以光學同調斷層攝影術評估果蠅的心臟功能
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(2) 致謝 親愛的天父 感謝讚美 祢 在 祢寶血救贖之下， 因著 祢的恩惠與慈愛，讓我受到太多人的幫助，才使此研究有一點 點微薄的成果，希望此論文也能對別人有幫助。 願恩惠平安從我們的父 神 和 主耶穌基督 臨到全世界正在受苦的千萬靈魂。 將一切榮耀歸給 上帝，我們的父 神，直到永遠。 感謝讚美 奉 主耶穌基督 得聖的尊名 阿們. 首先感謝我的指導教授郭文娟老師，感謝老師在我換老師的時候收留我，雖 然我的程度很差，資質很差，說話行事很笨，且也常常沒有禮貌，但老師溫柔的 心，還是收留了我，進了實驗室之後，做錯了很多事情，給了老師很多的麻煩， 但老師還是每次都會原諒我這個不肖的學生，且不斷細心的教導我，讓我在實驗 室的兩年中學到很多的東西，還告訴我的未來應該如何規劃才是最好的，實在很 感謝老師對我的教導與寬容。 感謝台師大命科學系的蘇銘燦老師，老師很親切的對每一個人都像朋友一 般，並且耐心的教導我，告訴我很多生物方面的相關知識。 感謝台大獸醫系徐久忠老師和台大醫院醫學腫瘤部成佳憲醫師，感謝你們在 口試中對我論文的指導，感謝你們寶貴的意見，讓我獲益良多，你們的建議我都 有紀錄起來，以圖改進。 感謝教務長洪姮娥老師與楊謝樂老師，感謝你們的教導，讓我也在你們實驗 室學到許多東西。 感謝文宏學長與勝宗學長，不管是在以前的實驗室，還是在現在的實驗室， 都教我好多的東西，並且每次在我有困難的時候，都會很熱心的來幫我想辦法， 鼓勵我，帶我去吃好吃東西，讓我很感動。感謝陽明大學博士班的奐璋學長，他 有來我們師大的時候，我總是煩著他一直問他問題，而學長也是不厭其煩的一直.
(3) 回答我的問題，感謝學長。 感謝台師大生科系博士班的芳足學姐總是很有耐心的教導我很多生物方面 的知識，而我總是常常忘記學姐所說的，但學姐還是很有耐心的反覆教導我。 謝謝我的拍檔大熊，他教導我很多事情，也教我很多的實驗，也常常陪我說 話聊天，鼓勵我，激勵我，我們一起熬夜做實驗，好懷念這些時光。 謝謝坐在我旁邊的哲泓，我們常常一起討論，而我總是對他口氣很不好，謝 謝哲泓總是容忍我，也幫我很多實驗的需要，感謝富傑，常常跟我聊天，常常陪 我吃飯，我們也與富傑常常一起在學七吃飯。感謝瑋晨總是讓我們開心，常常幫 我們處理很多的事情，你的歌聲總是很好聽，我好喜歡。謝謝明諭總是關心我們， 告訴我們很多事情，也教我很多實驗，告訴我們很多好吃的東西，也帶很多好吃 的給我們。 感謝協誠幫我做了好多實驗，我的好多實驗都是因為有協誠的幫忙才能完 成，協誠功課很棒，常常拿獎學金，也常常跟我們分享很多事情，也常常拿零食 跟我們一起吃。謝謝惠雯，我們有同樣的興趣，音樂，而妳懂得比我多很多，所 以妳總是常常告訴我很多相關的知識，常常跟妳聊天，聊到了很多的事情，讓我 知道妳的思想非常豐富，我總是喜歡聽妳說。感謝孟翰，當我想說話時候，你都 會陪我說話，聊天，跟我聊很多的事情，也常常都幫忙我處理很多的事情。感謝 瓊瑀，妳總是教導我很多道理，常常與我分享事情，縱使我一直做錯事情，說錯 話，妳還是都會原諒我，還是會不斷的很有耐心的教導我，隨時關心我，督責我， 鼓勵我，妳也是實驗室的開心果。 感謝瑞蓉姐常常照顧我們，幫我們處理很多學校行政，也常常陪我們一起吃 飯，感謝大姊與沙沙還有很多所辦的人。 感謝所上的學長姐振傑，冠嵐、智勝、業展、智魁、均達、璧華、璟衡、宜. 修、義勝、力強、世雍對我的照顧與幫忙，不管是實驗還是生活上都幫忙，還要 感謝我的同學茂東、廷維、昱志、成基、智鴻、永宗，顗彭、正峰、伯翰、宏偉、. 芷怡、坤葦、偉毅、祖欣、心雄、孟楨、寶忠、文新、睿翔、明成、培新、培碩、 建宏、柏源、培源等，好懷念與你們在一起的時光。 最後感謝我的父母，感謝你們很辛勞的養育我，為我默默的做了很多的事， 而我卻是只知道要如何違逆你們，一直犯錯，常常說謊，不想聽你們的話，只會 跟你們要錢，讓你們生氣，但你們還是一直不停的原諒我，幫我解決麻煩，一直 愛我，我對不起你們，我是不孝的兒子，你們辛勞，我都記在心裡，感謝你們。 謹以這篇論文和所有研究成果獻給所有我的師長、朋友與家人，我愛你們。 願 神賜福保守你們每一個人 平安喜樂 直到永遠。阿們. 楊博年 於 2008 年 8 月 13 日.
(4) 中文摘要. 本研究提出用三維快速高解析度掃瞄式光學同調斷層儀 (SS-OCT)系統以進行非侵入式活體成蟲果蠅心臟造影成像，分別量測 正 常 標 準 種 類 之 果 蠅 (Drosophila ， w1118) ， 與 心 臟 突 變 之 果 蠅 (UAS-Acer、Mut8i、Mut9i、M8i、M9i、∆164F1、∆168M1)。並利用 影像後處理的資訊取得果蠅各項心臟功能參數，如心跳率(Heart Rate，HR)、心臟舒張維度(end-diastolic dimension，EDD)、心臟收 縮維度(end-systolic dimension，ESD)以及心肌短縮分率(fractional shortening，FS)，本研究目的包括(1)測試此套系統是否適用於清醒的 成蟲果蠅之心臟功能精確量測；(2)判定果蠅是否為一個合適的重建 人類心臟病的模式動物系統。. 關 鍵 字 : 心 跳 率 (Heart Rate ， HR) 、 心 臟 舒 張 維 度 (end-diastolic dimension，EDD)、心臟收縮維度(end-systolic dimension，ESD)、心 肌短縮分率(fractional shortening，FS). I.
(5) Abstract In this study, a three dimensional fast scanning and high resolution Swept Source. optical. coherence. tomography. (SS-OCT). system. for. non-invasively imaging the heart in adult awake Drosophila of a standard strain (w1118) and mutation with cardiac function(UAS-Acer、Mut8i、 Mut9i、M8i、M9i、∆164F1、∆168M1) is proposed. Heart functions such as Heart Rate (HR), end-diastolic dimension (EDD), end-systolic dimension (ESD), and fractional shortening (FS) were acquired by image post processing. The objectives of this study including: (1) to test whether the SS-OCT system could be applied to accurately measure cardiac function in awake adult Drosophila; (2) to determine whether the fly can be used as a model system to recapitulate human heart diseases.. Key words :. Heart Rate(HR), end-diastolic dimension(EDD),. end-systolic dimension(ESD),. fractional shortening(FS). II.
(6) 目錄. 中文摘要-------------------------------------------------------------------------- I 英文摘要--------------------------------------------------------------------------Ⅱ 目錄--------------------------------------------------------------------------------Ⅲ 圖目錄索引--------------------------------------------------------------------- Ⅶ 表目錄索引--------------------------------------------------------------------- XI. 第一章. 緒論-------------------------------------------------------------------- 1. 1.1. 研究動機與目的----------------------------------------------------------- 1. 1.2. 文獻回顧-------------------------------------------------------------------- 3 1.2.1 光學同調斷層攝影術(OCT) ---------------------------------- 3 1.2.2 掃瞄式光源之光學同調斷層攝影術(SS-OCT) ------------ 4 1.2.3. 血 管 收 縮 素 轉 換 酶 (ACE) 與 血 管 收 縮 素 相 關 轉 換 酶 (Acer)------------------------------------------------------------- 5. 1.3. 論文架構-------------------------------------------------------------------- 6. 第二章 2.1. 理論背景-------------------------------------------------------------- 7. 低同調干涉術與系統解析度-------------------------------------------- 7 2.1.1. 低同調光源------------------------------------------------------ 7. 2.1.2 低同調干涉術(LCI)--------------------------------------------- 9 2.1.3 縱向解析度----------------------------------------------------- 13 2.1.4 橫向解析度----------------------------------------------------- 15 2.2. 頻域光學同調斷層攝影術(SD-OCT)------------------------------- 18. 2.3 掃瞄式光源之光學同調斷層攝影術(SS-OCT)--------------------- 20 III.
(7) 第三章 3.1. 實驗架構、原理與方法-------------------------------------------- 22. 實驗儀器與系統架構------------------------------------------------ 22 3.1.1 光源-------------------------------------------------------------- 22 3.1.2 SS-OCT 系統架構---------------------------------------------- 23. 3.2. 樣品處理與量測--------------------------------------------------------- 25 3.2.1. 果蠅身體結構簡介-------------------------------------------- 25. 3.2.2. 果蠅培養-------------------------------------------------------- 27. 3.2.3 果蠅處理與活體量測 ---------------------------------------- 27 3.3. 果蠅突變種類說明------------------------------------------------------ 29. 3.4. 影像處理 ---------------------------------------------------------------- 30 3.4.1. 二維(2D)連續影像(M-mode) ------------------------------- 30. 3.4.2 心跳率(Heart Rate，HR)之處理 -------------------------- 32 3.4.3. 心臟舒張(EDD)與收縮(ESD)之處理 -------------------- 36. 3.4.4 心肌縮短分率(Fractional Shortening，FS)之計算方法 ------------------------------------------------------------------- 38. 第四章 4.1. 實驗結果與討論---------------------------------------------------- 39. 系統空間解析度量測--------------------------------------------------- 39 4.1.1 縱向解析度----------------------------------------------------- 39 4.1.2 橫向解析度----------------------------------------------------- 41. 4.2 量測結果------------------------------------------------------------------ 44 4.2.1 二維(2D)影像--------------------------------------------------- 44. IV.
(8) 4.3. 資料分析 ----------------------------------------------------------------- 46 4.3.1. 量測正常標準種類果蠅(w1118)與兩種心臟突變(mutation) 之果蠅(Mut8i、Mut9i) ----------------------------------------46 4.3.1.1. 公(male)與母(female)Data 之比較 ---------------- 46. 4.3.1.2. 正常標準種類(standard strain)果蠅(w1118)與心臟突 變 (mutation) 果 蠅 (Mut8i 、 Mut9i) 心 跳 率 (Heart Rate，HR)之比較 ------------------------------------- 50. 4.3.1.3. 正常標準種類(standard strain)果蠅(w1118)與心臟突 變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i) 心肌短縮分率 (fractional shortening，FS)之比較 ----------------- 53. 4.3.2. 量 測 正 常 標 準 種 類 果 蠅 (w1118) 與 另 外 五 種 心 臟 突 變 (mutation) 之 果 蠅 (M8i 、 M9i 、 ∆164F1 、 ∆168M1 、 UAS-Acer)----------------------------------------------------- 60. 4.3.2.1. w1118與M8i、M9i、∆164F1、∆168M1、UAS-Acer 心臟收縮維度(ESD)之比較-------------------------- 60. 4.3.2.2. w1118與M8i、M9i、∆164F1、∆168M1、UAS-Acer 心肌短縮分率(fractional shortening，FS)之比較 ----------------------------------------------------------- 64. 4.3.2.3. w1118與M8i、M9i、∆164F1、∆168M1、UAS-Acer 之量測結論---------------------------------------------- 68. V.
(9) 第五章. 結論與未來展望---------------------------------------------- 69. 5.1. 討論------------------------------------------------------------------------ 69. 5.2. 結論-------------------------------------------------------------------------73. 5.3. 未來展望------------------------------------------------------------------ 75. 參考文獻------------------------------------------------------------------------- 76. VI.
(10) 圖目錄索引 圖 2.1. 干涉條紋亮度與光路徑位置關係圖---------------------------- 8. 圖 2.2. 基本的麥克森干涉儀架構---------------------------------------- 9. 圖 2.3. 圖 2.3 解析力說明圖----------------------------------------------13 (a)兩點可分辨------------------------------------------------------13 (b)兩點恰可分辨---------------------------------------------------13 (c)兩點不可分辨-------------------------------------------------- 13. 圖 2.4. 光源波長與組織吸收關係圖------------------------------------ 14. 圖 2.5. 高斯光場分佈聚焦點大小以及景深示意圖------------------ 15. 圖 2.6. TD-OCT 系統架構------------------------------------------------ 18. 圖 2.7. SD-OCT 系統架構------------------------------------------------ 19. 圖 2.8. SS-OCT 系統架構------------------------------------------------ 21. 圖 3.1. 寬頻掃瞄式光源(Broadband Swept Laser Source)頻譜----- 23. 圖 3.3. 果蠅身體透視結構圖---------------------------------------------- 26 (a)側視圖------------------------------------------------------------ 26 (b)上視圖------------------------------------------------------------ 26. 圖 3.4. 果蠅心臟透視圖-----------------------------------------------------26 A.為將果蠅切開後使用 green fluorescent protein (GFP) (1029-Ga4/UASGFP)的方法來觀察果蠅的心臟型態 --------------------------------------------------------------------26 B.為示意圖，圖中左半部為皆為果蠅主動脈(aorta)，右半部 皆為果蠅心臟(heart)---------------------------------------------26. 圖 3.5. (a)果蠅量測示意圖------------------------------------------------28 (b)果蠅固定結構圖------------------------------------------------28 VII.
(11) 圖 3.6. (a)光照射在果蠅心臟橫切面(transverse)示意圖------------ 30. 圖 3.7. 果蠅(w1118)量測連續圖檔示意圖 ------------------------------ 31. 圖 3.8. 果蠅(w1118)量測心臟部位橫切面(transverse)M-mode示意圖 ----------------------------------------------------------------------- 32. 圖 3.9. 掃瞄果蠅心臟橫切面(transverse)位置圖 ------------------- 32. 圖 3.10. 果蠅心跳率處理流程圖 ---------------------------------------- 33. 圖 3.11. 圖 3.10 中編號 4 的心跳(Heartbeat)曲線放大圖與心跳計算 方法 ---------------------------------------------------------------- 34. 圖 3.12. 心跳(Heartbeat)曲線解釋圖 ----------------------------------- 35. 圖 3.13. 果蠅心臟舒張(EDD)與收縮(ESD)處理流程圖 ------------ 37. 圖 4.1. 向前掃瞄(Forward scan) 之點延伸函數(Point Spread Function)表示在空氣中之縱向解析度---------------------- 40. 圖 4.2. 向後掃瞄(Forward scan) 之點延伸函數(Point Spread Function)表示在空氣中之縱向解析度---------------------- 40. 圖 4.3. 橫向掃描一片蓋玻片的示意圖---------------------------------41 (a)為側視圖-------------------------------------------------------41 (b)為上視圖-------------------------------------------------------41. 圖 4.4. 蓋玻片(Cover glass)二維影像量測結果----------------------- 42. 圖 4.5. 從蓋玻片(Cover glass)二維影像量測結果取出 Z 方向深度在 1.29mm，並沿著 Y 方向位置從 0.8mm 到 0.85mm 的一維訊 號---------------------------------------------------------------------43. 圖 4.6. 蓋玻片(Cover glass)二維影像中，取出 Y 方向一維訊號做一 次微分後的點擴散函數(Point Spread Function，PSF) ------43. VIII.
(12) 圖 4.7. a.與 c.分別為果蠅(Drosophila)橫切面(transverse)量測示意 圖與量測結果圖 --------------------------------------------------44 b.與 d.分別為果蠅(Drosophila) 縱切面(longitudinal)量測示 意圖與量測結果圖------------------------------------------------44. 圖 4.12. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)公 (male)與母(female)培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心跳率 (Heart Rate，HR)比較圖---------------------------------------- 47. 圖 4.13. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)公 (male)與母(female)培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心臟舒張 維度(end-diastolic dimension，EDD)與心臟收縮維度 (end-systolic dimension，ESD)比較圖------------------------- 48. 圖 4.14. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下)公(male)與母(female)心肌短縮分 率(fractional shortening，FS)比較圖----------------------------49. 圖 4.15. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心跳率(Heart Rate，HR)比較圖--------- 51. 圖 4.16. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心臟舒張維度(EDD)比較圖------------- 54. 圖 4.17. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心臟收縮維度(ESD)比較圖------------- 55. IX.
(13) 圖 4.18. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心肌短縮分率(fractional shortening，FS) 比較圖-------------------------------------------------------------- 56. 圖 4.19. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與 心臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心臟收縮維度(ESD)與心肌短縮分率 (fractional shortening，FS)比較圖------------------------------- 58. 圖 4.20. 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(M8i、M9i、∆164F1、∆168M1、 UAS-Acer)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心臟 收縮維度(ESD)圖-------------------------------------------------61. 圖 4.21 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(M8i、M9i、∆164F1、∆168M1、 UAS-Acer)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心臟收 縮維度(ESD)比較圖---------------------------------------------- 63 圖 4.22 下頁為圖 4.22，正常標準種類(standard strain)之果蠅 (Drosophila，w1118)與心臟突變(mutation)果蠅(M8i、M9i、 ∆164F1、∆168M1、UAS-Acer)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週 在 25℃恆溫下心肌短縮分率(fractional shortening，FS)圖 ------------------------------------------------------------------------65 圖 4.23 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(M8i、M9i、∆164F1、∆168M1、 UAS-Acer)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心肌短 縮分率(fractional shortening，FS)比較圖----------------------67. X.
(14) 表目錄索引 表 3.1. 光源規格------------------------------------------------------------ 22. 表 3.2. 成像規格------------------------------------------------------------ 25. XI.
(15) 第一章 緒論. 本章介紹研究的動機與目的，並對光學同調斷層攝影術 (optical coherence tomography)和掃瞄式光源之光學同調斷層攝影術(Swept Source OCT)及其相關理論做簡單的文獻回顧，最後是本論文的架構 以及每個章節的簡介。. 1.1 研究動機與目的 正常人的心臟位於胸腔左側，由心中隔分為左右心房及左右心 室，左心房接受來自肺部的鮮血(充氧血)，經由左心室及主動脈送到 全身，提供體內各細胞所需的養分及氧氣；而由上下腔靜脈流回來的 靜脈血(低氧血)則是經由右心房、右心室、及肺動脈到達肺部進行氣 體交換，此過程交換新鮮的氧氣再回到左心房，如此週而復始。生理 上，心臟提供血液循環全身的動力，接受靜脈血回來、並將動脈血打 出去，是人體血液循環的幫浦，因此心臟是動物體最重要的器官之ㄧ。 根據行政院衛生署的統計，在 2005 年當中心臟疾病為我國人十 大死亡原因第三名，在女性部分，位居第四名，若是單看男性部分， 則高達第二名[30]。由此可知心臟疾病的致死率很高，而心臟疾病大 致上又可分為先天性的心臟疾病與成人的心臟疾病，本研究重點在於 成人心臟病致病基因篩選之研究，希望可以藉此研究對心臟疾病有所 貢獻。 由於實驗材料取得的緣故，要調控人類心臟基因以研究成人心臟 病致病機轉並不可行，因此本研究將與本校生命科學系合作，採用果 蠅動物模式進行成人心臟病致病基因之研究。因為果蠅的結構相較簡 單，且繁殖能力強、生活周期短、突變株眾多，使得在短時間內繁殖 -1-.
(16) 出大量特定品系的果蠅變得十分便利、再加上果蠅基因體計畫的完 成，多顯現出果蠅在當模式動物的好處，因此果蠅已經被用來當作模 式動物以研究人類許多疾病，包括神經退化性疾病，如阿茲罕默症[1] 及帕金森氏症[2]、糖尿病[3]、以及癌症[4]等。另外，若撇開型態上 的差別，果蠅與脊椎動物的心臟皆是由中胚層的兩側形成，並於中線 部分癒合成管狀，除了果蠅心臟形成是靠背側、而脊椎動物則靠腹側 之外，不過到後期脊椎動物通常還會有進ㄧ部的捲曲、形成腔室；而 在參予控制心臟特化及分化的基因，如轉錄因子:trinman、gata4、mef2 在果蠅及哺乳類動物心臟發育的過程中表現出類似型態及相似功 能，因此果蠅也是研究人類心臟發育很好的模式動物。 果蠅心臟(或稱背血管)位於背中線，被表皮所包覆著，成年後的 果蠅表皮變成不透明的，故不易於果蠅成蟲上觀察其心臟功能與結 構，先前有文獻針對成蟲果蠅的心臟功能研究，其主要是藉由邊緣檢 測顯微鏡量測心臟外部表面大小，或採用電刺激法得到心跳周期等參 數[5-8]，這些方法並無法提供心臟內部管腔大小以及足夠判定為心臟 病的心臟功能參數。因此若能建立一種非侵入式能精確測量在活體成 蟲果蝇內心臟病表徵的技術，將能提供對果蝇此種模式動物做快速篩 檢成人心臟病致病基因及研究致病機轉的方法。 在本研究中提出用三維快速高解析度掃瞄式光學同調斷層儀 (SS-OCT)系統以進行非侵入式縱切面、橫切面、以及M-mode隨時間 變化等三種掃描面的活體成蟲果蠅心臟造影成像，並進一步與本校生 命科學系合作，分別量測正常標準種類之果蠅(Drosophila，w1118)，與 心臟突變之果蠅(UAS-Acer、Mut8i、Mut9i、M8i、M9i、∆164F1、 ∆168M1)。並利用影像後處理的資訊取得果蠅各項心臟功能參數，如 心跳率(Heart Rate，HR)、心臟舒張維度(end-diastolic dimension， EDD)、心臟收縮維度(end-systolic dimension，ESD)以及心肌短縮分. -2-.
(17) 率(fractional shortening，FS)，本研究目的包括(1)測試此套系統是否 適用於清醒的成蟲果蠅之心臟功能精確量測；(2)判定果蠅是否為一 個合適的重建成人心臟病的模式動物系統。. 1.2. 文獻回顧. 1.2.1 光學同調斷層攝影術(OCT) 光學同調斷層掃描儀(optical coherence tomography, OCT)是一種 非侵入式、非破壞式的造影技術[9,10]，OCT 利用屬於時域上的低同 調干涉技術，對不同光程差的逆向散射光作檢測，得到一連串的干涉 波包，由於多次散射光會破壞光的同調性質，OCT 所量測到的信號 可排除多次散射光的信號，主要以直進光子或蛇行光子(ballistic or snake photons)來成像，再加上它採用的是近紅外光波段的光源，因此 可以得到高散射生物介質內的光學資訊。因此自 1991 年 OCT[11]此 一技術被提出後隨即應用於半透明的生物組織造影上(例如眼球前房 及角膜的部份[12]，非洲蛙的蝌蚪[13,14]等)以及具有對光高度散射的 組織(例如視網膜[11]、腸胃道等管腔結構內[15])。. -3-.
(18) 1.2.2. 掃瞄式光源之光學同調斷層攝影術(Swept Source OCT) 由於成年果蠅個體大約 2~3 釐米且表皮不透明，需要在具有高度. 散射特性生物體內仍能取得觀測影像的斷層技術，而其背血管位置由 胸節到腹節，被表皮所包覆著，背血管的後端具有規則收縮功能的心 臟，其收縮及舒張終末管腔體積分別約僅 8μm 及 80μm 左右，需要 足夠高解析度的顯微影像平台才能精確測量正常與病變的心臟大 小，再加上由於麻醉劑會引起實驗動物的心律不整及改變心臟正常功 能[16-19]，因此需要有高速掃瞄的技術能以非侵入式、不需麻醉的情 況下，在活體果蠅內測量到正確的心臟功能參數。本篇論文所使用的 掃瞄式光源之光學同調斷層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT)有高於傳統時域光學同調斷層攝影術(Time domain OCT，TD-OCT)的軸向掃瞄速度(Axial scan rate = 16kHz)，成 像速率大約在每秒 25 張(512×512 pixels)左右，其軸向解析度在空氣 中大約為 12μm，優於一般 OCT 的影像的軸向解析度(20~30μm)。 此外，探頭與觀測生物樣品之間有不需接觸的優點，因此本研究所提 出之高速光學同調斷層顯微觀測平台將適用於活體成蟲果蠅動物模 式下，並與本校生命科學系合作進行成人心臟病致病機轉與致病基因 篩選之研究。. -4-.
(19) 1.2.3. 血管收縮素轉換酶(ACE)與血管收縮素相關轉換酶(Acer). 由 文 獻 [33] 可 知 ， 血 管 收 縮 素 轉 換 酶 (Angiotensin-converting enzyme，ACE)家族對於心臟發育及型態有重要的影響，近年研究顯 示 哺 乳 類 ACE 及 其 在 果 蠅 的 同 源 基 因 血 管 收 縮 相 關 轉 換 酶 (Angiotensin-converting enzyme related，Acer)在胚胎發育時期表現於 心臟及附屬組織。由於果蠅和脊椎動物在心臟發育的型態和基因調控 上有高度的保守性，且為研究心臟發育的優良模式，本研究之突變果 蠅皆為表現與調控Acer基因之結果。原位雜和顯示Acer為母系遺傳基 因，最早可在受精卵中偵測到，在胚胎開始發育後隨即消失，直到germ band 完全延伸時表現於背部的中胚層，當心臟先驅細胞形成後，Acer 亦持續地表現在這些心肌細胞，直到外胚層背部癒合，且心肌細胞由 兩側移動至背中線處結合形成管狀器官，Acer在心臟特異性的表現顯 示其在心臟發育扮演一定的角色，而先前研究也證實在Acer的突變胚 胎心肌及圍心細胞有缺失的性狀。 心血管疾病在二十一世紀將會是個嚴重的問題[34]，心臟病主要 的危險因子是高血壓[35]。高血壓是由遺傳和環境因子共同控制的多 因子病徵[36]，許多環境因子像是飲食已經是眾所周知的，但是我們 對造成心臟病的遺傳因子瞭解並不多。Renin-angiotensin system (RAS) 是 維 持 血 壓 恆 定 很 重 要 的 調 控 系 統 ， renin 會 將 血 管 收 縮 原 (angiotensinogen)末端幾個胺基酸切掉形成 angiotensin I (Ang I，胺基 酸組成：DRVYIHPFHL)，Angiotensin-converting enzyme (ACE)再將 Ang I 末端的 histidine 和 leucine 切掉形成真正能促進血管平滑肌收縮 的血管收縮素(angiotensin II、Ang II，胺基酸組成：DRVYIHPF)[37]。 Ang II 還會刺激心臟的生長，可能與心肌肥大與肌母細胞增生有關。 Ang II 合成量增加引起的細胞反應，最終可能導致細胞功能喪失、收 縮能力和存活率也會受到影響[38]。 -5-.
(20) 1.3. 論文架構 本論文的實驗內容主要包括 SS-OCT 系統的測試與量測，利用此. 系統量測果蠅影像，並用果蠅影像後處理取得各項參數，且將參數作 整合與分析，本論文架構可分成以下五個章節: 第一章：簡述本論文的研究動機與目的，以及 OCT、SS-OCT、ACE 與 Acer 的研究背景。 第二章：簡介在本論文中所用到的光學參數其物理及數學上的基本意 義，包括低同調干涉術與其系統解析度，並將 SD-OCT 與 SS-OCT 做簡單的介紹。 第三章：說明實驗架構、系統原理與實驗方法。 第四章：展示實驗系統的量測結果、說明果蠅參數後處裡流程，並將 量測參數作整理統計與分析。 第五章：結論和未來可能的發展。. -6-.
(21) 第二章 理論背景. 本章將介紹低同調干涉術與其系統解析度，並簡介頻域光學同 調斷層攝影術(Spectral domain OCT，SD-OCT)與掃瞄式光源之光學同 調斷層攝影術(Swept Source OCT，SS-OCT)。. 2.1. 低同調干涉術與系統解析度 (Low coherence interferometry and system resolution). 2.1.1. 低同調光源(Low coherence light source) 同調性光源是指光源具有一波長範圍的光譜，也就是由不同波長. 的光所組合而成的寬頻光源，一般功率頻譜呈現高斯分佈的狀態，在 高斯分佈的功率頻譜中，最高值即為此光源的發光頻率，也稱作中心 波長。由於其頻寬較寬，也就是此光源包含各個不同頻率的光，因此 產生的各頻率的光波之間相位沒有固定的關聯性，所以同調度較差甚 至為非同調光。 由於光源的同調性會影響直接光干涉的情況，因此使用低同調光 源時，由於其同調距離很短，大約只有數十微米甚至以下，若是參考 光束與訊號光束的光程產生差異時，就無法產生干涉訊號，如圖 2.1。 所以我們可藉此特性作為精密量測使用。. -7-.
(22) 圖 2.1 干涉條紋亮度與光路徑位置關係圖. 一般實驗室使用的低同調光源有弧光燈，發光二極體，寬頻短脈 衝雷射等等，本論文中的極化光學同調斷層攝影系統使用超發光二極 體(Superluminescent Diode，SLD )做為量測光源。. -8-.
(23) 2.1.2. 低同調干涉術(Low coherence interferometry) 圖 2.2 是 一 個 基 本 的 麥 克 森 干 涉 儀 架 構 (Michelson. interferometer)，當雷射光從光源端射出時，遇到分光鏡(BS)將光分為 兩道，一道穿透分光鏡往 M2，一道被分光鏡反射往 M1，再分別從 M1 及 M2 兩面反射鏡將光線反射回原路徑，在分光鏡合成後往偵測 器(detector)方向行進，由偵測器接收光訊號，而偵測器所接收到的光 訊號是由這兩道光相加後的光強度。. M1. M2 Light source. BS. E2. E1. detector. 圖 2.2 基本的麥克森干涉儀架構. -9-.
(24) 假設兩道光的電場分別為E1和E2，則在偵測器端所接收到的強度為：. Id = E 2 =. =. 1 T. +. 1 T. t0 +. T 2. ∫ [E (t) + E 1. T 2. t0 +. 2. ∫ E1 (t) + E1 * (t) dt + t0 -. 1 T. T 2. t0 +. T 2. ∫ [E (t)E 1. t0 -. (t - τ ) ] [E1 (t) + E 2 (t - τ ) ]* dt. T t0 2. 2. 1 T. t0 +. T 2. ∫E t0 -. 2. (t - τ ) + E 2 * (t - τ ) dt. T 2. (2.1). * (t - τ ) + E1 * (t)E 2 (t - τ ) ] dt. T 2. (2.1)式中的前兩項分別是M1 以及M2 反射回來的光強度，我們以I1和 I2來表示，假設光的電場是穩定的，並令TÆ∞，則(2.1)式可化簡為:. I d = I1 + I 2 + 2 I1 I 2 Re{γ 12 (τ )}. (2.2). 其中的 ∞. ∫ E (t)E 1. γ 12 =. 2. * (t - τ )dt =. -∞ ∞. ∫ E (t)E 1. -∞. ∞. 1. * (t)dt ∫ E 2 (t)E 2 * (t)dt -∞. - 10 -. Γ12 (τ ) I1I2. (2.3).
(25) γ12(τ) 稱 為 同 調 度 (degree of coherence) ， Γ12(τ) 稱 為 同 調 函 數 (coherence function)。當兩道光的光程差τ=0，表示同調程度最大，干 涉訊號最大，隨著兩道光的光程差變大，同調程度會降低，干涉訊號 會越來越小。我們定義｜γ(τ)｜的半高寬為光源的同調時間：. γ(. τc. ). Γ(. τc. ) 2 = 2 = 1 Γ (0) γ (0) 2. (2.4). 當兩道光的光程差超過τc時就看不到干涉訊號了，若是我們以距離的 觀點來看的話，將同調時間乘上光速換算成同調距離則為：. l c = c ⋅τ c. (2.5). 由 Wiener-Khintchine 定理得知，同調函數與光源的功率頻譜互為 傅立葉轉換對: ∞. ∞. 1 Γ(τ ) = ∫ E(t)⋅ E*(t -τ )dt = ∫ P(w)⋅ eiw⋅τ dw 2π -∞ -∞. (2.6). ∞. P(w) = ∫ Γ(τ ) ⋅ eiw⋅τ dτ. (2.7). -∞. 因此同調函數 γ(τ)在物理上有兩個意義： 1. 光源功率頻譜的傅立葉轉換對， 2. 兩道光線的同調程度， 由於我們使用寬頻的雷射光，假設光源的功率頻譜呈高斯分佈:. (ω - ω 0)2 P(ω) ∝ exp[] 2W2 - 11 -. (2.8).
(26) 則半高寬值可表示成： 1 2. ∆ω = 2[2ln2] W = 2π∆f = 2πc. ∆λ. λ2. (2.9). 將光源的功率頻譜做傅立葉轉換可以得到同樣為高斯分佈的同調函 數，再用此計算同調函數的半高寬值可以得到同調時間：. τc =. 2[2ln2] W. 1 2. (2.10). 因此光源功率頻譜頻寬與同調時間的關係為一常數：. ∆ω ⋅ τ c = 8ln2 = constant. (2.11). 由(2.5)，(2.11)，(2.9)參數代換可以得到：. 4ln2 λ2 lc = π ∆λ. (2.12). 因此我們可以由(2.12)看出當光源的中心波長越短，而頻寬越寬時， 解析度就越好。. - 12 -.
(27) 2.1.3 縱向解析度(longitudinal resolution) 在影像系統中，解析力的判斷是利用 The Rayleigh Criterion 來定 義的，如果其中一個物體的點擴散函數(Point Spread Function；PSF) 的中央最大值和另一個點擴散函數的第一個零值重合時，則這兩個物 體恰好可以被分辨出來，根據 The Rayleigh Criterion 的定義，如果一 個影像系統的點擴散函數是呈高斯函數分佈的話，那系統可以分辨的 這兩個物體他們的距離就是系統點擴散函數的半高寬值，如果兩點間 的距離小於這個值，則量測到的這兩個點的訊號會混合成一個，而無 法分辨，如下頁圖 2.3 所示。. 中央最大值. 第一個零點. (a). (b). (c). 圖 2.3 解析力說明圖(a)兩點可分辨(b)兩點恰可分辨(c)兩點不可分辨. 因此我們以 The Rayleigh Criterion 來定義低同調干涉術的縱向解析 度。由(2.12)式可以知道低同調干涉術的干涉訊號也是決定於使用的 光源頻譜，若是頻譜呈高斯分佈，而同調長度也是系統量測到的訊號 的半高寬值。由於系統量到的訊號就是系統的點擴散函數，因此定義 縱向解析度為同調長度的一半[20]，除以二是由於在麥克森干涉儀的 架構下，光程差是真實距離的兩倍，因此同調長度轉換到真實距離的 - 13 -.
(28) 時候要除以二，故縱向解析度為:. λ2 l c 2ln2 λ2 = ≅ 0.44 π ∆λ ∆λ 2. (2.13). 由(2.13)式可以得知，藉由所選取光源的中心波長與頻寬可以算出縱 向解析度，但為了避免生物組織中各項成分與細胞吸收(如圖 2.4 所 示)[21]及熱傷害，通常選擇紅外光到近紅外光之間的波段，而光源的 頻寬越寬，系統的解析力也越好。. 圖 2.4 光源波長與組織吸收關係圖. - 14 -.
(29) 2.1.4. 橫向解析度 (Lateral resolution) 光學同調斷層攝影術是以 2.1.2 節所提到的低同調干涉術為基礎. 作縱向的掃描，再搭配橫向掃描而得到二維的斷層影像，縱向的解析 度在 2.1.3 節已作說明，而橫向解析度的部份將在本節作介紹。 當進行掃描時，通常會將樣品端的光束已物鏡聚焦，使其成為一 個光學探頭，才能對樣品做探測及解析。 假設一道平行光，光場在空間中的強度分佈為高斯分佈，直徑為 D，當經過一個焦距為f的透鏡時，平行光會在焦點聚焦，而聚焦點的 光斑(Airy disk)大小為w0，則：. w0 =. 2λ f πD. (2.14). 若是使用此光束的系統，其空間上的解析力就是光斑的直徑 2w0。. 圖 2.5 高斯光場分佈聚焦點大小以及景深示意圖. - 15 -.
(30) 由高斯分佈的光場強度去推導，可以得到光場在空間中的強度分佈以 x，y，z 的函數表示為：. ψ =. ⎧ ⎫ ⎪ ⎪ (x 2 + y 2 ) 1 ⎪ ⎪ × exp ⎨ λ z 2 ⎬⎪ 2 λz 2 ⎪ ) ] w 0 [1 + ( ) 1+ ( 2 2 ⎪ ⎪⎭ w π πw 0 0 ⎩ ⎫ ⎧ ⎪ ⎪ i π (x 2 + y 2 ) ⎪ λz ⎪ -1 )× exp ⎨ itan ( 2 λ z 2 ⎬⎪ w π 0 ⎪ λ z[1 + ( ) ] ⎪⎭ ⎪⎩ πw 0 2. (2.15). (2.15)式中第二項代表了高斯光束的光斑大小對應光軸距離的關係， 可以算出在光軸上不同距離的光斑大小： 2. w(z) 2 = w 0 [1 + (. 2λz 2 ) ] 2 πw 0. (2.16). 定義景深是當光斑大小為聚焦點兩倍時在焦點前後兩點間的距離，其 計算的公式如下：. b=. 2πw 0. λ. 2. (2.17). 在光學同調斷層攝影術中，聚焦的光斑越小表示橫向解析力越 好，但由於光斑會隨遠離焦距的距離增加而放大，因此所取得的影像 會有所失真，只有在景深內的影像不會失真的太嚴重，但由於光學同 調斷層攝影術最主要的功能在於“斷層＂，因此大多數使用低倍率或. - 16 -.
(31) 低數值孔徑的透鏡，雖然在橫向解析力較差，但可減少影像失真的程 度，若要得到高橫向解析力，又不想讓影像失真的情況太嚴重，在掃 描的時候可使用高倍率物鏡但需要讓光束的聚焦點隨著掃瞄的深度 一起移動，也就是動態聚焦的原理[22]。本論文中，由於以斷層影像 為研究重點，因此在樣品前使用低倍率(10 倍)或低數值孔徑(N.A. =0.25) 的物鏡將雷射光束聚焦以減少影像失真的程度。. - 17 -.
(32) 2.2. 頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT) 頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT，SD-OCT)的實驗. 架構與時域光學同調斷層攝影術(Time domain OCT，TD-OCT)的實驗 架構很相似，主要有兩項差別，第一項是 SD-OCT 參考端的反射鏡是 不動的，因為 SD-OCT 不需要有掃瞄機制來改變參考端與樣品端的光 程差以取得樣品軸向深度的訊號，而 TD-OCT 需要有掃瞄機制，第 二項是 SD-OCT 的接收端是光譜儀，而 TD-OCT 的接收端是光偵測 器，圖 2.6 與圖 2.7 分別為 TD-OCT 與 SD-OCT 基本架構。. 圖 2.6 TD-OCT 系統架構. - 18 -.
(33) 圖 2.7 SD-OCT 系統架構. 如圖 2.7 所示，頻域光學同調斷層攝影術(SD-OCT)主要是利用 寬頻光源，搭配十字型麥克森干涉儀(Michelson interferometer)，和頻 譜儀(Spectrometer)加上 CCD 偵測器陣列量測干涉頻譜的技術，在圖 2.7 中所使用的低同調(Low coherence)的寬頻雷射光源為超亮發光二 極體(SLD)，寬頻光經由分光鏡(Beam spliter，BS)被分成兩道光，一 道光到達參考端(reference arm)，並且由參考端靜止的反射鏡反射參 考光回接收端，一端到達樣品端(sample arm)，樣品裡在不同深度有 不同反射光或散射光最後回到接收端，接收端同時接收到樣品端與參 考端的反射光而產生干涉訊號，頻譜儀(Spectrometer)是主要由光柵組 成，干涉訊號經由光柵分光打到不同的偵測器上，就可得到不同波段 的干涉訊號強度，即干涉頻譜，樣品不同深度的反射光與參考光干涉 - 19 -.
(34) 會產生不同頻率的震盪(Oscillations)，震盪的頻率與光程差成正比， 即在樣品裡軸向深度越深的反射光震盪的頻率越大，所以將這些頻域 的干涉訊號經過傅利葉反轉換後，就可得到時域上的干涉訊號，因此 就可得到樣品軸向的深度資訊。. 2.3. 掃瞄式光源之光學同調斷層攝影術(Swept Source OCT) 頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT，SD-OCT)提供在. 低散射器官接近理想的功效，例如眼睛(eye)，但在某些組織上的應用 還是會被限制，例如在上皮組織(epithelial tissues)的研究。上皮組織 的研究是大部分人很感興趣的，因為人類有大多數的癌症都發生在表 面的組織層，例如線狀的中空臟器(lines hollow organs)和上皮組織 (epithelial tissues)，線狀的中空臟器有結腸(colon)、食道(esophagus)、 乳腺(breast ducts)等，在上皮組織(epithelial tissues)有高密度的細胞器 (cellular organelles)，例如線粒體(mitochondria)、細胞核(nuclei)、細胞 膜(cellular membranes)等，這些高散射介質會限制短波長光的穿透深 度，而頻域光學同調斷層攝影術(Spectral domain OCT，SD-OCT)使用 的是短波長範圍(小於 1000nm)的光源，因為 SD-OCT 偵測端是使用 矽(silicon-based)的 CCD 偵測器，這些偵測器無法操作在波長高於 1000nm 的範圍，因此 SD-OCT 在某些組織上的應用會被限制。要使 用 OCT 成像於上皮組織(epithelial tissues)或一些非生物樣品，就需要 將 波 長 操 作 在 1000 ～ 1300nm 才 能 得 到 我 們 想 要 的 高 穿 透 深 度 1~3mm。 另一種使用傅利葉偵測(Fourier domain detection)方式的掃瞄式 - 20 -.
(35) 光源之光學同調斷層攝影系統(Swept source OCT systems)，使用的光 源為快速頻率掃瞄的雷射光源(rapid frequency-swept laser source)，偵 測端使用的是 GaAs 光偵測器，光源波長操作在 1000～1300nm，因 此掃瞄式光源之光學同調斷層攝影系統(Swept source OCT systems) 能成像在 SD-OCT 不能成像的上皮組織(epithelial tissues)或一些非生 物樣品，且達到 1~3mm 的高穿透深度。 掃 瞄 式 光 源 之 光 學 同 調 斷 層 攝 影 系 統 (Swept source OCT systems，SS-OCT)的架構與頻域光學同調斷層攝影術(SD-OCT)的架 構相似，主要的不同處有兩個地方，第一在於光源的不同，SS-OCT 使用的的是掃瞄式的雷射光源(Swept Laser Source)，光源波長會隨著 時間變化，第二在於接收端偵測器的不同，SS-OCT 使用的是單一個 光偵測器，其架構如圖 2.8 所示。. reference arm Mirror (static) Z=0 X. Z. sample. Swept Laser Source. sample arm BS A B. C. Z=0. Computer : - Fourier transform - Image generation Fourier B transform A C. Photo-detector. A/D converter. 圖 2.8 SS-OCT 系統架構 - 21 -.
(36) 第三章 實驗架構、原理與方法. 本章將介紹實驗中所使用到的儀器、並簡介 SS-OCT 系統，另外 說明實驗方法，如：量測生物樣品時所需要之準備。. 3.1 實驗儀器與系統架構 3.1.1 光源 本實驗所使用的是掃瞄式光源之光學同調斷層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT)，而此系統使用的光 源為寬頻掃瞄式光源(Broadband Swept Laser Source)，其規格如表3.1 所示。. 表 3.1 光源規格. 此寬頻掃瞄式光源(Broadband Swept Laser Source)是用很快的速 度掃出一個很寬的波長範圍，其波長掃瞄速率大約為 20kHz，掃瞄寬 度為 100nm，這使得 SS-OCT 系統有著 12μm(在空氣裡)的高縱向解 析度，其光源功率頻譜如圖 3.1 所示。. - 22 -.
(37) Output spectrum of the laser. The Broadband Swept Laser Source supports 20 kHz wavelength sweeping rate with a 3 dB spectral bandwidth up to 100 nm, centered at 1325nm.. 100nm. 圖 3.1 寬頻掃瞄式光源(Broadband Swept Laser Source)頻譜圖. 3.1.2 SS-OCT 系統架構 本實驗所使用的是掃瞄式光源之光學同調斷層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT)，實驗架構大部分為 光纖結構，光源(Swept Laser Source，SLS)出來之後由光纖分光器 (Fiber coupler)分成兩條光纖(Fiber)，光源有一小部分從其中一條光纖 進入到馬赫-詹德干涉儀記錄器(Mach-Zehnder Interferometer clock， MZI clock)，此部分最後會得到 MZI clock signal(MZI SIG.)進入平衡 式偵測器(balanced detector，BD)再進入 DAQ 的 CH1。光源的主要部 - 23 -.
(38) 分則進入另外一條光纖到一個光纖式的麥克森干涉儀(Michelson interferometer)，由其中分光比為 50/50 的寬頻光纖分光器(Fiber coupler)將光源分為兩部分，一部份進入到參考端(Reference arm)，參 考端的光源先進到自由空間(free space)再打到靜止的反射鏡，再將光 源打回接收端的平衡式偵測器(balanced detector，BD)，另一部份進 入到樣品端(Sample arm)，樣品端的光源進到自由空間(free space)之 後經由雙軸 XY galvo 掃瞄鏡子打在樣品(Sample)上，最後將樣品的 反射光打回接收端的平衡式偵測器(balanced detector，BD)，參考端 與樣品端的光源會在接收端產生干涉訊號，即 OCT signal(OCT SIG.)，此主要 OCT 訊號進入 DAQ 的 CH2，因為光源為掃瞄式光源 (Swept Laser Source，SLS)所掃瞄的光源頻譜會有間距不一樣的情 形，所以最後得到的 OCT signal(OCT SIG.)必須在頻譜上作校正，這 裡即是利用 CH2 接收到的 MZI clock signal(MZI SIG.)來對 CH1 接收 到的 OCT signal(OCT SIG.)進行頻譜的校正，將校正後的干涉頻譜作 傅利葉轉換(fast Fourier transform，FFT)即可得到樣品軸向深度的反 射訊號。 由表3.1可知，此係統的軸向掃瞄速度(Axial scan rate)為16kHz， 此即為一維(1D)訊號的掃瞄速率，而樣品經由雙軸XY galvo 掃瞄鏡 子的掃瞄之後，可以產生二維(2D)與三維(3D)的圖形，其二維的成像 速率在像素(pixels)為512×512時為每秒25張，其詳細規格如表3.2所 示。. - 24 -.
(39) 表 3.2 成像規格. 樣品處理與量測. 3.2 3.2.1. 果蠅身體結構簡介. 果蠅心臟(或稱背血管)位於背中線，被表皮所包覆著，如圖 3.3 所示，其位置由胸節(T2)到腹節(A7)，主要功能為提供營養、循環、 過濾血淋巴液，果蠅心臟共由 104 個不同類群及功能的心臟細胞所組 成，是一條會規律跳動的管狀構造，前端不會收縮，功能較類似血管， 故稱為主動脈(aorta)；後端具有規則收縮功能以及類似瓣膜構造稱為 ostiae 的結構，故後端稱為心臟(heart)，如圖 3.4 所示。在心臟每一次 收縮(跳動)中，血淋巴液(即果蠅的血液)從組織中經由 ostiae 流進心 臟(heart)的部位，前端則有血淋巴液自主動脈(aorta)流出背管進到組 織中，完成在果蠅開放式循環系統的功能。幼年之果蠅表皮呈半透 明，成年果蠅個體大約 2~3 釐米且表皮變成不透明，而其背血管(即 主動脈與心臟)位置由胸節到腹節，被表皮所包覆著，需要在具有高 - 25 -.
(40) 度散射特性生物體內仍能取得觀測影像的斷層掃描技術。 aorta. Heart. (a). (b). 圖 3.3 果蠅身體透視結構圖，(a)側視圖、(b)上視圖，紅色箭頭所指為果 蠅的心臟(heart)，藍色箭頭所指為果蠅的主動脈(aorta)，圖片修改自文獻 [27]。. 圖 3.4 果蠅心臟透視圖，A..為將果蠅切開後使用 green fluorescent protein (GFP) (1029-Ga4/UASGFP)的方法來觀察果蠅的心臟型態 、B.為示意圖，圖中左半部為皆為果蠅主動脈(aorta)，右半部皆為果蠅心 臟(heart)，圖片修改自文獻[28]。. - 26 -.
(41) 3.2.2. 果蠅培養. 在試管底部放置食物，再將果蠅放進試管，試管口用棉花塞住， 如此讓空氣能夠進出，如此將試管放在 25℃的恆溫環境下培養果蠅， 果蠅的生命週期大約為七到九週，我們採用隔週量測，每個種類，公 的跟母的各量測 1、3、5、7 週，每次量測 20 隻果蠅，每隻量測 30 秒，按照如此計算，一個種類總大約共需要量測 160 隻果蠅。. 3.2.3. 果蠅處理與活體量測. 果蠅只要接觸到二氧化碳(CO2)就會昏迷大概 5 到 10 分鐘，所以 先將果蠅用二氧化碳(CO2)迷昏，然後再將果蠅放在載波片上並且用 果凍膠固定，如用此法量測，量測時因為果蠅呈半昏迷狀態，所以身 體還是會一直動，如此便會造成在處理data時很多的不便，所以將果 蠅用二氧化碳(CO2)迷昏之後，先用麻醉劑將果蠅麻痺，我們採用的 麻醉劑為Fly Nap，從文獻[29]中知道，此麻醉劑幾乎不會影響果蠅心 臟的跳動，它可以使果蠅的身體不會動，麻醉劑Fly Nap是用氣體的 形式麻醉果蠅，只要讓果蠅接觸Fly Nap大約 5 到 10 分鐘，果蠅就能 被麻醉半小時左右，此時果蠅心臟會正常跳動，但身體卻不會動，這 時再將果蠅放在載波片(slide)上並且用果凍膠(Jelly glue)固定住果蠅 (Drosophila)的翅膀，如圖 3.5(b)所示。 將果蠅如圖 3.5(b)所示固定好之後，將此樣品放在掃瞄式光源之 光 學 同 調 斷 層 攝 影 系 統 (Swept Source Optical Coherence - 27 -.
(42) Tomography，SS-OCT)的樣品端即可開始量測，如圖 3.5(a)所示。. Fiber. Drosophila. Jelly glue. C-scanning translation stage. slide Jelly glue slide. Drosophila. (a). (b). 圖 3.5 (a)果蠅量測示意圖，(b)果蠅固定結構圖，將果蠅放在載波片(slide) 上並且用果凍膠(Jelly glue)固定住果蠅(Drosophila)的翅膀。. - 28 -.
(43) 果蠅突變種類說明. 3.3. 我們量測的果蠅種類共有六種(Line)，此由本校生命科學系所提供 如下所示。 Line = 1.. W1118. =>. Control WT (Wild Type). 2. Δ168M1, Δ164F1. => Mutant gene deletion. 3. UAS-Acer. =>. Gain of function UAS-Acer. 4. Mut8i, Mut9i. =>. RNAi (會抑制 m-RNA)表現於全身. 5. M8i, M9i. =>. RNAi (會抑制 m-RNA)表現於中胚層. standard strain. gene mutation (Acer). W1118為野生型的正常標準果蠅，其他四個種類皆為Acer基因的突 變種，UAS-Acer是將一個片斷UAS-Acer打入果蠅的Acer基因中， (Mut8i、Mut9i)與(M8i、M9i)皆為干擾m-RNA的生成，即會抑制m-RNA 的量，8i與 9i組是代表表現程度上的差別，(Mut8i、Mut9i)與(M8i、 M9i)為表現位置的不同，(Mut8i、Mut9i)表現於全身，而(M8i、M9i) 表 現於中胚層。 實驗中有利用 RTPCR 的方法來檢測這三種突變果蠅是否有突 變，RTPCR 可以檢測 m-RNA 的量，檢測結果可以確定這三種果蠅確 實發生突變。 突 變 種 果 蠅 (∆164F1 、 ∆168M1) 為 英 國 的 實 驗 室 所 研 發 ， (∆164F1、∆168M1)是從 Acer 的基因裡面去除掉一些重要的序列， ∆164F1、∆168M1 之間的差別為去除的序列不同。他們用 western 來 檢測 Acer 蛋白的量，檢測結果為：Acer 蛋白的量確實有減少，所以 確定 ∆164F1、∆168M1 為突變種果蠅。. - 29 -.
(44) 影像處理. 3.4 3.4.1. 二維(2D)連續影像(M-mode). 量測果蠅心臟二維(2D)橫切面(transverse)，如圖 3.6 所示。. Light. a. 圖 3.6 (a)光照射在果蠅心臟橫切面(transverse)示意圖，圖片修改自文獻 [27]。. 在圖 3.6 中，a 為雷射光照射在果蠅心臟橫切面(transverse)上的 示意圖，雷射光因為 X 軸掃瞄鏡子(galvo mirror)快速轉動的關係，打 下來的光是 XZ 方向的平面，X 軸上的每個點都有 Z 軸深度掃瞄，所 以掃瞄到的是二維(2D)即時(real time)影像。量測到的果蠅二維(2D) 即時(real time)影像可以存成 *.IMG 或 *.AVI 等資料檔，如將其儲 存成連續圖檔，並將其排列在一起，即如圖 3.7 所示。. - 30 -.
(45) Heart of Drosophila with an end-diastolic dimension (EDD) end systolic dimension (ESD). 100μm. 1. 2. 6. 5. 3. 4. 圖 3.7 果蠅(w1118)量測連續圖檔示意圖，圖片間之大箭頭與圖中數字編號 為時間順序，圖片中虛線圓圈部分為果蠅(Drosophila)的心臟部位。. 在 圖 3.7 中 ， 量 測 的 是 正 常 標 準 種 類 (standard strain)之 果 蠅 (w1118)，編號 1 的圖片中用虛線所圈選的果蠅(Drosophila)心臟位置， 是果蠅心臟舒張(end-diastolic dimension，EDD)的時候，編號 2 的圖 片中用虛線所圈選的果蠅(Drosophila)心臟位置，是果蠅心臟收縮(end systolic dimension，ESD)的時候，由文獻[25]中得知，正常標準種類 (standard strain)之 果 蠅 (w1118)心臟舒張 (EDD) 的維度大 約 為 76 + 3µm，心臟收縮(ESD)的維度大約為 8 + 2µm，與圖 3.7 中實際量測結 果相符。將圖 3.7 處理成M-mode形式，如圖 3.8 所示。. - 31 -.
(46) EDD. W1118 female 7week M-mode over 1 second. ESD. 150μm. 1s. 圖 3.8 果蠅(w1118)量測心臟部位橫切面(transverse)M-mode示意圖。. 3.4.2. 心跳率(Heart Rate，HR)之處理. 由文獻[26]中可以知道，正常標準種類(standard strain)之果蠅(w1118) 的心跳率大約為每秒 2～3.5 下，而我們所用掃瞄式光源之光學同調 斷層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT) 的即時(real time)影像可以達到每秒 22 張影像，這超過果蠅心跳率的 兩倍以上，根據取樣定理可以達到量測果蠅心跳率需求。 接下來，將量測到的果蠅二維(2D)橫切面(transverse)即時(real time) 影 像 ， 如 圖 3.7 所 示 ， 取 出 果 蠅 心 臟 為 舒 張 (end-diastolic dimension，EDD)的瞬間影像，如圖 3.7 編號 1 的圖片所示，參考圖 3.3 與圖 3.4 的果蠅心臟位置，雷射光掃瞄果蠅心臟橫切面(transverse) 的位置如圖 3.9 中紅色虛線所示。. 圖 3.9 掃瞄果蠅心臟橫切面(transverse)位置圖，圖中紅色虛線即為雷射光 掃瞄果蠅之橫切面(transverse)位置，圖片修改自文獻[27]。 - 32 -.
(47) 將選出來的果蠅心臟橫切面舒張(end-diastolic dimension，EDD) 與收縮(end systolic dimension，ESD)之瞬間影像在程式(MATLAB)上 作處理，選取出影像之心臟位置的範圍(Range Of Interest，ROI)，再 將其經過影像濾波器(Image filter)的處理，如圖 3.10 所示。. - Image Processing : HR (Heart Rate) EDD. EDD. 100μm ROI_EDD. 1. Image filter. ROI_ESD. 2. 3. ESD. Intensity. ESD. Heartbeat Total time. 4. Finding out the EDD and ESD utilize change of rate of picture element in the center Frame (time) (Heart beat). Namely find out the Heartbeat. Heart Rate. 圖 3.10 果蠅心跳率處理流程圖，編號 1 的圖片為果蠅心臟橫切面舒張 (end-diastolic dimension，EDD)之瞬間影像，中心紅色正方形部分即為選取 影像之心臟位置的範圍(Range Of Interest，ROI)。. 經過影像濾波器(Image filter)的處理之後，得到如圖 3.10 中編號 3 之圖形，利用編號 3 圖形中心圓圈位置像素之值的變化率找出果蠅心 臟舒張(end-diastolic dimension，EDD)與收縮(end systolic dimension， ESD)的位置，也就是找到心跳(Heartbeat)，將心跳(Heartbeat)除上總 - 33 -.
(48) 時間(Total time)即可得到心跳率(Heart Rate，HR)。 而在圖 3.10 中編號 4 的心跳(Heartbeat)圖形中，將其放大來看， 如圖 3.11 所示。. - Image Processing : HR (Heart Rate). Intensity. Frame Rate = 20 (Frm/s) Total time = Frm / FR = 40 / 20 = 2 (s) 4. Frame (time) (Heart beat). Heart Rate = Heart beat / Total time = 8 / 2 = 4 (1/s). Intensity. Intensity. 1. a. 2. 4 567 8 3. Frame (time) (Heart beat). Frame (time) (Heart beat). 2 Sec b. 圖 3.11 圖 3.10 中編號 4 的心跳(Heartbeat)曲線放大圖與心跳計算方法。. 在圖 3.11 中，右下角編號為 b 的放大圖形中為 40 張影像的心跳 變化曲線，而我們系統的 Frame Rate = 20 (Frm/s)，即影像頻率為每 秒 20 張，40 張即為 2 秒，在 2 秒內有 8 次的心跳，如此計算心跳率 即為每秒 4 下。 - 34 -.
(49) 將在圖 3.11 中，右下角編號為 b 的放大圖形再作解釋，此圖形 的縱軸為影像中像素的強度(Intensity)，橫軸為影像張數的位置，波 峰的位置即為 ESD 的位置，波谷的位置即為 EDD 的位置，如圖 3.12 所示，其位置皆由程式計算出。. Intensity. -Image Processing : HR (Heart Rate). Frame (time) (Heart beat). Frm 3. Frm 4. DouFri_minPosi = Columns 1 through 15 3 8 14 19 27 30. 34 37 43. DouFri_maxPosi = Columns 1 through 15 4 11 16 25 28 32 35. Frm 14. Frm 11. Frm 8. 46 49. 39 44 48. 51. 53 57 60. 64. 55 58. 66. 63. Frm 16. 圖 3.12 心跳(Heartbeat)曲線解釋圖，圖中縱軸為影像中像素的強度 (Intensity)，橫軸為影像張數的位置，波峰的位置即為 ESD 的位置，波谷 的位置即為 EDD 的位置。. - 35 -.
(50) 3.4.3. 心臟舒張(EDD)與收縮(ESD)之處理. 選出果蠅的心臟橫切面舒張(end-diastolic dimension，EDD)與收縮 (end systolic dimension，ESD)之瞬間影像在程式(MATLAB)上作處 理，與心跳率(Heart Rate，HR)之處理一樣選取出影像之心臟位置的 範圍(Range Of Interest，ROI)，如圖 3.13 所示，再將其經過影像濾波 器(Image filter)的處理，但這與心跳率(Heart Rate，HR)之處理的影像 濾波器(Image filter)有程度上的差別，比較圖 3.10 與圖 3.13 中編號 3 之圖形即可看出，在計算果蠅心臟舒張(EDD)與收縮(ESD)所用之影 像濾波器(Image filter)程度較低，因為程度過高會將心臟面積模糊化 並且有些微的縮小，所以使用程度較低的影像濾波器(Image filter)才 能正確計算出心臟大小。經過影像濾波器(Image filter)之後，將心臟 周圍部分反白以方便用程式自動化的方法計算心臟大小，如圖 3.13 中編號 4 之圖形所示。. - 36 -.
(51) 100μm. EDD. EDD. ROI_EDD. Image filter ROI_ESD. 1. (The degree is different from heartbeat rate of calculation.). Utilize Heart Rate find out the position of EDD and DSE. 2. ESD. 3. ESD. Around heart being white instead, in order to utilize automation to calculate EDD and ESD area. Calculating the Figure of black picture element to received the area. Then convert the area into an equivalent diameter .. EDD. ESD 4. EDD & ESD Calculating proves Each Drosophila measuring 30 seconds. During 30 seconds take out EDD and ESD 30-40 times to average separately Example. EDD. ESD. .... .... HeaEquDiamAuto_Mat = 86.2047 79.0632 88.7039 87.4632 84.9275 78.5084 83.8918 87.4632 84.4112 87.4632 87.2130 78.2295 82.8431 82.3137. 87.4632 84.9275 87.7127 81.2447 86.7103 87.7127 84.4112 84.4112 87.4632 88.4571 87.2130 84.6697 84.1519 88.7039. 84.1519 84.1519 85.9508 82.3137 87.9616 81.7809 82.3137 85.1845 87.9616 84.4112 79.3392 87.2130 84.4112. HeaEquDiamAuto_Mat =. ESD Diam.(Ave.) = 17.26705 (um). EDD Diam. (Ave.) = 84.90480 (um). 18.7004 17.4926 11.4516 24.7383 9.3502 16.1950 19.8348 16.1950 14.7840 14.7840 11.4516 16.1950 13.2232. 21.9282 16.1950 14.7840 17.4926 16.1950 13.2232 20.9077 11.4516 31.7081 14.7840 13.2232 18.7004 17.4926. 16.1950 16.1950 31.0111 16.1950 14.7840 36.8118 16.1950 18.7004 25.6066 16.1950 14.7840 14.7840 6.6116. 14.7840 18.7004 14.7840 13.2232 24.7383 17.4926 21.9282 9.3502. EDD ＆ ESD. 圖 3.13 果蠅心臟舒張(EDD)與收縮(ESD)處理流程圖，編號 1 的圖片為利 用已算出的果蠅心跳率(HR)找出心跳中最大與最小的位置，即心臟舒張 (EDD)與收縮(ESD)之位置。 - 37 -.
(52) 反白之後計算中間黑色空洞之面積即果蠅心臟面積，再將面積換 算成等效直徑，每隻果蠅固定量測 30 秒的時間，舒張(EDD)與收縮 (ESD)在此 30 秒內各別取 30～40 次的直徑作平均，最後的平均值即 為所求之果蠅心臟舒張(end-diastolic dimension，EDD)與收縮(end systolic dimension，ESD)直徑參數。. 3.4.4. 心肌縮短分率(Fractional Shortening，FS)之計算方法. FS (fractional shortening) 為心肌縮短分率 是利用EDD與ESD兩項參數所計算出，其計算公式為： FS = [(EDD－ESD)/EDD]×100 其值的大小代表心臟收縮的程度 其值越大. 收縮程度越好. 其值越小. 收縮程度越差. - 38 -.
(53) 第四章 實驗結果與討論. 本章將藉由第三章所建立的全自動化掃瞄式光源之光學同調斷 層攝影系統(Swept Source Optical Coherence Tomography，SS-OCT)， 利用其三維快速掃瞄的優點對果蠅進行非侵入式縱切面、橫切面、以 及 M-mode 隨時間變化等三種掃描面，採用果蠅動物模式進行成人心 臟病致病基因篩選之研究。. 系統空間解析度量測. 4.1 4.1.1. 縱向解析度. 在理論上 OCT 的縱向解析度[20]定義為同調長度的一半，方程式 如下： ιc. 2 ln 2 λ0 axial resolution = = 2 π ∆λ 2. (4.11). 其中 ιc ：光源的同調長度， λ0 ：光源的中心波長， ∆λ ：光源的頻寬。 由方程式(4.11)的關係可以看出，當光源的波長分佈( ∆λ )越廣，光源 的中心波長( λ0 )越短，則同調長度越短，因此使用越寬頻的光源，所 得到的影像空間解析度就越好。由方程式(4.11)可算出系統的理論解 析度為： 2 ln 2 λ0 2 ln 2 1325 2 (nm 2 ) = × = 7.747 µm 理論縱向解析度= π ∆λ π 100 (nm) 2. (4.12). 我們首先在樣品端放上一個反射鏡，以測試系統的實際縱向解析 度，如圖 4.1 與圖 4.2 所示，量測的結果向前掃瞄(Forward scan)為 12.3 µm，向後掃瞄(Backward scan)為 11.7 µm 與(4.12)式所計算出的 7.747 µm 接近，其誤差可能來自於系統中光學元件的非理想特性以及掃瞄 式光源在系統中的色散等難以避免的背景因素。. - 39 -.
(54) 圖 4.1 向前掃瞄(Forward scan)之點延伸函數(Point Spread Function)表示 在空氣中之縱向解析度. 圖 4.2 向後掃瞄(Backward scan)之點延伸函數(Point Spread Function)表 示在空氣中之縱向解析度. - 40 -.
(55) 橫向解析度. 4.1.2. OCT 橫向解析度[23]的理論值與一般傳統光學顯微鏡[24]的計算 方式一樣，定義如下： transverse resolution =. 4λ 0 f ( ) π d. (4.13). 其中 λ0 ：光源的中心波長，f：透鏡的焦距，d：平行光打在透鏡上的 直徑大小。 由式(4.13)的關係可以看出，當光源的中心波長( λ0 )越短，透鏡的焦 距(f)越短，光點打在透鏡上的直徑(d)越大，則所得到影像的橫向解 析度就越好。 這裡用量測一片蓋玻片(Cover glass)的邊緣介面的方法來取得實 際上系統的橫向解析度，如圖 4.3 所示。. Fiber. Cover glass X. Y Z Cover glass X Y Z. (a). (b). 圖 4.3 橫向掃描一片蓋玻片的示意圖。(a)為側視圖(b)為上視圖，圈圈代 表光點掃描位置，箭頭代表移動方向。. 將一片蓋玻片(Cover glass)在樣品端放置好後，用圖 4.3 的方法 - 41 -.
(56) 掃過蓋玻片(Cover glass)的邊緣介面，訊號會從有反射訊號到沒有反 射訊號，如圖 4.4 所示。從圖 4.4 可以看到左邊中間的部分有兩條明 顯的干涉訊號，這是因為蓋玻片(Cover glass)上下兩個界面都會產生. 3.0 mm. Z direction depth distance. 反射訊號，兩個界面分別是空氣到玻片與玻片到空氣。. 1.5 mm Y direction distance. 圖 4.4 蓋玻片(Cover glass)二維影像量測結果，左邊中間有兩條明顯的干 涉訊號為蓋玻片(Cover glass)的兩層界面. 在圖 4.4 蓋玻片(Cover glass)二維影像中，取出一條在 Z 方向深 度在 1.29mm，並沿著 Y 方向位置從 0.8mm 到 0.85mm 的一維訊號如 圖 4.5 所示。. - 42 -.
(57) Intensity (a.u.). Y direction distance (μm). 圖 4.5 從蓋玻片(Cover glass)二維影像量測結果取出 Z 方向深度在 1.29mm，並沿著 Y 方向位置從 0.8mm 到 0.85mm 的一維訊號. 在圖 4.5 中，此 Y 方向的一維訊號，即代表蓋玻片(Cover glass) 邊緣的步階函數(Step Function)與系統橫向點擴散函數(Point Spread Function，PSF)的摺積(Convolution)，所以若對此一維訊號作微分後，. differential normalize Intensity (a.u.). 就可以得到系統橫向的點擴散函數，如圖 4.6 所示。. 14. 58μm. 260. 42μm. Y direction distance (μm). 圖 4.6 蓋玻片(Cover glass)二維影像中，取出 Y 方向一維訊號做一次微分 後的點擴散函數(Point Spread Function，PSF)。 - 43 -.
(58) 由此點擴散函數(Point Spread Function，PSF)可以推算出系統實 際的橫向解析度大約為 14.58µm。. 量測結果. 4.2. 二維(2D)影像. 4.2.1. 量測果蠅二維(2D)橫切面(transverse)與縱切面(longitudinal)的即 時(real time)影像，如圖 4.7 所示。. z. y. y. Light. Light x x. z. Light. y. x. a. b. z. Heart of Drosophila. transverse. c. longitudinal. d. 圖 4.7 a.與 c.分別為果蠅(Drosophila)橫切面(transverse)量測示意圖與量 測結果圖 ，b.與 d.分別為果蠅(Drosophila) 縱切面(longitudinal)量測示意 圖與量測結果圖。. - 44 -.
(59) 在圖 4.7 中，紅色虛線所圈選的位置為果蠅(Drosophila)心臟位 置，a.與 b.分別為雷射光打在果蠅上的示意圖，雷射光因為 X 軸掃瞄 鏡子(galvo mirror)快速轉動的關係，打下來的光是 XZ 方向的平面， X 軸上的每個點都有 Z 軸深度掃瞄，所以掃瞄到的是二維(2D)即時 (real time)影像。量測到的果蠅二維(2D)即時(real time)影像可以存成 *.IMG 或 *.AVI 等資料檔，也可將其儲存成連續圖檔。. - 45 -.
(60) 資料分析. 4.3. 我們分別量測正常標準種類(standard strain)之果蠅(w1118)，與多種 不同心臟突變(mutation)之果蠅(Mut8i、Mut9i、M8i、M9i、∆164F1、 ∆168M1、UAS-Acer)。突變種的果蠅皆有同樣在心臟收縮不完全之異 常現象，只是在心臟收縮不完全的程度上有差別。. 4.3.1. 量測正常標準種類果蠅(w1118)與兩種心臟突變(mutation)之. 果蠅(Mut8i、Mut9i) 第一次的實驗分別量測正常標準種類(standard strain)之果蠅(w1118) 與兩種心臟突變(mutation)之果蠅(Mut8i、Mut9i)，並做此三種果蠅參 數之間的比較與分析。 4.3.1.1. 公(male)與母(female)Data 之比較. 首先比較正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118) 公(male)與母(female)之心跳率(Heart Rate，HR)，如圖 4.12 所示，從 圖中的紅線(所有Data的平均值)可以看出公(male)與母(female)心跳 率皆在每分鐘 250～300 下之間，結果顯示公(male)與母(female)之間 的心跳率差異不大，此結果與文獻[50]吻合。. - 46 -.
(61) HR. w1118 at 1, 3, 5,and 7 weeks of age at 25°C showing heart rate (HR) in beats per minute (bpm). All data are expressed as individual data points (left, N=20) and mean + standard error (right). The red line of the middle is the average of all Data.. w1118 male. w1118 female. N=20. N=20. week. week. 圖 4.12 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)公(male) 與母(female)培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心跳率(Heart Rate，HR)比較 圖，圖中縱座標心跳率(HR)之單位為平均每分鐘跳動幾下(beats per minute，bpm)，橫座標為果蠅成長之週數(week)，所有Data皆表示成左邊 為各別Data數值，右邊為平均值+標準誤差，中間的紅線為所有Data的平 均值。. 再來比較正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118) 公(male)與母(female)之心臟舒張維度(end-diastolic dimension，EDD) 與心臟收縮維度(end-systolic dimension，ESD)，如圖 4.13 所示，從 圖中的紅線(所有Data的平均值)可以看出公(male)的平均心臟舒張維 度(EDD)大約在 70μm左右，母(female)的平均心臟舒張維度(EDD) 大約在 90μm左右，而公(male)的平均心臟收縮維度(ESD)大約為 20 μm左右，母(female)的平均心臟收縮維度(ESD)大約為 28μm左右， 由此結果可知心臟舒張維度(EDD)與心臟收縮維度(ESD)一樣都是母 (female)果蠅較大，推測此結果是因為母(female)果蠅的體型大部分比 公(male)果蠅來的大一些，使得母(female)果蠅的心臟舒張維度(EDD) 與心臟收縮維度(ESD)會比較大。 - 47 -.
(62) w1118 at 1, 3, 5,and 7 weeks of age at 25°C showing end-diastolic dimension (EDD), and end-systolic dimension (ESD) inμm. All data are expressed as individual data points (left, N=20) and mean + standard error (right). The red line of the middle is the average of all Data. EDD. w1118 male. w1118 female. N=20. N=20. week. week. ESD. w1118 male. w1118 female N=20. N=20. week. week. 圖 4.13 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)公(male) 與母(female)培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下心臟舒張維度(end-diastolic dimension，EDD)與心臟收縮維度(end-systolic dimension，ESD)比較圖，圖 中縱座標之單位為microns(μm)，橫座標為果蠅成長之週數(week)，所有 Data皆表示成左邊為各別Data數值，右邊為平均值+標準誤差，中間的紅 線為所有Data的平均值。. - 48 -.
(63) 由此可推論如果單單只比較心臟舒張維度(EDD)與心臟收縮維度 (ESD)無法明確看出公(male)與母(female)之間是否有差異，而且也無 法非常明確的看出心臟是否有異常或病變，因為果蠅的體型會影響心 臟舒張維度(EDD)與心臟收縮維度(ESD)，所以要利用這兩項參數算 出心肌短縮分率(fractional shortening，FS)，心肌短縮分率(fractional shortening，FS)的計算方法為[(EDD－ESD)/EDD]×100，其結果表示 心臟收縮的程度，其值越小表示心臟收縮越不完全(即ESD較大)，即 表示心臟有異常或病變。由以上面心臟舒張維度(EDD)與心臟收縮維 度 (ESD) 的 結 果 算 出 正 常 標 準 種 類 (standard strain) 之 果 蠅 (Drosophila ， w1118)公(male)與母(female)之間心肌短縮分率(fractional shortening，FS)的比較如圖 4.14 所示。. FS. Compare male and female w1118 at 1, 3, 5,and 7 weeks of age at 25°C showing fractional shortening(FS) in %. All data are expressed as mean + standard error (N=20). M(left) is male, FM(right) is female.. 圖 4.14 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下)公(male)與母(female)心肌短縮分率(fractional shortening，FS)比較圖，圖中縱座標之單位為%，橫座標為果蠅成長之週 數(week)，每筆Data皆表示成平均值+標準誤差，左邊表示公(male，M)， 右邊表示母(female，FM)。 - 49 -.
(64) 如圖 4.14 所示，可看出正常標準種類(standard strain)之果蠅 (Drosophila ， w1118)公(male)與母(female)之間心肌短縮分率(fractional shortening，FS)幾乎沒有差別，由以上的結果可以知道公(male)與母 (female)之間的心跳率(Heart Rate，HR)與心肌短縮分率(fractional shortening，FS)皆差異不大，如此推論可知，只單看公(male)的參數， 或只單看母(female)的參數就可得到所要的資訊，並且也瞭解到心肌 短縮分率(fractional shortening，FS)參數的重要性，因為此參數可以排 除因為果蠅體型所產生的差異，而可以明顯的看出果蠅的心臟是否有 病變或異常，這正是我們作此實驗的主要目的與動機：看出果蠅心臟 是否有病變或異常，而採用果蠅動物模式進行成人心臟病致病基因之 研究(可參考 第一章. 緒 論 ) 。 所 以 心 肌 短 縮 分 率 (fractional. shortening，FS)將是我們在實驗上探討果蠅心臟是否有病變或異常的 重要參數之一。. 4.3.1.2. 正 常 標 準 種 類 (standard strain) 果 蠅 (w1118) 與 心 臟 突 變. (mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)心跳率(Heart Rate，HR)之比較 我們由量測心臟突變(mutation)之果蠅(Mut8i、Mut9i)所得的結果 中知道公(male)與母(female)之間的結果相似，與 4.5.1 小節中所探討 之正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila， w1118)的實驗結 果：[公(male)與母(female)之間差異不大] 相符，因此以下皆只表示 及討論公(male)的果蠅之實驗結果。 此首先要討論與比較的是正常標準種類(standard strain)果蠅(w1118) 與心臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)的心跳率(Heart Rate，HR)， - 50 -.
(65) 其實驗結果比較如圖 4.15 所示。. Mut8i male N=20. Mut9i male N=20. week. week HR Mut8i, Mut9i, w1118 at 1, 3, 5,and 7 weeks of age at 25°C showing heart rate (HR) in beats per minute (bpm). All data are expressed as individual data points (left, N=20) and mean + standard error (right). The red line of the middle is expressed as the mean of 1 week.. w1118 male N=20. week. 圖 4.15 正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118)與心臟突 變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)公(male)的培養 1, 3, 5, 7 週在 25℃恆溫下 心跳率(Heart Rate，HR)比較圖，圖中縱座標心跳率(HR)之單位為平均每分 鐘跳動幾下(beats per minute，bpm)，橫座標為果蠅成長之週數(week)，所 有Data皆表示成左邊為各別Data數值，右邊為平均值+標準誤差，中間的 紅線表示為第一週Data的平均值。. 圖 4.15 中間的紅線表示第一週Data的平均值，由此紅線可以看出 心臟突變(mutation)之果蠅(Mut8i、Mut9i)心跳率(Heart Rate，HR)隨著 週數增加，即隨著果蠅年齡的增長，心跳率(Heart Rate，HR)明顯有 下降的趨勢，Mut8i與Mut9i皆大概從 325bpm 降到 250bpm 左右， 而正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118) 的心跳率 (Heart Rate，HR)卻沒有隨著年齡的增長有明顯的降低，但從文獻[50]. - 51 -.
(66) 中的結果知道正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118) 的心跳率(Heart Rate，HR)隨著年齡的增長也會有些微的降低，只是 在我們的系統沒有偵測出此結果，此為未來需要在後處理或系統上再 研究改進的地方，不過這裡還是可以看出心臟突變(mutation)之果蠅 (Mut8i、Mut9i)的心跳率(Heart Rate，HR)與正常標準種類(standard strain)之果蠅(Drosophila，w1118) 的心跳率(Heart Rate，HR)有明顯的 差異。. - 52 -.
(67) 4.4.1.3. 正 常 標 準 種 類 (standard strain) 果 蠅 (w1118) 與 心 臟 突 變. (mutation) 果 蠅 (Mut8i 、 Mut9i) 心 肌 短 縮 分 率 (fractional shortening，FS)之比較 首先看正常標準種類(standard strain) 果蠅(Drosophila，w1118)與心 臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i)在心臟舒張維度(EDD)與心臟收 縮維度(ESD)上之比較，實驗結果如圖 4.16 與圖 4.17 所示，圖中紅 線均表示為第一週的平均值，從圖 4.16 中可以看出正常標準種類 (standard strain)果蠅(w1118)隨著年齡的增長，心臟舒張維度(EDD)沒有 增 加 的 趨 勢 (1~7 週 皆 在 紅 線 附 近 ) ， 而 心 臟 突 變 (mutation) 果 蠅 (Mut8i、Mut9i) 隨著年齡的增長，心臟舒張維度(EDD)卻有增加的趨 勢(高於紅線)，心臟舒張維度(EDD)增加的情形大約從 5 週時開始有 些微的增加，而在 7 週時最為明顯。 從圖 4.17 中可以看出正常標準種類(standard strain)果蠅(w1118)隨著 年齡的增長，心臟收縮維度(ESD)同樣沒有增加的趨勢(1~7 週皆在紅 線附近)，而心臟突變(mutation)果蠅(Mut8i、Mut9i) 隨著年齡的增長， 心臟收縮維度(ESD)也有增加的趨勢(高於紅線)，心臟收縮維度(ESD) 增加的情形大約從 5 週時開始有些微的增加，而在 7 週時最為明顯。 由此可看出心臟舒張維度(EDD)與心臟收縮維度(ESD)的結果相似， 並且都與正常標準種類(standard strain)果蠅(w1118)有差異。. - 53 -.
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