Genipin 之安定性

(一) 甲醇中 genipin 之安定性

精確稱取 genipin 1.0 mg，加入甲醇定容至 1.0 mL，經系列 稀釋配製成 5.0g/mL 之 genipin 標準品溶液，加入等體積含內 標 (10.0 g/mL sesamol) 之甲醇後，分別於 0、16、22、40、70、

164 小時，取 20L 以 HPLC 分析。

(二) 血清中 genipin 之安定性

1. 儲備於 -20℃ 對血清中 genipin 安定性之影響

取空白血清 9 mL，加入 genipin 標準品溶液 1 mL，使其濃 度為 10.0 g/mL，分裝至微量離心管，分成三組，每組三管，每 管 200 L，第一組加入含內標 (1.0 g/mL MP) 之乙酸乙酯 200

L 萃取之，於渦旋振盪器上混合，經 9860 × g 離心 15 分鐘，

取出乙酸乙酯層，以氮氣吹乾後，貯於 -20℃，俟後進行 HPLC 分析。其餘的血清檢品則先貯於 -20℃，分別於 1 及 3 天後取 出，處理步驟如第一組。

2. 抗壞血酸對血清中 genipin 安定性之影響

取空白血清，加入 genipin 標準品溶液，使其濃度為 5.0

g/mL，分裝至微量離心管，分成三組，每組三管，每管 200 L，

第一組加入 pH 5.0 之緩衝溶液 100L、100 mg/mL 抗壞血酸溶

液 100L，再加含內標 (1.0 g/mL MP) 之乙酸乙酯 500 L 萃 取之，於渦旋振盪器上混合，經 9860 × g 離心 15 分鐘，取出 乙酸乙酯層，以氮氣吹乾後，貯於 -20℃，俟後進行 HPLC 分 析。第二組加入 100 mg/mL 抗壞血酸溶液 50 L，第三組加入 水 50 L，皆貯於 -20℃，於第二天取出，分別加入 pH 5.0 之 緩衝溶液 100L 及 100 mg/mL 抗壞血酸溶液 50 L 後，其餘 處理步驟如第一組。

3. 超音波震盪解凍對血清中 genipin 安定性之影響

取空白血清，加入 genipin 標準品溶液，使其濃度為 5.0

g/mL，分裝至微量離心管，分成五組，每組三管，每管 200 L，

第一組加入 pH 5.0 之緩衝溶液 100 L、100 mg/mL 抗壞血酸溶 液 50 L，再加含內標 (1.0 g/mL MP) 之乙酸乙酯 350 L 萃 取之，於渦旋振盪器上混合，經 9860 × g 離心 15 分鐘，取出 乙酸乙酯層，以氮氣吹乾後，貯於 -20℃，俟後進行 HPLC 分 析。其餘四組則先貯於 -20℃，於第二天取出，分別經超音波震 盪器震盪 0、1、5、15 分鐘後，其餘處理步驟如第一組。

(三) 血液檢品之前處理及安定性

1. 抗壞血酸對血清中 genipin 於 37℃ 下安定性的影響

取大鼠靜脈注射 genipin 後 3 分鐘之血清檢品，置於冰溶

上，分裝至外覆鋁箔紙之試管，分成四組，每組三管，每管 200

L，加入 1,000 unit/mL sulfatase 溶液 100 L，第一組加入 200 mg/mL 抗壞血酸溶液 50 L，第二組加入 100 mg/mL 抗壞血酸 溶液 50L，第三組加入 50 mg/mL 抗壞血酸溶液 50 L，第四

組則加入水 50 L，並栓上血清塞，以注射針筒抽去管內之空

氣。置於 37℃ 水浴中 1 小時之後，加入含內標 (1.0g/mL MP) 之乙酸乙酯 350 L 萃取之，於渦旋振盪器上混合後，置於微量 離心管，經 9860 × g 離心 15 分鐘後，取出乙酸乙酯層，以氮 氣吹乾，加甲醇溶解 50L，取 20 L 以 HPLC 分析。

2. 抽氣及避光對血清中 genipin 於 37℃ 下安定性的影響

取大鼠靜脈注射 genipin 後 3 分鐘之血清檢品，置於冰溶

上，分成三組，每組三管，每管 200 L，第一組置於外覆鋁箔

紙之試管，第二組置於透明玻璃試管，第三組置於微量離心管，

各加入 1,000 unit/mL sulfatase 溶液 100 L，100 mg/mL 抗壞血

酸溶液 50L，前兩組栓上血清塞，並以注射針筒抽去管內之空

氣。置於 37℃ 水浴中 1 小時後，加入含內標 (1.0 g/mL MP) 之乙酸乙酯 350 L 萃取之，於渦旋振盪器上混合，置於微量離 心管，經 9860 × g 離心 15 分鐘後，取出乙酸乙酯層，以氮氣 吹乾，加甲醇 50L 溶解，取 20 L 以 HPLC 分析。

3. 血清中 genipin 結合態代謝物酶解之最佳時間

取大鼠靜脈注射 genipin 後 3 分鐘之血清檢品，置於冰溶 上，分裝至微量離心管，每管 200 L，加入 sulfatase 溶液 100

L，100 mg/mL 抗壞血酸溶液 50 L。置於 37℃ 之往復式振盪 水槽，以 100 rpm 震搖，分別於 0、15、30、60、120、240、

360 分鐘後，取出檢品，每組三管，各加含內標 (1.0 g/mL MP) 之乙酸乙酯 350 L 萃取之，於渦旋振盪器上混合，置於微量離 心管，經 9860 × g 離心 15 分鐘後，取出乙酸乙酯層，以氮氣 吹乾，加甲醇 50L 溶解，取 20 L 以 HPLC 分析。

4. 凍存對血清中 genipin sulfate 安定性之影響

取大鼠靜脈注射 genipin 後 3 分鐘之血清檢品，置於冰溶

上，分裝至微量離心管，分成兩組，每組三管，每管 200 L，

第一組加入 1,000 unit/mL sulfatase 溶液 100 L、100 mg/mL 抗 壞血酸溶液 50L，於渦旋振盪器上混合，置於 37℃ 之往復式 振盪水槽，以 100 rpm 震搖，30 分鐘後取出，再加入含內標 (1.0

g/mL MP) 之乙酸乙酯 350 L 萃取之，於渦旋振盪器上混合，

經 9860 × g 離心 15 分鐘，取出乙酸乙酯層，以氮氣吹乾後，

貯於 -20℃，俟後進行 HPLC 分析。第二組則先貯於 -20℃，於 第 3 天取出，處理步驟處理如第一組。

(四) 血清檢品前處理方法之比較 1. 乙酸乙酯萃取之法

取空白血清 900 L，加入 100.0 g/mL 之 genipin 標準品 溶液 100 L 使成濃度為 10.0 g/mL 之血清標準溶液。取 100

L 置於微量離心管，加入含內標 (4.0 g/mL MP) 之乙酸乙酯 100L 萃取之，於渦旋振盪器上混合，置於微量離心管，經 9860

× g 離心 15 分鐘後，取出乙酸乙酯層，以氮氣吹乾，加甲醇 50

L 溶解，取 20 L 以 HPLC 分析。

2. 加甲醇去蛋白法

取 genipin 血清標準溶液 100 L 置於微量離心管，加入含 內標 (1.0g/mL MP) 之甲醇 400 L，於渦旋振盪器上混合，經 9860 × g 離心 15 分鐘後，以氮氣吹乾，加甲醇 50 L 溶解，

取 20L 以 HPLC 分析。

(五) 高效液相層析儀 (HPLC) 分析條件

分析管柱：Cosmosil^® 100 RP-18 e (5m, 150×4.6 mm) 移 動 相：0.1 % phosphoric acid：acetonitrile = 84：16 沖提時間：25 min

流 速：1.0 mL/min 檢測波長：240 nm

(六) 數據分析

比較所測得 genipin 與內標之波峰面積比。

三、 體循環前代謝－大鼠便腸道菌對 geniposide 之作用