杭菊細菌萎凋病分離株之分子生物學鑑定

(一) 目標片段之增幅 (PCR 反應)

圖 16 為 HG01 以及 HG02 以對青枯病 Ralstonia solanasearum 具專一性之引 子對 759/760 進行 PCR 反應之產物電泳圖譜。其中 BCRC12605 為購自食品 工業研究所菌種保存中心之青枯病菌作為正對照組 PCR 產物之電泳條帶。CK 表示只加入 dd H2O 而沒有 DNA 模板之負對照組。由此結果顯示，正對照組 有產生預期之條帶，然而受測之此二分離菌株皆未產生相應之條帶，故皆不屬於 青枯病菌。再以廣用之引子對 27F/1492R 進行 PCR 反應，所得之部份 16S rDNA 基因序列之產物電泳圖譜如圖 18。受測之菌株皆有條帶產生，可供後續 之定序作業。

(二) 本研究之細菌分離株 HG01 及 HG02 及再分離菌株基因片段之定序

PCR 產物經委託基龍米克斯生物技術公司純化並定序，將所得到之序列如圖 20、

圖 21 及圖 22。

再分離菌株之 DNA 序列與 HG02 之 DNA 序列至 NCBI 網站基因庫比對之 結果如表 15。由表 15 可見，再分離菌株與分離株 HG02 之 DNA 序列比對結 果相當近似。

細菌分離株 HG01、HG02 及再分離菌株之 DNA 序列至 NCBI 網站基因庫比 對之結果列如表 16。比對結果顯示細菌分離株 HG01 為 Klebsiella oxytoca，而 HG02 及再分離菌株皆為 Burkholderia gladioli。

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圖 18、以專一性引子對 759/760 進行核酸聚合酶連鎖反應產物電泳圖譜。

Figure 18. Electrophoresis patterns of PCR products of isolates HG02 and HG01, amplified with primers 759 and 760. M, 1kb marker. CK, water control.

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圖 19、以廣用之細菌 16S rDNA PCR 序列引子對 Escherichia coli 27F/1492R 進行核酸聚合酶連鎖反應之產物電泳圖。

Figure 19. Electrophoresis pattern of PCR products of isolate HG02 and isolate HG01, amplified with primers 27F and 1492R. M, 1kb marker.

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圖 20、HG01 分離株以引子 27F/1492R 增幅後產物之部份 DNA 之序列。

Figure 20. The DNA sequence of PCR products of isolates HG01 amplified with primer 27F and 1492R.

GCCTTGCGGCAGTCTACCATGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGC TCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTG

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圖 21、HG02 分離株以引子 27F/1492R 增幅後產物之部份 DNA 之序列。

Figure 21. The DNA sequence of PCR products of isolates HG02 amplified with primer 27F and 1492R.

GCGTGGCGGCAGCTTAACATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCAC CTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAG

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圖 22、再分離之分離菌株以引子 27F/1492R 增幅後產物之部份 DNA 之序列。

Figure 22. The DNA sequence of the PCR products amplified from genomic DNA of reisolated bacteria using primer pair 27F/1492R.

GCGGGGGGGGGCAGCTTACCATGCAGTCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCC

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表 15、再分離之菌株序列與 HG02 分離株序列比對之結果

Table 15. Comparison of the alignment of HG02 sequence and the reisolated bacteria sequence.

表 16、分離株 HG01 及 HG02 以引子對 27F/1492R 經 PCR 增幅所得之 DNA 序列至 NCBI 網站基因庫比對之結果。

Table 16. The identification result of isolates HG01, HG02, and the reisolated bacteria DNA sequences submitted to NCBI gene bank.

Max score Total score Query cover E value Max ident Accession

913 913 99％ 0.0 99％ Query_54329

菌株編號 序列比對結果 Max score Total score Query cover E value Max ident Accession HG01 Klebsiella oxytoca strain TauN1 16S

ribosomal RNA gene, partial sequence

1906 1906 99％ 0.0 99％ AY823620.1

HG02 Burkholderia gladioli strain IHB B 15123 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

1903 1903 99％ 0.0 99％ KP306792.1

再分離菌株 Burkholderia gladioli strain N312 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

1181 1181 100％ 0.0 99％ KP306792.1

51 Table 17. The effects of three biocontrol agents on controlling the chrysanthemum wilt in the greenhouse.

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最大之三者 (Keflex、Rifampicin 以及 Tetracycline) 進行盆栽測試。

2. 抗生素防治杭菊細菌性萎凋病盆栽測試

本實驗選擇前置實驗中抑制圈半徑最大之三種藥劑於接種病菌後一天澆灌濃 度 200 ppm 之藥劑水溶液進行盆栽測試。所選擇之藥劑分別為 Keflex、

Tetracycline 以及 Rifampicin，其結果如表 19。結果顯示，病原菌菌液浸泡裸 根苗接種 (未斷根) 處理 7 天後，對照組發病率達到 100％，各個處理組發病 率也皆高達 83％。各處理之萎凋病嚴重度也皆達到 56％，嚴重度僅比對照組 (萎凋病嚴重度 89％) 稍低。

表 18、不同抗生素藥劑對於杭菊萎凋菌株 HG02 之抑制情形

Table 18. The inhibitory effects of antibiotics on the chrysanthemum wilt isolate HG02.

Chemicals Inhibition diameter of the inhibition zone (cm)

Ampicillin 1.10±0.14

Neomycin 0.20±0.40

Keflex 1.35±0.07

Rifampicin 1.32±0.15

Tetracycline 1.97±0.22

Novobiocin 1.07±0.26

Streptomycin 1.20±0.14

None (CK) 0

數值為各處理之四重複平均及各處理組內樣本之標準差。

處理藥劑濃度為 200 ppm

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表 19、盆栽測試 3 種抗生素防治杭菊萎凋病之效果

Table 19. The efficacy of 3 different antibiotics for the control of chrysanthemum wilt disease in potted plant control.

處理 接種 7 天後發病率 杭菊萎凋病之嚴重度(％)**

對照組 6/6(100％) 89

Keflex 5/6(83％) 56

Tetracycline 5/6(83％) 56 Rifampicin 5/6(83％) 56

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表 20、艾草及越山菊以剪根浸根接種分離株 HG02 之發病率

Table 20. The wilt incidence of Artemisia and Yue-Shan chrysanthemum inoculated by cut root dipping method with wilt isolate HG02.

艾草浸根接種之發病率 越山菊浸根接種之發病率

HG02 None (CK) HG02 None (CK) 0/6(0％) 0/6 (0％) 0/6 (0％) 0/6 (0％)

＊發病數係接種後 2 週觀察而得，，一植株為一重複，各為 6 重複。

表 21、以艾草及越山菊為根砧嫁接杭菊再剪根浸根接種分離株 HG02 之發病率 Table 21. The wilt incidence of grafting plants inoculated by cut root dipping method with isolate HG02.

艾草浸根接種之嫁接植株發病率 越山菊浸根接種之嫁接植株發病率

None(CK) HG02 None (CK) HG02 0/3(0％)** 0/3 (0％)** 0/3 (0％) 0/3 (0％)

*發病數係接種後 2 週觀察而得，一嫁接株為一重複，各為 3 重複。

**根砧健康但部分接穗嫁接失敗枯死

55 源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC) 之青枯病 編號 12605 之菌株比較。與青枯病菌菌落相似之細菌分離株暫時歸類為青枯病