一、 Genipin 之 pKa 測定
由 於 文 獻 中 查 無 genipin pKa 之 記 載 ， 而 其 化 學 結 構 具 半 缩 醛 (hemiacetal)，因此以 0.1N NaOH 滴定之，依 Henderson-Hasselbach equation pH = pKa + log ([A-]/[HA])，當達滴定中點 (50%中和) 時，解離態與不解離 態的濃度正好相等，此時的 pH = pKa。
VNaOH 及 pH 之變化如 Table 1，滴定曲線如 Fig. 1~3 所示。由滴定曲 線可求得當量點時 VNaOH= 825 μL，於滴定中點時 VNaOH= 412.5 μL，由滴 定曲線推算，此時溶液的 pH 為 6.3，故 pKa = 6.3，Ka = 5.0×10-7，顯示 genipin 的酸度比酚為高 (phenol 之 pKa = 9.95)。
二、 Genipin 之安定性
Genipin 的結構具 hemiacetal 官能基，易開環，化性較不安定。因此 本實驗以 HPLC 方法先行探討其於甲醇及血清中之安定性。以 0.1%磷酸 溶液與乙腈 (84:16, v/v) 之混合液為移動相，波峰分離效果良好，可於 25 分鐘內完成。以所測得 genipin 與內標之波峰面積比，探討各種情況下 genipin 之安定性。
(一) 甲醇中 genipin 之安定性
Genipin 之甲醇溶液製備後，於不同時間以 HPLC 分析，顯示 genipin 之濃度會隨時間減少，如 Fig. 4 所示，故於實驗中所使用之 genipin 標準溶液必須於使用前新鮮配製。
(二) 血清中 genipin 之安定性
Genipin 之血清溶液製備後，貯存於 -20℃，於預定時間點取出，
顯示經凍存ㄧ天及三天後，genipin 的濃度分別比立即處理組減少了 51.7% 及 60.1% (p<0.001)，如 Fig. 5 所示；若於冰凍前加抗壞血酸及 未加抗壞血酸，genipin 的濃度分別比立即處理組減少 8.9% (p<0.01) 及 43.3% (p<0.001)，如 Fig. 6 所示，結果顯示保存前加抗壞血酸顯著 減少其降解，應可推論抗壞血酸的酸性提高了其安定性；另外，本研 究進ㄧ步探討解凍過程中使用超音波震盪對 genipin 安定性的影響，
結果顯示 genipin 明顯因震盪而破壞，如 Fig. 7 所示，因此血清檢品
置於室溫下自然解凍應為比較理想之解凍方式。
爲了解 genipin 結合態代謝物之最佳酶解時間，以大鼠靜脈注射 genipin 後三分鐘之血清檢品，分別加入 sulfatase、β-glucuronidase 水 解，於 37℃ 水浴進行酶解反應，並於 0、15、30、60、120 及 240 分 終止反應，結果如 Fig. 8 所示，顯示以 sulfatase 水解 30 分鐘所產生 的 genipin 最多，而以 β-glucuronidase 水解時，genipin 的濃度並未明 顯增加，顯示幾無 genipin glucuronides 之存在。
分析結果顯示，genipin 之原形分子於血清中極不安定。於藥物動 力學研究的定量過程，爲克服 genipin 不安定的問題，進行動力學實 驗時將採分析血漿樣品，並於冰上進行前處理，以求能以最短時間處 理檢品，避免 genipin 受破壞。
三、 體循環前代謝－大鼠便腸道菌對 geniposide 之作用
為了解 geniposide 是否會經腸道細菌作用轉變為其非醣體 genipin，本 研究藉鼠便中之腸道菌探討其體循環前代謝，以無氧、避光及 37℃ 水浴 溫孵，模擬動物體內環境。鼠糞檢品經乙酸乙酯萃取後，利用 HPLC 方法 分析。以 0.1% 磷酸溶液與乙腈 (78:22, v/v) 之混合液為移動相，每一檢品 可於 30 分鐘內完成分析，層析圖如 Fig. 9 所示。
Geniposide 經鼠便細菌作用後，其苷元 genipin 濃度之經時變化如 Fig.
10 所示。Geniposide 一接觸到鼠便細菌時，立刻被水解成 genipin，隨著 時間增加，5 分鐘時濃度最高，而後逐漸減少，結果顯示 geniposide 極易 受腸道菌水解，而 genipin 又遭其降解。
四、 Genipin 於大鼠體內之代謝動力學
基於前述 genipin 安定性之研究結果，本研究爲定量血中的 genipin，
採以血漿為分析樣品，血漿檢品之前處理預試驗顯示，以乙酸乙酯萃取較 以甲醇去蛋白處理之回收率為佳；此外，預試驗亦顯示添加抗壞血酸可減 少 genipin 遭破壞。因此於採血後，血漿立刻以乙酸乙酯萃取，利用 HPLC 方法定量 genipin。由於無法取得 genipin sulfate 和 genipin glucuronide 兩 種 結 合 態 代 謝 物 之 標 準 品 ， 因 而 將 血 漿 檢 品 分 別 以 sulfatase 及 β-glucuronidase 水解後，再以 HPLC 定量 genipin。
HPLC 系統係以 0.1% 磷酸溶液與乙腈 (78:22, v/v) 之混合液為移動 相。每一血漿檢品可於 25 分鐘內完成分析。層析圖如 Fig. 11 所示。檢量 線係以 genipin 與內標波峰面積比值為 y 軸，genipin 濃度為 x 軸，經線 性 迴 歸 求 得 檢 量 線 方 程 式 及 相 關 係 數 。 Genipin 之 檢 量 線 為 y=0.2002x-0.0017 (r = 0.999)，於濃度 0.1 至 10.0 g/mL 之範圍有良好線 性關係。分析方法之精密度 (precision) 及準確度 (accuracy)，如 Table 2 所 示。同日內及異日間之變異係數 (coefficient of variation) 皆小於 7.2%，相 對誤差皆小於 17%。血漿中回收率 (recovery) 為 95.9% ~ 101.1%，如 Table 3 所示。結果顯示分析系統之精密度、準確度及回收率皆良好。最低 定量極限 (LLOQ) 為 0.1 g/mL，可偵測極限 (LOD) 為 0.02 g/mL。
靜脈注射 50 mg/kg genipin 後，血漿中 genipin 及其 sulfate 之濃度如 Table 4~5 所示，平均濃度經時變化圖如 Fig. 12~13 所示。以非室模式計算 出 genipin 及 其 sulfate 之 血 藥 面 積 分 別 為 881.9±59.8 及 342.7±36.9 nmol•min/mL，全身清除率分別為 89.5±6.7 及 230.3±25.9 mL/min，分佈體 積 分 別 為 1.1±0.2 及 32.6±8.0 L ， 平 均 滯 留 時 間 分 別 為 7.6±0.6 及 41.2±7.5 分鐘，如 Table 6~7 所示。Genipin sulfate 之平均血藥面積僅為原 形分子之 61.1%，分佈體積約為其 29.6 倍，如 Table 8 所示，顯示 genipin 靜脈注射給藥後立即代謝成 sulfate 結合態代謝物，其原形分子於給藥後 60 分鐘後即偵測不到，而 sulfate 之結合態代謝物則一直可偵測至給藥後 360 分鐘。
口服投予 genipin 100, 200 mg/kg 後，血漿中 genipin 及其 sulfate 之 濃度如 Table 9~10 所示，動物間個體差異明顯，genipin 原形分子之濃度 低於最低定量濃度 (LLOQ)，genipin sulfate 之平均血中濃度經時變化如 Fig. 14 所示，藥物動力學參數如 Table 11~12 所示。200 mg/kg 之劑量相 對於 100 mg/kg，genipin sulfate 之血峰濃度為 3.4 倍 (p<0.01)，血藥面積 為 4.1 倍 (p<0.001)，滯留時間為 1.6 倍 (p<0.001)，如 Table 13 所示，
而 glucuronide 均偵測不到，顯示口服投予 genipin 後，主要係以 sulfate 結合態代謝物存在於循環中，與靜脈注射結果相似，惟靜脈投予時，給藥 後一小時內可偵測到原形分子。因此建議進行體外活性試驗時，應重視
genipin sulfate，讓體外試驗能更接近體內真正的分子形態與濃度，才能瞭 解 genipin 真實的體內藥理活性與機制。
令人意外的是口服 200 mg/kg genipin 的部份大鼠，於給藥後 6~12 小 時間陸續死亡，而死亡率竟高達 77.8%，推測應與肝毒性有關，此一急毒 性仍有待進ㄧ步探討。文獻指出 genipin 易與胺基酸結合形成藍色色素，
因此常被當作染料及食品之添加劑。在本研究過程中，亦觀察到大鼠尿液 與糞便呈現藍綠色或藍色，顯示大鼠體內有 genipin 藍色代謝物之存在。
五、 梔子水煎劑中 geniposide 之定量分析
利用 HPLC 方法定量梔子水煎劑中 geniposide 之含量，係以 0.1 %磷 酸溶液與乙腈 (85:15, v/v) 之混合液為移動相，波峰分離效果良好，
geniposide 之定量可於 15 分鐘內完成。層析圖如 Fig. 15 所示。
以 geniposide 與內標波峰面積比值為 y 軸，geniposide 濃度為 x 軸，
經 線 性 迴 歸 求 得 檢 量 線 方 程 式 及 相 關 係 數 。 Geniposide 之 檢 量 線 為 y=0.0381x-0.0181 ( r = 0.999)，於濃度 3.1 至 200.0g/mL 之範圍有良好線 性關係。分析方法之精密度 (precision) 及準確度 (accuracy)，如 Table 14 所示。同日內及異日間之變異係數 (coefficient of variation) 皆小於 4.5%。
從水煎劑中測得之回收率 (recovery) 為 86.9% ~ 96.4%，如 Table 15 所 示。結果顯示分析系統之精密度及準確度皆良好。最低定量極限 (LLOQ) 為 3.1 g/mL，可偵測極限 (LOD) 為 0.1 g/mL。
定量結果顯示，每 g 梔子有 48.9 mg geniposide 溶於水煎劑中。
六、 梔子水煎劑於大鼠體內之代謝動力學
本研究利用 HPLC 方法定量血漿中 genipin sulfate 之濃度，方法與
「genipin 於大鼠體內之代謝動力學」相同。
大鼠給藥採交叉設計，分別口服投予梔子水煎劑 10 及 20 g/kg 後，血 漿中 genipin sulfate 之濃度如 Table 16~17 所示，各大白鼠間有明顯之個 體差異，genipin 之濃度低於最低定量濃度 (LLOQ)，genipin sulfate 之濃度 經時變化圖如 Fig. 16~17 所示。藥物動力學參數如 Table 18~19 所示。口 服給予 10 g/kg 梔子水煎劑之平均血峰濃度為 4.2±0.6 nmol/mL，平均血藥 面積為 10087.7±1887.6 nmol•min/mL，平均滯留時間為 2773.8±225.4 分；
口服給予 20 g/kg 梔子水煎劑之平均血峰濃度為 8.8±0.6 nmol/mL，平均血 藥面積為 26729.9±4526.3 nmol•min/mL，平均滯留時間為 3020.2±322.6 分，如 Table 20 所示；比較兩劑量間之血峰濃度及血藥面積，20 g/kg 皆 約為 10 g/kg 的兩倍。
口服梔子水煎劑 10 g/kg 所投予之 geniposide 莫耳數，約相當於口服 100 mg/kg 及 200 mg/kg genipin 之 2.8 及 1.4 倍，結果顯示 genipin sulfate 之平均血峰濃度為其 1.4 及 0.4 倍，平均血藥面積為其 17.4 及 4.2 倍，平均滯留時間為其 5.2 及 3.3 倍；口服梔子水煎劑 20 g/kg 所投 予之 genipin 量相當於口服 100 mg/kg 及 200 mg/kg genipin 之 5.7 及
倍，平均滯留時間為其 5.7 及 3.5 倍，顯示口服梔子水煎劑之 genipin sulfate 血藥面積遠大於口服相當量的 genipin。水煎劑中 geniposide 口服 生可用率較佳的原因，可能與其水溶性較高有關，geniposide 有如 genipin 的 prodrug，而 genipin 因水溶性較差，可能部份沉澱於胃腸道中。
實驗過程中亦觀察到，口服梔子水煎劑之大鼠約於給藥 4 小時後所排 之尿液及糞便開始呈現藍色，而投予 genipin 之大鼠則在給藥後 30 分鐘 即觀察到藍色排遺物，推測 genipin 口服後於鼠體內快速與胺基酸結合而 形 成 藍 色代 謝物， 而 投 予梔 子水煎 劑 時 ， geniposide 先 經 水 解轉 變 為 genipin，再代謝為 genipin sulfate 及胺基酸結合物。另外，單次口服梔子 水煎劑後，genipin sulfate 存在體內的時間達六天之久，顯示有明顯的腸肝 循環現象。
七、梔子水煎劑於大鼠體內對 methotrexate 動力學之影響
(一) 梔子水煎劑中 geniposide 之定量
本研究利用 HPLC 方法定量梔子水煎劑中 geniposide 之含量，結 果顯示梔子水煎劑中 geniposide 之含量為 35.8±0.8 mg/g。
(二) 併服梔子水煎劑對 MTX 動力學之影響
以平行設計單獨口服 MTX 與併服 1、 2、 4 g/kg 梔子水煎劑，
血清中 MTX 之濃度及血藥經時變化圖如 Table 21~24 及 Fig. 18 所 示。單服 MTX 之平均血峰濃度為 0.3 ± 0.03 nmol/mL，平均血藥面積 為 83.6±26.9 nmol．min/mL，平均清除率為 48.8±8.4 mL/min，平均滯留 時間為 378.2±193.2min；併服梔子水煎劑 1 g/kg 之 MTX 平均血峰濃 度為 0.2±0.03 nmol/mL，平均血藥面積為 104.1± 27.5 nmol．min/mL，
平均清除率為 31.4±8.4 mL/min，平均滯留時間為 590.0 ±120.4 min；併 服梔子 2 g/kg 之 MTX 平均血峰濃度為 0.3±0.02 nmol/mL，平均血藥 面積為 482.6±33.4 nmol．min/mL，平均清除率為 4.1±0.7 mL/min，平均 滯留時間為 1882.3±60.8 min；併服梔子 4 g/kg 之 MTX 平均血峰濃度 為 0.3±0.02 nmol/mL，平均血藥面積為 405.7±30.0 nmol．min/mL，平均 清除率為 7.2±0.5 mL/min，平均滯留時間為 1800.8±67.5 min，如 Table 25~28 所示。
比較動力學參數顯示，當併服 2、4 g/kg 梔子水煎劑時，MTX 之 血藥面積分別增加了 477.3% 及 385.3%，清除率分別減少了 91.6% 及 85.2%，滯留時間分別增加了 397.7% 及 376.2%，統計上均具有顯著差 異 (p<0.001)；而併服 1 g/kg 梔子水煎劑時，則動力學參數無顯著差異，
如 Table 29 所示。另由血藥經時變化圖顯示，併服 2、4 g/kg 梔子水煎 劑具明顯腸肝循環現象且對 MTX 之排除有抑制作用。
如 Table 29 所示。另由血藥經時變化圖顯示，併服 2、4 g/kg 梔子水煎 劑具明顯腸肝循環現象且對 MTX 之排除有抑制作用。