橫向解析度

光學同調斷層攝影術是以 2.1.2 節所提到的低同調干涉術為基礎 作縱向的掃描，再搭配橫向掃描而得到二維的斷層影像，縱向的解析 度在2.1.3 節已作說明，而橫向解析度的部份將在本節作介紹。

當進行掃描時，通常會將樣品端的光束已物鏡聚焦，使其成為一 個光學探頭，才能對樣品做探測及解析。

假設一道平行光，光場在空間中的強度分佈為高斯分佈，直徑為 D，當經過一個焦距為f的透鏡時，平行光會在焦點聚焦，而聚焦點的 光斑(Airy disk)大小為w0，則：

D f w

2

π

= λ

若是使用此光束的系統，其空間上的解析力就是光斑的直徑2w0。

圖2.5 高斯光場分佈聚焦點大小以及景深示意圖

由高斯分佈的光場強度去推導，可以得到光場在空間中的強度分佈以

低數值孔徑的透鏡，雖然在橫向解析力較差，但可減少影像失真的程 度，若要得到高橫向解析力，又不想讓影像失真的情況太嚴重，在掃 描的時候可使用高倍率物鏡但需要讓光束的聚焦點隨著掃瞄的深度 一起移動，也就是動態聚焦的原理[22]。本論文中，由於以斷層影像 為研究重點，因此在樣品前使用低倍率(10 倍)或低數值孔徑(N.A.

=0.25) 的物鏡將雷射光束聚焦以減少影像失真的程度。

2.2 頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT)

頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT，SD-OCT)的實驗 架構與時域光學同調斷層攝影術(Time domain OCT，TD-OCT)的實驗 架構很相似，主要有兩項差別，第一項是SD-OCT 參考端的反射鏡是 不動的，因為SD-OCT 不需要有掃瞄機制來改變參考端與樣品端的光 程差以取得樣品軸向深度的訊號，而 TD-OCT 需要有掃瞄機制，第 二項是 SD-OCT 的接收端是光譜儀，而 TD-OCT 的接收端是光偵測 器，圖2.6 與圖 2.7 分別為 TD-OCT 與 SD-OCT 基本架構。

圖2.6 TD-OCT 系統架構

圖2.7 SD-OCT 系統架構

如圖 2.7 所示，頻域光學同調斷層攝影術(SD-OCT)主要是利用 寬頻光源，搭配十字型麥克森干涉儀(Michelson interferometer)，和頻 譜儀(Spectrometer)加上 CCD 偵測器陣列量測干涉頻譜的技術，在圖 2.7 中所使用的低同調(Low coherence)的寬頻雷射光源為超亮發光二 極體(SLD)，寬頻光經由分光鏡(Beam spliter，BS)被分成兩道光，一 道光到達參考端(reference arm)，並且由參考端靜止的反射鏡反射參 考光回接收端，一端到達樣品端(sample arm)，樣品裡在不同深度有 不同反射光或散射光最後回到接收端，接收端同時接收到樣品端與參 考端的反射光而產生干涉訊號，頻譜儀(Spectrometer)是主要由光柵組 成，干涉訊號經由光柵分光打到不同的偵測器上，就可得到不同波段 的干涉訊號強度，即干涉頻譜，樣品不同深度的反射光與參考光干涉

會產生不同頻率的震盪(Oscillations)，震盪的頻率與光程差成正比，

即在樣品裡軸向深度越深的反射光震盪的頻率越大，所以將這些頻域 的干涉訊號經過傅利葉反轉換後，就可得到時域上的干涉訊號，因此 就可得到樣品軸向的深度資訊。

2.3 掃瞄式光源之光學同調斷層攝影術(Swept Source OCT)

頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT，SD-OCT)提供在 低散射器官接近理想的功效，例如眼睛(eye)，但在某些組織上的應用 還是會被限制，例如在上皮組織(epithelial tissues)的研究。上皮組織 的研究是大部分人很感興趣的，因為人類有大多數的癌症都發生在表 面的組織層，例如線狀的中空臟器(lines hollow organs)和上皮組織 (epithelial tissues)，線狀的中空臟器有結腸(colon)、食道(esophagus)、

乳腺(breast ducts)等，在上皮組織(epithelial tissues)有高密度的細胞器 (cellular organelles)，例如線粒體(mitochondria)、細胞核(nuclei)、細胞 膜(cellular membranes)等，這些高散射介質會限制短波長光的穿透深 度，而頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT，SD-OCT)使用 的是短波長範圍(小於 1000nm)的光源，因為 SD-OCT 偵測端是使用 矽(silicon-based)的 CCD 偵測器，這些偵測器無法操作在波長高於 1000nm 的範圍，因此 SD-OCT 在某些組織上的應用會被限制。要使 用OCT 成像於上皮組織(epithelial tissues)或一些非生物樣品，就需要 將 波 長 操 作 在 1000～ 1300nm 才能得到我們想要的高穿透深度 1~3mm。

另一種使用傅利葉偵測(Fourier domain detection)方式的掃瞄式

光源之光學同調斷層攝影系統(Swept source OCT systems)，使用的光 源為快速頻率掃瞄的雷射光源(rapid frequency-swept laser source)，偵 測端使用的是 GaAs 光偵測器，光源波長操作在 1000～1300nm，因 此掃瞄式光源之光學同調斷層攝影系統(Swept source OCT systems) 能成像在SD-OCT 不能成像的上皮組織(epithelial tissues)或一些非生 物樣品，且達到1~3mm 的高穿透深度。

掃 瞄 式 光 源 之 光 學 同 調 斷 層 攝 影 系 統 (Swept source OCT systems，SS-OCT)的架構與頻域光學同調斷層攝影術(SD-OCT)的架 構相似，主要的不同處有兩個地方，第一在於光源的不同，SS-OCT 使用的的是掃瞄式的雷射光源(Swept Laser Source)，光源波長會隨著 時間變化，第二在於接收端偵測器的不同，SS-OCT 使用的是單一個 光偵測器，其架構如圖2.8 所示。

Computer : - Fourier transform - Image generation

A/D converter

BS Swept Laser Source

Mirror (static)

sample Z X

Photo-detector

A B C

A B C sample arm

reference arm

Z=0

Z=0

Fourier transform

圖2.8 SS-OCT 系統架構

第三章 實驗架構、原理與方法

本章將介紹實驗中所使用到的儀器、並簡介SS-OCT 系統，另外 說明實驗方法，如：量測生物樣品時所需要之準備。

3.1 實驗儀器與系統架構 3.1.1 光源

本實驗所使用的是掃瞄式光源之光學同調斷層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT)，而此系統使用的光 源為寬頻掃瞄式光源(Broadband Swept Laser Source)，其規格如表3.1 所示。

表3.1 光源規格

此寬頻掃瞄式光源(Broadband Swept Laser Source)是用很快的速 度掃出一個很寬的波長範圍，其波長掃瞄速率大約為 20kHz，掃瞄寬 度為100nm，這使得 SS-OCT 系統有著 12μm(在空氣裡)的高縱向解 析度，其光源功率頻譜如圖3.1 所示。

Output spectrum of the laser.

The Broadband Swept Laser Source supports 20 kHz

wavelength sweeping rate with a 3 dB spectral bandwidth up to 100 nm, centered at 1325nm.

100nm

圖3.1 寬頻掃瞄式光源(Broadband Swept Laser Source)頻譜圖

3.1.2 SS-OCT 系統架構

本實驗所使用的是掃瞄式光源之光學同調斷層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT)，實驗架構大部分為 光纖結構，光源(Swept Laser Source，SLS)出來之後由光纖分光器 (Fiber coupler)分成兩條光纖(Fiber)，光源有一小部分從其中一條光纖 進入到馬赫-詹德干涉儀記錄器(Mach-Zehnder Interferometer clock，

MZI clock)，此部分最後會得到 MZI clock signal(MZI SIG.)進入平衡 式偵測器(balanced detector，BD)再進入 DAQ 的 CH1。光源的主要部

分則進入另外一條光纖到一個光纖式的麥克森干涉儀(Michelson interferometer)，由其中分光比為 50/50 的寬頻光纖分光器(Fiber coupler)將光源分為兩部分，一部份進入到參考端(Reference arm)，參 考端的光源先進到自由空間(free space)再打到靜止的反射鏡，再將光 源打回接收端的平衡式偵測器(balanced detector，BD)，另一部份進 入到樣品端(Sample arm)，樣品端的光源進到自由空間(free space)之 後經由雙軸 XY galvo 掃瞄鏡子打在樣品(Sample)上，最後將樣品的 反射光打回接收端的平衡式偵測器(balanced detector，BD)，參考端 與樣品端的光源會在接收端產生干涉訊號，即 OCT signal(OCT SIG.)，此主要 OCT 訊號進入 DAQ 的 CH2，因為光源為掃瞄式光源 (Swept Laser Source，SLS)所掃瞄的光源頻譜會有間距不一樣的情 形，所以最後得到的OCT signal(OCT SIG.)必須在頻譜上作校正，這 裡即是利用CH2 接收到的 MZI clock signal(MZI SIG.)來對 CH1 接收 到的OCT signal(OCT SIG.)進行頻譜的校正，將校正後的干涉頻譜作 傅利葉轉換(fast Fourier transform，FFT)即可得到樣品軸向深度的反 射訊號。

由表3.1可知，此係統的軸向掃瞄速度(Axial scan rate)為16kHz，

此即為一維(1D)訊號的掃瞄速率，而樣品經由雙軸XY galvo 掃瞄鏡 子的掃瞄之後，可以產生二維(2D)與三維(3D)的圖形，其二維的成像 速率在像素(pixels)為512×512時為每秒25張，其詳細規格如表3.2所 示。

表3.2 成像規格

3.2 樣品處理與量測 3.2.1 果蠅身體結構簡介

果蠅心臟(或稱背血管)位於背中線，被表皮所包覆著，如圖 3.3 所示，其位置由胸節(T2)到腹節(A7)，主要功能為提供營養、循環、

過濾血淋巴液，果蠅心臟共由 104 個不同類群及功能的心臟細胞所組 成，是一條會規律跳動的管狀構造，前端不會收縮，功能較類似血管，

故稱為主動脈(aorta)；後端具有規則收縮功能以及類似瓣膜構造稱為 ostiae 的結構，故後端稱為心臟(heart)，如圖 3.4 所示。在心臟每一次 收縮(跳動)中，血淋巴液(即果蠅的血液)從組織中經由 ostiae 流進心 臟(heart)的部位，前端則有血淋巴液自主動脈(aorta)流出背管進到組 織中，完成在果蠅開放式循環系統的功能。幼年之果蠅表皮呈半透 明，成年果蠅個體大約 2~3 釐米且表皮變成不透明，而其背血管(即 主動脈與心臟)位置由胸節到腹節，被表皮所包覆著，需要在具有高

度散射特性生物體內仍能取得觀測影像的斷層掃描技術。

Heart Heart aorta

aorta

(a) (b)

圖3.3 果蠅身體透視結構圖，(a)側視圖、(b)上視圖，紅色箭頭所指為果 蠅的心臟(heart)，藍色箭頭所指為果蠅的主動脈(aorta)，圖片修改自文獻

[27]。

圖3.4 果蠅心臟透視圖，A..為將果蠅切開後使用 green fluorescent protein (GFP) (1029-Ga4/UASGFP)的方法來觀察果蠅的心臟型態

、B.為示意圖，圖中左半部為皆為果蠅主動脈(aorta)，右半部皆為果蠅心 臟(heart)，圖片修改自文獻[28]。

3.2.2 果蠅培養

在試管底部放置食物，再將果蠅放進試管，試管口用棉花塞住，

如此讓空氣能夠進出，如此將試管放在25℃的恆溫環境下培養果蠅，

果蠅的生命週期大約為七到九週，我們採用隔週量測，每個種類，公 的跟母的各量測 1、3、5、7 週，每次量測 20 隻果蠅，每隻量測 30 秒，按照如此計算，一個種類總大約共需要量測160 隻果蠅。

3.2.3 果蠅處理與活體量測

果蠅只要接觸到二氧化碳(CO2)就會昏迷大概 5 到 10 分鐘，所以 先將果蠅用二氧化碳(CO2)迷昏，然後再將果蠅放在載波片上並且用 果凍膠固定，如用此法量測，量測時因為果蠅呈半昏迷狀態，所以身 體還是會一直動，如此便會造成在處理data時很多的不便，所以將果 蠅用二氧化碳(CO2)迷昏之後，先用麻醉劑將果蠅麻痺，我們採用的 麻醉劑為Fly Nap，從文獻[29]中知道，此麻醉劑幾乎不會影響果蠅心 臟的跳動，它可以使果蠅的身體不會動，麻醉劑Fly Nap是用氣體的 形式麻醉果蠅，只要讓果蠅接觸Fly Nap大約 5 到 10 分鐘，果蠅就能 被麻醉半小時左右，此時果蠅心臟會正常跳動，但身體卻不會動，這 時再將果蠅放在載波片(slide)上並且用果凍膠(Jelly glue)固定住果蠅 (Drosophila)的翅膀，如圖 3.5(b)所示。

將果蠅如圖 3.5(b)所示固定好之後，將此樣品放在掃瞄式光源之 光 學 同 調 斷 層 攝 影 系 統 (Swept Source Optical Coherence

Tomography，SS-OCT)的樣品端即可開始量測，如圖 3.5(a)所示。

slide

Jelly glue Drosophila

Fiber

C-scanning

translation stage slideslide

Jelly glue Drosophila

Fiber

C-scanning translation stage

^slide

Jelly glue Drosophila

slide

Jelly glue Drosophila

(a) (b)

圖3.5 (a)果蠅量測示意圖，(b)果蠅固定結構圖，將果蠅放在載波片(slide) 上並且用果凍膠(Jelly glue)固定住果蠅(Drosophila)的翅膀。