第五章 結論與未來展望
B. 為示意圖，圖中左半部為皆為果蠅主動脈(aorta)，右半部
3.2.2 果蠅培養
在試管底部放置食物，再將果蠅放進試管，試管口用棉花塞住，
如此讓空氣能夠進出，如此將試管放在25℃的恆溫環境下培養果蠅，
果蠅的生命週期大約為七到九週，我們採用隔週量測，每個種類，公 的跟母的各量測 1、3、5、7 週，每次量測 20 隻果蠅，每隻量測 30 秒，按照如此計算，一個種類總大約共需要量測160 隻果蠅。
3.2.3 果蠅處理與活體量測
果蠅只要接觸到二氧化碳(CO2)就會昏迷大概 5 到 10 分鐘，所以 先將果蠅用二氧化碳(CO2)迷昏，然後再將果蠅放在載波片上並且用 果凍膠固定，如用此法量測，量測時因為果蠅呈半昏迷狀態，所以身 體還是會一直動，如此便會造成在處理data時很多的不便，所以將果 蠅用二氧化碳(CO2)迷昏之後，先用麻醉劑將果蠅麻痺，我們採用的 麻醉劑為Fly Nap，從文獻[29]中知道，此麻醉劑幾乎不會影響果蠅心 臟的跳動，它可以使果蠅的身體不會動，麻醉劑Fly Nap是用氣體的 形式麻醉果蠅，只要讓果蠅接觸Fly Nap大約 5 到 10 分鐘，果蠅就能 被麻醉半小時左右，此時果蠅心臟會正常跳動，但身體卻不會動，這 時再將果蠅放在載波片(slide)上並且用果凍膠(Jelly glue)固定住果蠅 (Drosophila)的翅膀，如圖 3.5(b)所示。
將果蠅如圖 3.5(b)所示固定好之後，將此樣品放在掃瞄式光源之 光 學 同 調 斷 層 攝 影 系 統 (Swept Source Optical Coherence
Tomography，SS-OCT)的樣品端即可開始量測，如圖 3.5(a)所示。
slide
Jelly glue Drosophila
Fiber
C-scanning
translation stage slideslide
Jelly glue Drosophila
Fiber
C-scanning translation stage
slide
Jelly glue Drosophila
slide
Jelly glue Drosophila
(a) (b)
圖3.5 (a)果蠅量測示意圖，(b)果蠅固定結構圖，將果蠅放在載波片(slide) 上並且用果凍膠(Jelly glue)固定住果蠅(Drosophila)的翅膀。
3.3 果蠅突變種類說明
我們量測的果蠅種類共有六種(Line)，此由本校生命科學系所提供 如下所示。
Line =
1. W1118 => Control WT (Wild Type)
2. Δ168M1, Δ164F1 => Mutant gene deletion 3. UAS-Acer => Gain of function UAS-Acer
4. Mut8i, Mut9i => RNAi (會抑制 m-RNA)表現於全身 5. M8i, M9i => RNAi (會抑制 m-RNA)表現於中胚層
standard strain standard strain
gene mutation (Acer)
gene mutation (Acer)
W
1118為野生型的正常標準果蠅，其他四個種類皆為Acer基因的突 變種，UAS-Acer是將一個片斷UAS-Acer打入果蠅的Acer基因中，(Mut8i、Mut9i)與(M8i、M9i)皆為干擾m-RNA的生成，即會抑制m-RNA 的量，8i與 9i組是代表表現程度上的差別，(Mut8i、Mut9i)與(M8i、
M9i)為表現位置的不同，(Mut8i、Mut9i)表現於全身，而(M8i、M9i) 表 現於中胚層。
實驗中有利用 RTPCR 的方法來檢測這三種突變果蠅是否有突 變，RTPCR 可以檢測 m-RNA 的量，檢測結果可以確定這三種果蠅確 實發生突變。
突 變 種 果 蠅 (∆164F1 、 ∆168M1) 為 英 國 的 實 驗 室 所 研 發 ， (∆164F1、∆168M1)是從 Acer 的基因裡面去除掉一些重要的序列，
∆164F1、∆168M1 之間的差別為去除的序列不同。他們用 western 來 檢測 Acer 蛋白的量，檢測結果為：Acer 蛋白的量確實有減少，所以 確定∆164F1、∆168M1 為突變種果蠅。
3.4 影像處理
3.4.1 二維(2D)連續影像(M-mode)
量測果蠅心臟二維(2D)橫切面(transverse)，如圖 3.6 所示。
Light Light Light
a
圖3.6 (a)光照射在果蠅心臟橫切面(transverse)示意圖，圖片修改自文獻 [27]。
在圖 3.6 中，a 為雷射光照射在果蠅心臟橫切面(transverse)上的 示意圖，雷射光因為 X 軸掃瞄鏡子(galvo mirror)快速轉動的關係，打 下來的光是XZ 方向的平面，X 軸上的每個點都有 Z 軸深度掃瞄，所 以掃瞄到的是二維(2D)即時(real time)影像。量測到的果蠅二維(2D) 即時(real time)影像可以存成 *.IMG 或 *.AVI 等資料檔，如將其儲 存成連續圖檔，並將其排列在一起，即如圖3.7 所示。
Heart of Drosophila with an end-diastolic dimension (EDD) 100μm end systolic dimension (ESD)
1 2 3
4
6 5
Heart of Drosophila with an end-diastolic dimension (EDD) 100μm end systolic dimension (ESD)
1 2 3
4
6 5
圖3.7 果蠅(w1118)量測連續圖檔示意圖，圖片間之大箭頭與圖中數字編號 為時間順序，圖片中虛線圓圈部分為果蠅(Drosophila)的心臟部位。
在 圖 3.7 中，量測的是正常標準種類(standard strain)之果蠅 (w1118)，編號1 的圖片中用虛線所圈選的果蠅(Drosophila)心臟位置，
是果蠅心臟舒張(end-diastolic dimension，EDD)的時候，編號 2 的圖 片中用虛線所圈選的果蠅(Drosophila)心臟位置，是果蠅心臟收縮(end systolic dimension，ESD)的時候，由文獻[25]中得知，正常標準種類 (standard strain)之果蠅(w1118)心臟舒張(EDD)的維度大約為 76 + 3µm，心臟收縮(ESD)的維度大約為 8 + 2µm，與圖 3.7 中實際量測結 果相符。將圖3.7 處理成M-mode形式，如圖 3.8 所示。
W1118female 7week M-mode over 1 second EDD ESD
1 s
150μm
圖3.8 果蠅(w1118)量測心臟部位橫切面(transverse)M-mode示意圖。
3.4.2 心跳率(Heart Rate，HR)之處理
由文獻[26]中可以知道，正常標準種類(standard strain)之果蠅(w1118) 的心跳率大約為每秒 2～3.5 下，而我們所用掃瞄式光源之光學同調 斷層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT) 的即時(real time)影像可以達到每秒 22 張影像，這超過果蠅心跳率的 兩倍以上，根據取樣定理可以達到量測果蠅心跳率需求。
接下來，將量測到的果蠅二維(2D)橫切面(transverse)即時(real time) 影 像 ， 如 圖 3.7 所 示 ， 取 出 果 蠅 心 臟 為 舒 張 (end-diastolic dimension，EDD)的瞬間影像，如圖 3.7 編號 1 的圖片所示，參考圖 3.3 與圖 3.4 的果蠅心臟位置，雷射光掃瞄果蠅心臟橫切面(transverse) 的位置如圖3.9 中紅色虛線所示。
圖3.9 掃瞄果蠅心臟橫切面(transverse)位置圖，圖中紅色虛線即為雷射光 掃瞄果蠅之橫切面(transverse)位置，圖片修改自文獻[27]。
將選出來的果蠅心臟橫切面舒張(end-diastolic dimension，EDD) 與收縮(end systolic dimension，ESD)之瞬間影像在程式(MATLAB)上 作處理，選取出影像之心臟位置的範圍(Range Of Interest，ROI)，再 將其經過影像濾波器(Image filter)的處理，如圖 3.10 所示。
1 Image filter
EDD
Frame (time) (Heart beat) 4
Intensity
Frame (time) (Heart beat)
Finding out the EDD and ESD utilize change of rate of picture element in
the center
Namely find out the Heartbeat
Heart Rate
影像之心臟位置的範圍(Range Of Interest，ROI)。
經過影像濾波器(Image filter)的處理之後，得到如圖 3.10 中編號 3 之圖形，利用編號3 圖形中心圓圈位置像素之值的變化率找出果蠅心 臟舒張(end-diastolic dimension，EDD)與收縮(end systolic dimension，
ESD)的位置，也就是找到心跳(Heartbeat)，將心跳(Heartbeat)除上總
時間(Total time)即可得到心跳率(Heart Rate，HR)。
Frame (time) (Heart beat)
Intensity
Frame (time) (Heart beat)
Intensity
Frame (time) (Heart beat)
Intensity
Frame (time) (Heart beat)
Intensity
Frame (time) (Heart beat)
1 2 4 7 8 Frame Rate = 20 (Frm/s)
Total time
= Frm / FR = 40 / 20 = 2 (s) Heart Rate = Heart beat / Total time
= 8 / 2 = 4 (1/s)
將在圖 3.11 中，右下角編號為 b 的放大圖形再作解釋，此圖形 的縱軸為影像中像素的強度(Intensity)，橫軸為影像張數的位置，波 峰的位置即為ESD 的位置，波谷的位置即為 EDD 的位置，如圖 3.12 所示，其位置皆由程式計算出。
DouFri_minPosi = Columns 1 through 15
3 8 14 19 27 30 34 37 43 46 49 53 57 60 64
DouFri_maxPosi = Columns 1 through 15
4 11 16 25 28 32 35 39 44 48 51 55 58 63 66
Intensity
Frame (time) (Heart beat)
-Image Processing : HR (Heart Rate)
Frm 3
Frm 3 Frm 4Frm 4
Frm 8
Frm 8 Frm 11Frm 11 Frm 14Frm 14 Frm 16Frm 16
圖3.12 心跳(Heartbeat)曲線解釋圖，圖中縱軸為影像中像素的強度 (Intensity)，橫軸為影像張數的位置，波峰的位置即為 ESD 的位置，波谷
的位置即為EDD 的位置。
3.4.3 心臟舒張(EDD)與收縮(ESD)之處理
選出果蠅的心臟橫切面舒張(end-diastolic dimension，EDD)與收縮 (end systolic dimension，ESD)之瞬間影像在程式(MATLAB)上作處 理，與心跳率(Heart Rate，HR)之處理一樣選取出影像之心臟位置的 範圍(Range Of Interest，ROI)，如圖 3.13 所示，再將其經過影像濾波 器(Image filter)的處理，但這與心跳率(Heart Rate，HR)之處理的影像 濾波器(Image filter)有程度上的差別，比較圖 3.10 與圖 3.13 中編號 3 之圖形即可看出，在計算果蠅心臟舒張(EDD)與收縮(ESD)所用之影 像濾波器(Image filter)程度較低，因為程度過高會將心臟面積模糊化 並且有些微的縮小，所以使用程度較低的影像濾波器(Image filter)才 能正確計算出心臟大小。經過影像濾波器(Image filter)之後，將心臟 周圍部分反白以方便用程式自動化的方法計算心臟大小，如圖 3.13 中編號4 之圖形所示。
ESD ESD Image filter
(The degree is different from heartbeat rate of
calculation.) EDD EDD
EDD
ESD ESD
Around heart being white instead, in order to utilize automation to
calculate EDD and ESD area.
EDD ESDESD
Calculating the Figure of black picture element to received the area.
Then convert the area into an equivalent diameter .
ROI_EDD
ROI_ESD 100μm
1
Utilize Heart Rate find out the position of EDD and DSE.
2
3
4
EDD & ESD Calculating proves
Each Drosophila measuring 30 seconds.
During 30 seconds take out EDD and ESD 30-40 times to average separately
HeaEquDiamAuto_Mat =
ESD Diam.(Ave.)
= 17.26705 (um) ESD Diam.(Ave.)
= 17.26705 (um)
EDD Diam. (Ave.)
= 84.90480 (um) EDD Diam. (Ave.)
= 84.90480 (um) EDD
反白之後計算中間黑色空洞之面積即果蠅心臟面積，再將面積換 算成等效直徑，每隻果蠅固定量測 30 秒的時間，舒張(EDD)與收縮 (ESD)在此 30 秒內各別取 30～40 次的直徑作平均，最後的平均值即 為所求之果蠅心臟舒張(end-diastolic dimension，EDD)與收縮(end systolic dimension，ESD)直徑參數。
3.4.4 心肌縮短分率(Fractional Shortening，FS)之計算方法
FS (fractional shortening) 為心肌縮短分率
大 小
是利用EDD與ESD兩項參數所計算出，其計算公式為：
FS = [(EDD－ESD)/EDD]×100 其值的大小代表心臟收縮的程度
其值越 其值越
收縮程度越好 收縮程度越差 大
小
其值越 其值越
收縮程度越好 收縮程度越差
第四章 實驗結果與討論
本章將藉由第三章所建立的全自動化掃瞄式光源之光學同調斷 層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT)，
利用其三維快速掃瞄的優點對果蠅進行非侵入式縱切面、橫切面、以 µm，向後掃瞄(Backward scan)為 11.7 µm 與(4.12)式所計算出的 7.747 µm 接近，其誤差可能來自於系統中光學元件的非理想特性以及掃瞄 式光源在系統中的色散等難以避免的背景因素。
圖4.1 向前掃瞄(Forward scan)之點延伸函數(Point Spread Function)表示 在空氣中之縱向解析度
圖4.2 向後掃瞄(Backward scan)之點延伸函數(Point Spread Function)表 示在空氣中之縱向解析度
4.1.2 橫向解析度
掃過蓋玻片(Cover glass)的邊緣介面，訊號會從有反射訊號到沒有反 射訊號，如圖 4.4 所示。從圖 4.4 可以看到左邊中間的部分有兩條明 顯的干涉訊號，這是因為蓋玻片(Cover glass)上下兩個界面都會產生 反射訊號，兩個界面分別是空氣到玻片與玻片到空氣。
Y direction distance
Z direct ion dept h dist ance
1.5 mm
3. 0 m m
圖4.4 蓋玻片(Cover glass)二維影像量測結果，左邊中間有兩條明顯的干 涉訊號為蓋玻片(Cover glass)的兩層界面
在圖 4.4 蓋玻片(Cover glass)二維影像中，取出一條在 Z 方向深 度在1.29mm，並沿著 Y 方向位置從 0.8mm 到 0.85mm 的一維訊號如 圖4.5 所示。
Y direction distance (μm)
Intensity (a.u.)
圖4.5 從蓋玻片(Cover glass)二維影像量測結果取出 Z 方向深度在 1.29mm，並沿著 Y 方向位置從 0.8mm 到 0.85mm 的一維訊號
在圖 4.5 中，此 Y 方向的一維訊號，即代表蓋玻片(Cover glass) 邊緣的步階函數(Step Function)與系統橫向點擴散函數(Point Spread Function，PSF)的摺積(Convolution)，所以若對此一維訊號作微分後，
就可以得到系統橫向的點擴散函數，如圖 4.6 所示。
14. 58μm
260. 42μm Y direction distance (μm)
differential normalize Intensity (a.u.)
圖4.6 蓋玻片(Cover glass)二維影像中，取出 Y 方向一維訊號做一次微分 後的點擴散函數(Point Spread Function，PSF)。
由此點擴散函數(Point Spread Function，PSF)可以推算出系統實
Heart of Drosophila
a
b
d c
圖4.7 a.與 c.分別為果蠅(Drosophila)橫切面(transverse)量測示意圖與量 測結果圖 ，b.與 d.分別為果蠅(Drosophila) 縱切面(longitudinal)量測示意
圖與量測結果圖。
在圖 4.7 中，紅色虛線所圈選的位置為果蠅(Drosophila)心臟位 置，a.與 b.分別為雷射光打在果蠅上的示意圖，雷射光因為 X 軸掃瞄 鏡子(galvo mirror)快速轉動的關係，打下來的光是 XZ 方向的平面，
X 軸上的每個點都有 Z 軸深度掃瞄，所以掃瞄到的是二維(2D)即時 (real time)影像。量測到的果蠅二維(2D)即時(real time)影像可以存成
*.IMG 或 *.AVI 等資料檔，也可將其儲存成連續圖檔。
4.3 資料分析
我們分別量測正常標準種類(standard strain)之果蠅(w1118)，與多種 不同心臟突變(mutation)之果蠅(Mut8i、Mut9i、M8i、M9i、∆164F1、
∆168M1、UAS-Acer)。突變種的果蠅皆有同樣在心臟收縮不完全之異 常現象，只是在心臟收縮不完全的程度上有差別。
4.3.1 量測正常標準種類果蠅(w1118)與兩種心臟突變(mutation)之 果蠅(Mut8i、Mut9i)
第一次的實驗分別量測正常標準種類(standard strain)之果蠅(w1118) 與兩種心臟突變(mutation)之果蠅(Mut8i、Mut9i)，並做此三種果蠅參 數之間的比較與分析。
4.3.1.1 公(male)與母(female)Data 之比較
首先比較正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophil
a， w
1118)
公(male)與母(female)之心跳率(Heart Rate，HR)，如圖 4.12 所示，從 圖中的紅線(所有Data的平均值)可以看出公(male)與母(female)心跳 率皆在每分鐘 250～300 下之間，結果顯示公(male)與母(female)之間 的心跳率差異不大，此結果與文獻[50]吻合。HR
w
w11181118 male ww11181118 female
week
week weekweek
w1118at 1, 3, 5,and 7 weeks of age at 25°C showing heart rate (HR) in beats per minute (bpm). All data are expressed as individual data points (left, N=20) and mean + standard error (right). The red line of the middle is the average of all Data.
N=20 N=20
圖4.12 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，
w
1118)公(male)
與母(female)培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心跳率(Heart Rate，HR)比較圖，圖中縱座標心跳率(HR)之單位為平均每分鐘跳動幾下(beats per minute，bpm)，橫座標為果蠅成長之週數(week)，所有Data皆表示成左邊
圖，圖中縱座標心跳率(HR)之單位為平均每分鐘跳動幾下(beats per minute，bpm)，橫座標為果蠅成長之週數(week)，所有Data皆表示成左邊