予阿魏酸可保護肝細胞對抗 γ 射線所引發之損傷，推測阿魏酸可做為放射線治療中有效之放射保護劑。. (5).胃腸消化道保護作用 Dong 等(100)以 8% 醋酸灌腸致發 SD 大鼠結腸炎(colitis)為模型，得知造模組結腸組織之 colon mucosa damage index (CMDI)、histopathological score (HS)、myeloperoxide (MPO)活性、malondialdehyde (MDA)、nitric oxide (NO)、prostaglandin E2 (PGE2)、thromboxane B2 (TXB2)、inducible nitric oxide synthase (iNOS)、cyclooxygenase-2 (COX-2)及 NF-κB 顯著上升，而 superoxide dismutase 活性則明顯下降。阿魏酸治療組(3 組)則分別每日灌腸阿魏酸 200、400 及 800 mg/kg bw 持續 7 天則顯著改善上述異常指標，特別是 400 及 800 mg/kg bw 更具療效。結果得知結腸內給予阿魏酸可藉由抗氧化、抑制花生四烯酸(arachidonic acid)代謝及 NF-κB 表現改善醋酸灌腸致發之結腸炎。Badary 等 (101) 給予大鼠腹腔注射 cisplatin (2.5-20 mg/kg bw)致發劑量依賴性(dose-dependent manner)胃排空遲緩為模型。治療組為造模前餵食 50-200 mg/kg bw 阿魏酸，得知可顯著加速腸胃運送及胃排空，且療效呈劑量依賴性。分析發現阿魏酸可藉由增加內生性前列腺素(prostaglandins)刺激腸胃蠕動。. (6).抗癌病變作用 Kawabata 等(102)以每星期皮下注射 azoxymethane (AOM) (15 mg/kg bw) 一次，連續 3 星期致發 F344 鼠結腸癌病變(carcinogenesis)為模型。治療組(分 2 組)則造模期間分別餵食含有阿魏酸 250 及 500 ppm 之食物持續 18.

(28) 5 星期，發現結腸中異常腺窩病灶(aberrant crypt foci；ACF)顯著下降，阿魏酸 500 ppm 組進一步降低了結腸每平方公分之 ACF 數。持續餵食至 35 星期，得知阿魏酸治療組(50 及 500 ppm)顯著抑制了結腸癌發生率。進一步研究得知餵食阿魏酸 100 mg/kg bw 可顯著提升大鼠肝及結腸黏膜 phaseⅡ去毒酶(detoxifying enzyme)：quinone reductase (QR)表現，由上推測阿魏酸可藉由増加去毒酶表現抑制 AOM 所誘發之結腸癌病變。Cione 等(103)取出大鼠睪丸組織，萃取分離粒腺體分別以 10、50 及 100 µM 之阿魏酸溶液培養，得知阿魏酸培養組 10-25 分鐘後呈劑量依賴性促發線粒體通透性轉運孔(mitochondrial permeability transition；MPT) 運作，1 小時後促使 cytochrome c 產生，24 小時後促發 active caspase 3 的表現。得知阿魏酸可於睪丸組織細胞誘發粒腺體途徑(mitochondrial pathway)之細胞凋亡，由此推測阿魏酸可能具備對抗睪丸細胞癌症之潛力。. (7).治療糖尿病作用 Sri Balasubashini 等(104)以 streptozotocin (STZ) (40 mg/kg bw)腹腔注射致發糖尿病大鼠為模型，其血糖、血漿三酸甘油脂、游離脂肪酸、胆固醇及磷脂質(phospholipids)均顯著上升，阿魏酸治療組(分 2 組)分別給予每日餵食阿魏酸 10 及 40 mg/kg bw 持續 45 天，得知有效地降低糖尿病大鼠高血糖及高脂血(hyperlipidemia)，且低劑量(10 mg)比高劑量(40 mg) 更具療效。Thyagaraju(105)於 STZ (60mg/kg bw, ip)致發糖尿病鼠模型中，給予每日餵食阿魏酸 50 mg/kg bw，連續 4 週。結果發現造模組大鼠睪丸細胞(包括細胞質及粒腺體)和肝細胞顯著提升了脂質過氧化及活性氧族群的表現，而阿魏酸組則可有效地降低由糖尿病所致發之氧化損傷 (oxidative stress)。 19.

(29) (8).抗細胞凋亡作用鄭志鋒等(106) 先將 Wistar 大鼠雙側椎動脈結紮 48 小時，雙側頸總動脈夾閉 2 分鐘後 24 小時再次夾閉頸總動脈 10 分鐘進行缺血預處理，再以四血管阻斷法(4-vessel occlusion)結紮雙側頸總動脈 30 分鐘為全腦阻塞 (global ischemia) 模型，治療組則於缺血預處理 (ischemia preconditioning)後，造模前 30 分鼠尾靜脈注射阿魏酸(200 mg/kg bw)，缺血七天後可於皮質梗塞區及海馬迴 CA1 區顯著抑制 Fas 陽性細胞及 caspase 8 蛋白的表現，推測阿魏酸可經由抑制 Fas、caspase 8 之細胞凋亡路徑達到神經保護之效用。曲喜英及祝其鋒(85)以過氧化氫(hydrogen peroxide；H2O2) (200 nmol/L)加入 PC12 細胞培養 8 小時致發細胞凋亡為模型，治療組則於過氧化氫損傷模型前 1 小時給予阿魏酸(50-250 µmol/L) ，可有效抑制前列腺凋亡反應基因 -4(prostate apoptosis response；Par-4)及 NF-κB(p65)表現，達到提高細胞存活的效應。彭華等 (107). 以管腔內阻塞 Wistar 大鼠中大腦動脈 2 小時後進行再灌流為急性局. 限性腦缺血-再灌流損傷模型，治療組則於中大腦動脈阻塞的同時及之後二天同時間分別腹腔注射阿魏酸(0.1mg/kg bw) (共 3 次)，再灌流 72 小時於梗塞區可顯著降低凋亡因子 Bax，同時提升抗凋亡因子 Bcl-2 的表現，研究顯示阿魏酸可藉由提升 Bcl-2/Bax 比率途徑，達到抑制凋亡之效用。 Ke 等(108)將兔之腎下主動脈(infrarenal aorta)夾住阻斷血流 40 分鐘後鬆開進行再灌流 7 天為脊髓缺血-再灌流損傷模型，治療組則於造模前 15 分鐘靜脈注射阿魏酸(50 mg/kg bw)，發現阿魏酸組可於再灌流 1 小時及 7 天顯著抑制脂質氧化標記 malondialdehyde 及凋亡因子 Bax 之表現，同時明顯提升 superoxide dismutase 及抗凋亡因子 Bcl-2。. 20.

(30) (9).抗內皮素-1 作用內皮素(endothelin-1；ET-1)是血管內皮細胞所分泌一種強有力之血管收縮肽，由 21 個氨基酸所組成。內皮素(ET-1, ET-2, ET-3)是一家族的 peptide，而 ET-1 為已知人體中最強有力的血管收縮物。於腦梗塞中，高濃度之 ET-1 引發強烈持久之血管收縮，促發血管內皮平滑肌增生，使血管腔進一步縮小狹窄，加重微循環障礙，惡化腦梗塞損傷；另外， ET-1 亦可致發谷氨酸(glutamate)等興奮性神經傳遞物質釋放增加，形成 excitotoxicity，參與缺血性腦損傷神經細胞毒素的產生(109-113)。江文靜等 (114). 以管腔內梗塞中大腦動脈為模型，治療組於缺血前 12 小時及缺血後. 15 分鐘分別腹腔注射阿魏酸(100 mg/kg bw)，於缺血後 2 小時顯著降低 ET 及明顯提升降鈣素基因相關肽 (calcitonin gene related peptide ； CGRP)，由此推測阿魏酸可藉由提升 CGRP 擴張腦血管及抑制 ET 之血管收縮，達到腦梗塞區增加血流灌注之效用。陳莉芬等(115) 於腦微血管內皮細胞(BMEC)更換培養液後立即於入內含 95% N2 和 5% CO2 混合氣體培養室培養 12 小時為缺氧模型，給藥組則於更換培養液時加入阿魏酸(終濃度為 100 mg/L)，2 小時後於入內含 95% N2 和 5% CO2 混合氣體之培養室培養 12 小時，發現阿魏酸給藥組可顯著抑制 ET-1 及 ET-1 mRNA 的表現。. 21.

(31) 第三章材料與方法. 3-1.實驗動物本研究採用 Sprague Dawley (SD)雄性大鼠，體重介於 300-350 公克之間，購自國科會動物中心。實驗鼠飼養於中國醫藥大學動物中心，飼養室濕度保持在 55 ± 5%，室溫維持在 22 ± 2ºC 之間，且一天中光照-黑暗各 12 小時。所有老鼠實驗前一天禁食但可自由喝水。本研究所有實驗過程與步驟均遵循中國醫藥大學動物中心委員會之規範守則。. 3-2.實驗室藥品與儀器 (1) Chloral hydrate (Merck, Germany) (2) Hematoxylin (Merck, Germany) (3) 0.9% NaCl (永豐化學工業股份有限公司，台灣) (4) Paraformaldehyde (Merck, Germany) (5) Sucrose (GERBU, Biotechink GmbHD-69251, Gaiberg) (6) Heparine (南光化學製藥股份有限公司，台灣) (7) PE-50 tube (晶龍科技儀器有限公司，台灣) (8) EDTA tube (BD Franklin Lakes NJ, USA) (9) 3-0 nylon monofilament (晶龍科技儀器有限公司，台灣) (10) KUBOTA 6900 (KUBOTA Co., Japan) (11) Blood pressure monitor (Columbus instruments, BP-2, USA) (12) Rectal thermometer (晶龍科技儀器有限公司，台灣) (13) Cryostat (SHANDON, UK) (14) Sterotactic flame (Stoelting Co., USA ). 22.

(32) 3-3.中大腦動脈阻塞模型本實驗採用管腔內套繩(intraluminal suture)阻塞中大腦動脈如先前所述(116)。簡要敘述，老鼠以氯合水醛(chloral hydrate, 400 mg/kg bw)腹腔注射麻醉，PE-50 管插入右股動脈偵測心跳及血壓，抽取股動脈血進行血液氣體(blood gas)及血糖(blood sugar)分析。另一 PE-50 管則插入股靜脈可進行阿魏酸(FA) (Sigma, Cat:12870-8 , USA)之注射給藥。接著進行頸部中切暴露頸總動脈(common carotid artery)及內頸動脈(internal carotid artery)，將翼顎動脈(pterygopalatine artery)分支處綁緊，將尖端以火燒鈍且覆蓋 poly-L-lysine (Sigma, USA)之 3-0 尼龍套繩從外頸動脈(external carotid artery)經由頸總動脈進入內頸動脈達 20~25 公釐深處，阻塞中大腦動脈基部血流。中大腦動脈阻塞 90 分鐘後，將 3-0 尼龍套繩緩慢抽出進行再灌流。再灌流 24 小時，老鼠進行神經學行為評估。而在中大腦動脈阻塞前，我們於右大腦表面中大腦動脈血流分布處(囪門側面至 2.5 mm 及囪門後至 2.0 mm 處)磨骨鑽洞，並以都卜勒血流測量儀(DRT4, Moor Instruments Inc. Wilmington, USA)偵測梗塞區表面之中大腦動脈血流，都卜勒血流測量儀呈現血流由阻塞前 500 單位以上降至阻塞後 100 單位以下即確定中大腦動脈阻塞成功，另外整個缺血過程老鼠均以電熱毯加熱保溫，且肛溫維持在 37.0±0.5ºC 之間。. 3-4.實驗步驟本研究分成第一階段及第二階段。 3-4-1.第一階段又分為實驗 A、B 和 C 如下所述： 3-4-1-A.實驗 A (1).動物分組 SD 雄性大鼠分成六組，每組 6 隻如下。1) sham 組：右頸總動脈及 23.

(33) 內頸動脈暴露，但中大腦動脈並未阻塞；2) control 組：中大腦動脈阻塞 90 分鐘，再灌流 24 小時；3) FA60 組：同 control 組，但於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射 60 mg/kg (bw) FA；4) FA80 組：同 FA60 組，但於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射 80 mg/kg FA；5) FA100 組：同 FA60 組，但於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射 100 mg/kg FA；6) DFA 組：同 control 組，但於中大腦動脈阻塞後 30 分鐘靜脈注射 100 mg/kg FA。. (2).生理指標偵測動脈血液(包括有 pH、 pO2 及 pCO2)、血糖、平均動脈壓(mean arterial blood pressure; MABP)和心跳速率(heart rate)分別於中大腦動脈阻塞前 10 分鐘、缺血後 90 分鐘及再灌流 10 分鐘偵測。. (3).圖示中大腦動脈阻塞模型. 24.

(34) (4).神經學狀態評估再灌流 24 小時後，每隻老鼠由不知實驗分組狀況之研究人員進行神經學狀態評估。神經學缺陷分數(neurological deficit-score)範圍 0 至 18 分，包括有運動(motor)、感覺(sensory)、平衡(balance)及反射(reflex)如前所述(117)。簡要敘述：運動試驗包括將老鼠放置在地板上(不能走直線記錄為 1 分; 向麻痺側繞圈圈記錄為 2 分; 轉向麻痺側不能行走記錄為 3 分)及抓起老鼠尾巴(左前肢彎曲記錄 1 分;左後肢彎曲記錄 1 分;頭側彎超過 10 度記錄 1 分)。感覺試驗包含有鬍鬚觸覺試驗(缺損記錄 1 分)及前腳抓力試驗(缺損記錄 1 分)。橫樑平衡試驗包括：老鼠停在橫樑一側記錄為 1 分；如停在橫樑一側有一腳下垂無法抓住橫樑則記錄為 2 分；如停在橫樑一側有二腳下垂無法抓住橫樑則記錄為 3 分；試圖停留在橫樑上但最終掉下來(停留在橫樑時間超過 40 秒) 記錄為 4 分；試圖停留在橫樑上但最終掉下來(停留在橫樑時間少於 20 秒) 記錄為 5 分；完全無法停留在橫樑上，立即掉落橫樑記錄為 6 分；反射缺損及活動異常試驗包括有耳道刺激反射試驗(pinna reflex) 缺損則記錄 1 分；眼角刺激反射試驗(corneal reflex) 缺損則記錄 1 分；驚嚇反射試驗 (startle reflex) 缺損則記錄 1 分；有抽搐異常動作(seizure) 則記錄 1 分。 (5).圖示神經學狀態評估. 25.

(35) (6).評估腦梗塞面積神經學狀態評估之後，老鼠經深度麻醉後犧牲。鼠腦迅速取出置放於腦模型中切成厚度為 2 mm 之腦冠切片，將腦冠切片於 37ºC 下以 2% 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC, Merk, Germany)染色 15 分鐘。腦切片依不同染色分成白色的梗塞區及紫紅色的非梗塞區。以 microscopic image-analysis software (Image-Pro plus, USA)計算前 6 片腦切片之梗塞面積，最後計算梗塞面積與全部腦切片面積的比率。. (7). 實驗 A 流程圖. 3-4-1-B.實驗 B (1).分組 SD 雄性大鼠隨意分成 3 組，每組 6 隻。分組如下：1) sham 組：右頸總動脈及內頸動脈暴露，但中大腦動脈並未阻塞；2) control 組：中 26.

(36) 大腦動脈阻塞 90 分鐘，再灌流 2 小時；3) FA100 組：同 control 組，但於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射 100 mg/kg FA。. (2). Hydroethidium 原位染色及 Hoechst 染色於中大腦動脈阻塞前 10 分鐘從股靜脈打入 0.5 ml 之 hydroethidium solution (1mg/ml)，老鼠於再灌流 2 小時麻醉且犧牲，老鼠以 200 ml 0.9% 之生理食鹽水及 200 ml 4%之福馬林(paraformalaldehyde, pH 7.4)經心臟灌流，鼠腦迅速取出再以 4%福馬林固定隨後以 30% sucrose 脫水三天，以包埋劑包埋之後至切片機切成厚度 15 µm 之腦切片。接著腦切片於暗室中以 2.5×10-3 mg/ml Hoechst 33258 (Molecular Probes) 溶於 PBS solution 中培養 15 分鐘當背景染色，再以水溶性封片膠(Calbiochem, Oncogene, Germany) 封片。 Hydroethidium 可被超氧陰離子氧化成 oxidized hydroethidine。腦切片以共軛焦螢光顯微鏡(Leica TCS SP2)偵測 oxidized hydroethidine (excitation 510-550 nm and emission 610-650 nm)陽性細胞於皮質及紋狀體梗塞區表現情形。. (3). ICAM-1 、 MPO 及. NF-κB (p50) 免疫組織化學分析染色. (Immunohistochemistry staining; IHC) 選取相鄰 hydroethidium 染色之腦切片 ( 每組 n=5) 以 Dulbeaco’s phosphate buffered saline (1 × DPBS, Sigma, USA)潤濕，以 0.3%之 H2O2 / methanol 溶液浸泡 15 分鐘去除內生性抗氧化酶活性。腦切片於室溫下以 10% normal animal serum (Zymed, San Franciso, CA, USA)培養 20 分鐘。接著腦切片在 4ºC 以一抗(ICAM-1 1:100 dilution, Santa Cruz; MPO 1:500 dilution, Cell Science Inc.; NF-κB (p50) 1:250 dilution, Santa Cruz) overnight，再以二抗及 avidine-biotin peroxidase complex (ABC kit, Zymed, 27.

(37) CA, USA)培養。腦切片以 3, 3’-diaminobenzidine (DAB)試劑呈色，再以 hematoxylin 當背景染色，最後以封片膠(SP 15-500, New Jersey, USA)封片並置於顯微鏡(Olympus, BX50F4, Japan)下計數定量。. (4) Hydroethidium 原位染色及 Hoechst 染色示意圖(118). 3-4-1-C.實驗 C (1).分組共有 18 隻雄性 SD 大鼠隨意分成 3 組，每組 6 隻。分組如下：1) sham 組：右頸總動脈及內頸動脈暴露，但中大腦動脈並未阻塞；2) control 組：中大腦動脈阻塞 90 分鐘，再灌流 24 小時；3) FA100 組：同 control 組， 28.

(38) 但於中大腦動脈阻塞的同時靜脈注射 100 mg/kg FA。. (2). ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50 )免疫組織化學分析染色再灌流 24 小時，老鼠麻醉犧牲進行心臟灌流，鼠腦迅速取出，並切成厚度為 15 µm 之腦切片，接著進行 ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50) 之免疫組織化學分析染色分析，染色方法及步驟如前所述。. (3). ICAM-1、MPO 及 NF-κB (p50 )免疫組織化學分析染色示意圖(8). 29.

(39) (4).實驗 B、C 流程圖. 3-4-2.第二階段 (1).分組本實驗 SD 雄性大鼠任意分成三組：FA 組、control 組及 sham 組。老鼠於 FA 組中進行中大腦動脈阻塞同時靜脈注射 100 mg/kg FA，阻塞 90 分鐘後，老鼠於再灌流 2 小時、10 小時、24 小時及 36 小時分批犧牲；老鼠於 control 組除了不給予 FA 外，其餘實驗步驟均與 FA 組相同；老鼠於 sham 組除了不梗塞中大腦動脈血流外，其餘實驗步驟均與 control 組相同。. (2).生理指標在實驗過程中，老鼠均以電熱毯加熱保溫，且肛溫維持在 37.0±0.5ºC 之間。並於缺血前 10 分鐘及缺血後 90 分鐘偵測動脈血中 pH、pO2、pCO2 30.

(40) 及血糖值。. (3). RNA 萃取暫時性中大腦動脈阻塞 90 分鐘後，老鼠(n=4)於再灌流 2 小時犧牲且迅速將腦取出。本實驗採用 acid guanidinium thiocyanate-water saturated phenol-chloroform mixture 法(119)於鼠腦兩側皮質及紋狀體(囪門前 1.7 至囪門後 4.3mm)進行 RNA 萃取。步驟如下，腦組織取出後稱重並置入適量 denaturing solution (4M guanidinium thiocyanate, 25mM sodium citrate (pH 7.0) and 0.5% (w/v) sodium lauroyl sarcosinate)。組織均質後依序加入 2M sodium acetate (pH 4.0) 、 water-saturated phenol (pH 4.0) 及 chloroform/isoamyl alcohol mixture (49:1, v/v)，然後將此混合液置放於冰上 15 分鐘。以 14000 rpm 轉速 4ºC 下離心 15 分鐘取上層水液層(aqueous phase)。將上層水液層再進行兩次 leder phenol (內含 water-saturated phenol (pH 4.0)、chloroform 及 isoamyl alcohol mixture；比例為 25:24:1) 萃取。取出上層懸浮液(supernatant)加入等量之 ice-cold isopropanol 並貯存於-70ºC 下至少 15 分鐘。以 14000 rpm 轉速 4ºC 下離心 5 分鐘，沉澱物(pellet)以 DEPC-treated 之去離子水溶解並貯存於-70ºC 冰箱中。. (4). 半定量反轉錄 - 聚合酶鏈式反應 (Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction;RT-PCR) 1 μg RNA 加入含有 0.5 μg/μl oligo dT、10mM dNTP (Promega) 及 DEPC-treated 去離子水之溶液(總共 13 μl)中，於 65ºC 的水箱中培養 5 分鐘。接著加入內含 4 μl 之 5× first-strand buffer (Promega)、1 ul of 0.1 M DTT (Promega)、1 μl of 40 U/μl RNasin (Promega)及 1 μl of 200 U/μl superscript ш (Invitrogen)混合液，於 37ºC 下培養 45 分鐘，95ºC 下培養 31.

(41) 5 分鐘及 4ºC 下培養 5 分鐘進行反轉錄反應。2 μl 之反轉錄產物(cDNA) 加入 48 μl 內含 10 μM primer (ICAM-1、 Mac-1、IL-1β、TNF-α 或 GAPDH) (Invitrogen) (Table 1)、10 mM dNTP (Promega)、10× PCR buffer (Promega) 、 25 mM MgCl2 (Promega) 、 5 U/μl Go Taq (Promega) 及 DEPC-treated 去離子水進行聚合酶鏈式反應。而聚合酶鏈式反應初始以 94ºC 進行 12 分鐘變性(denaturation)，接著 94ºC 下 1 分鐘，55ºC 下 1 分鐘，72 ºC 下 2 分鐘及最後在 72ºC 下進行最後延長 6 分鐘，總共進行 33 或 35 循環(Table 3-1)。聚合酶鏈式反應產物於 2% agarose gel 下進行電泳，再以 EtBr 染色。聚合酶鏈式反應產物以 Gel-Pro Analyzer Software 進行定量分析，產物值相對於 GAPDH 產值為最後之百分比值。. Table 3-1. Primer sequences Primers (5’→3’) ICAM-1. Cycles. Product size (bp). 33. 234. 35. 150. 35. 241. Sense: AGACACAAGCAAGAGAAGAA Antisense: GAGAAGCCCAAACCCGTATG Mac-1 Sense: CTGCCTCAGGGATCCGTAAAG Antisense: CCTCTGCCTCAGGAATGACATC IL-1β. 32.

(42) Table 3-1. 續 Primers (5’→3’). Cycles. Product size (bp). 35. 196. 33. 452. Sense: CACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG Antisense: GTCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA TNF-α Sense: GTAGCCCACGTCGTAGCAAAC Antisense: TGTGGGTGAGGAGCACATAGTC GAPDH Sense: ACCACAGTCCATGCCATCAC Antisense: TCCACCACCCTGTTGCTGTA. 33.

(43) (5).半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應示意圖(119). (6).免疫組織化學分析染色經過 90 分鐘中大腦動脈阻塞後，老鼠於再灌流 2 (n=6)、10 (n=5)、 24 (n=6) 及 36 小時(n=3) 分批深度麻醉犧牲。老鼠以 200 ml 之 0.9%生理食鹽水及 200 ml 之 4%福馬林(paraformalaldehyde, pH 7.4)經心臟灌流，鼠腦迅速取出再以 4%福馬林固定隨後以 30% sucrose 脫水三天，以包埋劑包埋之後至切片機切成厚度 15 µm 之腦切片。腦切片以內含有 0.01% Tween-20 之 Dulbeaco’s phosphate buffered saline(Sigma, USA)潤濕再以 3% 之 H2O2/methanol 溶液浸泡 15 分鐘以去除內生性抗氧化酶活性 (endogenous peroxidase activity)。腦切片以 10% normal animal serum (Zymed, CA, USA)於室溫下培養 20 分鐘，接著分別以 anti-Mac-1 (1:200 dilution, Chemicon) 室溫下培養 1 小時； anti-4-HNE (1:400 dilution, MHN-100P, JaICA) 4ºC 下 overnight ； anti-8-OHdG (1:100 dilution, 34.

(44) MOG-020P, JaICA) 4ºC 下 overnight。另外，我們選取再灌流 10 小時及 36 小時犧牲之腦切片分別以 rabbit anti-active caspase 3 (17kD, 1:100 dilution, Chemicon)及 mouse anti-NeuN (1:200 dilution, Chemicon)於 37ºC 下培養 1.5 小時。接著以二抗及 avidine-biotin peroxidase complex (ABC kit, Zymed, CA, USA)培養，再以 3,3’-diaminobenzidine (DAB)呈色，最後以 hematoxylin 培養(active caspase 3 及 NeuN 等一抗之腦切片除外) 當背景染色。完成染色之腦切片以封片膠(Assistant-Histokitt, Germany) 封片，並在顯微鏡(Axioskop 40, Zeiss)下計數免疫陽性細胞之表現。取相鄰 control 組之腦切片進行去除一抗培養之免疫組織化學分析當成 Mac-1、 4-HNE 及 8-OHdG 之 negative control 染色；另外取相鄰 sham 組之腦切片進行去除一抗培養之免疫組織化學分析當成 NeuN 之 negative control 染色。. (7).免疫組織化學分析染色示意圖(120). 35.

(45) (8).細胞凋亡染色分析 (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay; TUNEL) TUNEL 分析用於確認半陰影區及梗塞核心區之細胞核 DNA 斷裂 (DNA fragmentation) 。 TUNEL 染色依廠商說明書步驟進行 (Calbiochem)。簡要敘述，取出先前免疫組織化學分析之相鄰腦切片於室溫下以 20 µg/ml proteinase K 培養 20 分鐘，以 TBS 潤濕後以 1×TdT equilibration buffer 室溫下培養 30 分鐘，然後於 37ºC 下以 TdT labeling reaction mixture 培養 1.5 小時。加入 stop solution 和 blocking buffer 後，腦切片於室溫下以 1×conjugate solution 培養 30 分鐘，再以 DAB kit 呈色。最後腦切片以 methyl green 當背景染色。. (9).細胞凋亡染色分析示意圖(121). 36.

(46) (10).免疫組織化學分析雙重染色將先前以免疫組織化學分析法染 active caspase 3 之腦切片於室溫下以 normal blocking serum (Vector)培養 25 分鐘。接著腦切片以 mouse anti-NeuN (1:200 dilution, Chemicon )一抗於 37ºC 下培養 1.5 小時，以 DPBS 清洗。再以 diluted biotinylated secondary antibody 及 ABC-AP reagent (AK-5002, Vectastain) 培養。腦切片以 alkaline phosphatase substrate solution (SK-5300, Vector Blue)染色、亮乾再以封片膠封片 (Assistant-Histokitt, Germany) ，切片中之免疫陽性細胞以顯微鏡 (Axioskop 40, Zeiss)計數偵測。而 negative control 染色則是在相鄰 control 組腦切片上以去除 active caspase 3 及 NeuN 等一抗進行和上述相同之免疫組織化學分析雙重染色。. (11).免疫組織化學分析雙重染色示意圖(122). 37.

(47) (12).第二階段實驗流程圖. 3-5.統計分析(Statistical analysis) 所有數據以平均值±標準差(mean ± SD)表示，各實驗組之數據經由 ANOVA 方式以 Scheffe′s test 檢定；此外第二階段中組內梗塞區同側腦及對側腦之 mRNA 表現則以 paired t-test 檢定。P 值小於 0.05 被認定具有統計學上的意義。. 38.

(48) 第四章結果. 4-1.第一階段實驗結果 4-1-1.生理指標於缺血前 10 分鐘、缺血後 90 分鐘及再灌流後 10 分鐘偵測 sham、 control、 FA60、 FA80、FA100 及 DFA 組之 pH、pO2、pCO2、blood sugar、 MABP 及 heart rate 表現，發現均無統計學上的差異(all p > 0.05; Table 4-1)，顯示各實驗組均在相同的生埋狀況下進行實驗。. Table 4-1. Comparison of physiological parameter among the groups Sham. Control. FA60. FA80. FA100. DFA. Blood sugar (mg/dl). 103.0±23.1. 115.2±23.1. 110.2±33.2. 123.0±29.1. 88.7±23.6. 116.2±35.8. pH. 7.31±0.03. 7.32±0.04. 7.31±0.02. 7.33±0.04. 7.31±0.03. 7.31±0.03. pO2 (mmHg). 106.0±14.4. 95.8±10.9. 105.7±11.3. 105.5±9.7. 98.2±9.9. 95.0±8.9. pCO2 (mmHg). 27.0±8.4. 30.2±3.5. 24.0±5.7. 30.0±8.1. 30.2±5.5. 30.8±2.7. MABP (mmHg). 79.2±13.3. 81.8±10.2. 77.7±8.5. 87.2±12.5. 74.2±5.0. 76.8±9.9. Heart rate (beats/min). 347±68. 350±42. 393±34. 318±50. 345±45. 324±51. 10 min before MCAo. 90 min after MCAo Blood sugar (mg/dl). 112.7±30.8. 101.2±15.2. 114.2±15.5. 113.7±24.2. 103.5±33.4. 117.5±20.7. pH. 7.33±0.04. 7.36±0.03. 7.36±0.03. 7.36±0.03. 7.35±0.05. 7.34±0.05. pO2 (mmHg). 92.2±11.3. 96.7±11.0. 97.0±11.5. 102.3±8.3. 90.3±8.0. 92.5±14.3. Data were presented as Mean ± SD. Sham: sham group; Control: control group; FA60: FA60 group; FA80: FA80 group; FA100: FA100 group; FA60: FA100 group; DFA: DFA group; MK: MK group; MCAo: middle cerebral artery occlusion; MABP: mean arterial blood pressure.. 39.

(49) Table 4-1. 續 Sham. Control. FA60. FA80. FA100. DFA. pCO2 (mmHg). 27.8±7.7. 27.1±8.0. 23.1±4.9. 20.7±3.4. 26.7±5.1. 22.0±5.0. MABP (mmHg). 82.0±9.6. 84.3±9.9. 82.3±13.0. 87.2±14.3. 81.3±16.5. 75.2±10.4. 340±65. 397±89. 363±31. 392±72. 352±50. Blood sugar (mg/dl). 105.8±32.9. 99.2±19.8. 108.3±25.8. 115.7±24.8. 125.2±20.9. 124.0±33.4. pH. 7.34±0.02. 7.36±0.03. 7.38±0.05. 7.36±0.03. 7.35±0.04. 7.37±0.05. pO2 (mmHg). 95.0±6.5. 90.8±5.9. 100.8±11.4. 101.7±10.9. 95.8±8.50. 92.0±7.2. pCO2 (mmHg). 26.6±6.1. 24.3±6.5. 20.4±3.3. 19.6±5.4. 24.3±4.9. 21.1±4.4. MABP (mmHg). 81.2±12.0. 84.3±14.0. 88.5±10.2. 80.3±14.1. 88.5±17.8. 77.8±8.0. 342±52. 436±61. 373±51. 394±76. 414±56. 362±56. Heart rate (beats/min). 407±62. 10 min after reperfusion. Heart rate (beats/min). 4-1-2. FA 對再灌流 24 小時後腦梗塞面積之影響中大腦動脈阻塞 90 分鐘，再灌流 24 小時各實驗組形成腦梗塞(Figure 4-1A)。我們分析發現 control、 FA60、 FA80、 FA100 及 DFA 組之梗塞面積百分比均顯著大於 sham 組(p < 0.001, p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05, p < 0.01, respectively)。進一步分析發現 FA80、FA100 及 DFA 組之梗塞面積百分比顯著小於 control 組(all p < 0.001)及 FA60 組(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.05, respectively) (Figure 4-1B)。. 40.

(50) (A). Figure. 4-1.. Effect. of. ferulic. acid. on. cerebral. infarct. in. ischemia-reperfusion injured rats. (A) Focal cerebral infarct developed after the middle cerebral artery had been occluded for 90 min followed by 24 h of reperfusion in Sprague-Dawley rats. The 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride stain of the infarct area showed a white color, whereas the non-infarct area was reddish-purple color. Sham: sham group; Control: control group; FA60: FA60 group; FA80: FA80 group; FA100: FA100 group; DFA: DFA group. Scale bar= 1 cm. (B) Comparison with the percentage of infarct area among the sham, control, FA60, FA80, FA100 and DFA groups was measured at 24 h of reperfusion. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared with the sham group; ###p < 0.001 compared with the control group; @p < 0.05, @@p < 0.01 compared with the FA60 group. 41.

(51) (B). 4-1-3. FA 對再灌流 24 小時後神經學行為缺陷之影響老鼠於中大腦動脈阻塞 90 分鐘，再灌流 24 小時形成程度不等之神經學缺陷。control (13.5 ± 0.8)、FA60 (11.5 ± 1.5)、 FA80 (8.5 ± 0.8)、 FA100 (8.3 ± 0.5)及 DFA (9.8 ± 1.2) 組之神經學缺陷分數顯著大於 sham (1.2 ± 0.4) 組 (all p < 0.001)。然而，FA80、 FA100 及 DFA 組之神經學缺陷分數顯著低於 control 組 (all p < 0.001)。另外，FA80 及 FA100 組之神經學缺陷分數亦顯著低於 FA60 組 (p < 0.001, p < 0.001, respectively)。. 4-1-4. FA 對再灌流 2 小時後 oxidized hydroethidine 螢光染色陽性細胞表現之影響所有本實驗偵測之免疫陽性(immunoreactive; positive)細胞或血管均 42.