第三章 研究方法及實驗材料
3.3 研究設備及分析方法
3.3.2 水質及膜阻塞物分析方法
(1) 總溶解固體物(TDS)、溫度及 pH 分析
總溶解固體物之分析乃利用TDS分析儀Ultrameter IITM(MYRON L Co., USA)進行分析，各模型廠試驗之分析頻率為 4 次/日；溫度則以一般電子式 溫度分別於各桶槽進行量測，頻率為4 次/日；pH值以pH計進行分析，，頻 率為4 次/日。
(2) 元素分析
元素之分析包括 Si、Al、Fe、Mn、Mg、Ca、Sr、Ba 等，樣品分析前 先經0.45 μm 濾紙過濾，過濾後以感應耦合電漿質譜儀 (inductively coupled plasma-mass spectrometer, ICP-MS) (Perkin Elmer, SCIEX ELAN 5000)進行 分析。
(3) 總菌數定量
本試驗之微生物定量採DAPI 染色法，進行總菌數之計量，其乃以含有 Irgalan Black 之黑色濾紙 (0.1 µm, GE Osmonics, Minnetonka, MN, USA) 過 濾後，於暗室中以100 μL 之 DAPI 染劑(Sigma-Aldrich Co., USA)進行染色，
並於螢光顯微鏡(Nikon, E400)下計數。
(4) 表面儀器分析
為能直接觀察薄膜表面之影像及更進一步確認表面積垢之成分，因此 利用FE-SEM (JEOL, JSM-6330F)及 FTIR(Bomem, DA8.3)等貴重儀器進行 膜表之直接掃描分析。
來進行本研究累積於RO 膜上之微生物計數，該染劑可標記微生物族群而不 影響其形態及功能(Oh et al., 1999)。此外，此染劑可用以追蹤微生物行為、
成長及個別細胞間之差異，其常被用在醫學及生命科學之研究；Holloway et al. (1999)、Prendergast et al. (1998)、Silverman et al. (2000)、 Hernit-Grant &
Macklis (1996)及 Dell'Accio et al. (2003)等，利用 PKH-26 表現各種細胞型 態，如造血細胞、免疫細胞、血液細胞、神經細胞及軟骨細胞，Raybourne &
Bunning (1994)、Shahabuddin et al. (1998)及 Kierbel et al. (2007)等則應用於 微生物之相關研究，如細菌與寄生蟲。圖3.7 即為本研究中經 PKH-26 染劑 染色後之膜表微生物釋放紅色螢光之顯微照片，此染劑之激發波長與發射 波長分別為551nm 與 567nm。
圖3.7 RO 膜表面 PKH-26 染色之微生物紅色螢光顯微照片
本研究參考上述醫學研究的長效染劑方法，衍生建立可用於本研究中 RO 膜表面微生物之計數程序，用以分辨黏附及增生之微生物，如圖 3.8 所 示。在試驗起始之第2 天，RO 膜便自膜組上移除，並以 PKH-26 染色後計 數，為減少計數位置所造成之差異，膜表面更被區分為9 個區域(3×3 陣列)，
每一區域另選擇9 個點進行計數(亦是 3×3 陣列)，此 81 個位置之微生物計
數量平均值表示了該操作時間下之膜表總累積微生物量，此時第一次所計 數之微生物量定義為「Count A」。而後將 RO 膜置回平板膜組，持續該試 驗期程，3 ~ 4 天後，該 RO 膜再度自膜組上取下，並直接計數，此時微生 物量定義為「Count B」；而後進行 PKH-26 染色，再次計數，此時微生物 量定義為「Count C」。隨後 RO 膜依然置回平板試驗模組，持續試驗，往 後每3 ~ 4 日皆重複新的「Count B」與「Count C」之計數，直到試驗結束。
其中 Count A 即表示試驗開始後，率先黏附至膜表的微生物量，而根 據已被染色之細胞，其分裂增生之子細胞亦帶有螢光，Count B 可表示 Count A 經三至四日後，已增生至 Count B，故以二者間之差作為微生物於此期間 之增生量，亦即
增生量=「Count B」-「Count A」
此外，「Count C」為新染色後所得之微生物量，「Count C」與「Count B」之差異，即本次剛被染色之微生物量，則可表示新黏附之微生物量，亦 即
新黏附量=「Count C」-「Count B」
待下一個循環，則「Count C」成為最末次之微生物量，可視為新的「Count A」值，持續「Count B」-「Count A」、「Count C」-「Count B」之循環計 算。
藉由圖3.9 可以見得，經 PKH-26 染色，原存在之生物顆粒及增生之生
Test run start
Membrane removed from module
after 2 days
Staining by PKH-26 and taking the first mircobal
counting as 'Count A'
Put membrane back to testing cell and and keep
running
Membrane removed from module after 3 to 4 days
Taking the residual mircobal counting
as 'Count B'
Staining by PKH-26 again and taking the new mircobal
counting as 'Count C'
Note:
1st cycle
multiplied cells = B – A newly adhered cells from feed water = C – B 2nd cycle to the end multiplied cells = B – A＇
newly adhered cells from feed water = C – B
set value A＇to be equal to C
圖3.8 微生物計數程序
3.3.4 微生物菌相分析
針對膜表累積微生物之菌相分析，本研究自試驗終了之RO 膜片裁取適 當大小之RO 膜，剪成碎片，置入 1.5 mL 微量離心管中，加入八分滿之滅 菌水，並利用超音波震盪20 分鐘，將膜表微生物細胞轉移至水相中，並於 移除微量離心管中之RO 膜碎片後貯存，做為進行後續 DNA 萃取、聚合酶 連鎖反應(PCR)及變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。
(1) DNA 萃取
DNA 萃取前以針頭抽放方式打散生物量，並以 1X 之 PBS 清洗兩次後 利用MO-BIO 之 DNA 萃取套組(MoBio, PowerSoilTM DNA Kit)進行 DNA 萃取，萃取步驟依產品建議之標準步驟進行。
(2) 聚合酶連鎖反應(PCR)
本研究於 PCR 增幅反應使用引子為 357F (5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)加上 GC clamp (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3’)及 907R (5’-CCG TCA ATT CAT TTG AGT TT-3’)(Sanchez et al., 2007)，PCR 反應條件如圖 3.9 所示。
94℃
5 min 1 min
1 min 4 min 94℃
50℃
72℃ 72℃
(3) 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
前述所得之 PCR 產物隨後便利用變性梯度凝膠電泳進行 DNA 片段序 列分離，所使用之系統為 Bio-Rad 之 D-Code universal mutation detection system，所配置變性梯度膠之配製相關藥劑如表 3.2，電泳條件為 200V、5 小時，取膠後以溴化乙錠(ethidium bromide, EtBr)染色，並以 Vilber Lourmat 照膠系統(E-BOX-1000)進行顯像。成功顯像後，便切取部份 DNA 片斷序 列，並進行序列回收，作為後續定序之用。
表 3.2 變性梯度膠之配製藥劑
Denature solution(%) 20 30 60 80
40% Acrylamide/Bis(mL) 5 5 5 5
50× TAE Buffer (mL) 0.4 0.4 0.4 0.4
Formamide (mL) 1.6 2.4 4.8 6.4
Urea (g) 1.64 2.46 4.92 6.56
H O (mL)2 [1] to 20 to 20 to 20 to 20
10% APS(mL) 0.2 0.2 0.2 0.2
TEMED (mL) 0.02 0.02 0.02 0.02
[1] Add H2O to attach a total volum of 20 mL after adding 40% Acrylamide/Bis, 50× TAE Buffer, Formamide and Urea.
第四章 鹹井水淡化及海水淡化廠 RO 膜之阻塞特性
本研究首先進行鹹井水淡化廠與海水淡化廠RO 膜之解剖分析，鑑定其 膜表阻塞物之種類與特性。
4.1 鹹井水淡化廠之 RO 膜阻塞特性
白沙淡化廠乃屬二階段RO 薄膜操作模式，並以鹹井水進行淡化，本研 究分別採取已阻塞且不堪使用之第一階段及第二階段RO 膜各一，運送至本 實驗室進行解剖分析。除探討造成薄膜阻塞物種之物化及生物特性外，更 區分不同薄膜部位，探討其阻塞程度與型態。
(1)外觀檢視
經由外觀檢視，第一階段RO 膜與第二階段 RO 膜之總重量相較之下，
以第一階段RO 膜輕許多，二捲式膜經解剖攤開後並裁取一片膜，如圖 4.1 所示，可見第一階段RO 膜表面沉積物呈咖啡色、黏膜狀，RO 膜進水端色 深，出水端色淺；第二階段RO 膜，膜表面沉積物呈黃色，具明顯之結垢狀、
質硬，且RO 進水端色淺，出水端色深。
圖4.2 為薄膜於 400 倍光學顯微鏡下所呈現之影像，第一階段 RO 膜可 見龜裂之阻塞物沉積，第二階段RO 膜照片則顯示平整之表面沉積，圖 4.3 為RO 膜 10000 倍之電子顯微照片，可清楚見得第一階段 RO 膜表面累積不 規則形狀之阻塞物，並有桿狀微生物分布於上，大小約1 ~ 2 µm，而第二階 段RO 膜表面則可明顯看出特殊結垢物之結晶形態。
圖4.1 白沙淡化廠 RO 膜攤開照片(a)第一階段 RO 膜(b)第二階段 RO 膜
圖4.2 白沙淡化廠 RO 膜 400×顯微照片(a)第一階段 RO 膜(b)第二階段 RO 膜
圖 4.3 白沙淡化廠 RO 膜 10000×電子顯微照片(a)第一階段 RO 膜(b)第二 階段 RO 膜
(2) 有機性阻塞物之定量
膜表面累積有機阻塞物含量乃以 550℃可被焚化之阻塞物作為有機質 定量之代表，將二階段RO膜之分析結果依上下游排列，結果如圖 4.4 所示，
圖4.4 (a)為第一階段膜，圖 4.4 (b)為第二段膜之分布情形，顯示有機阻塞物 含量愈接近第二階段膜之出水端含量愈高，然第一階段膜之各位置焚化損 失重量約佔總阻塞物重之85 ~ 93%，第二階段膜則僅佔 5 ~ 8%，顯示第一 階段膜之阻塞物多為有機質為主要阻塞型態，雖此，第二階段膜之有機物 含量可高達2.5 ~ 4 mg/cm2，普遍較第一階段之2 ~ 3 mg/cm2高，且藉由焚 化後之灰份可見第一階段膜所殘餘之成分為砂質顆粒，第二階段膜則為片 狀硬塊(圖 4.5)，故可推論第一階段膜主要以膠體顆粒及有機物為主要阻塞 物，第二階段膜則以無機物質伴隨大量有機物之沉澱，亦可能為二者之共 沉澱。
Organic substrate(mg/cm2)
inlet<--->outlet
inner layer<----------------------------------->outer layer
2.4
inner layer<----------------------------------->outer layer
3.5
(3) 結垢物元素分析
圖 4.6 為泡膜萃取液以ICP進行之元素分析結果，所得之元素總量百分 比，由(a)中可見第一階段RO膜並沒有較特異性之元素沉積，其最大元素含 量為Al之 1.44 mg/cm2，相較於第二階段膜 (圖 4.6 (b))，少於Fe含量之 1.68 mg/cm2，顯示第一階段膜之各種元素含量皆十分微量，然第二階段膜之分 析則顯示，Ca含量特別高，表示膜表面所觀察得之結垢物以Ca之化合物為 主。
此外，為了建構出實際RO膜表面之結垢物總量分布情形，乃將每一分 析位置之結垢物總量，以該位置之各元素含量總和表示，繪製出分佈圖如 圖4.7 所示，圖 4.7 (a)為第一階段膜，圖 4.7 (b)為第二段膜。該圖顯示第一 階段膜每單位面積所累積之結垢物含量很少，最高累積濃度約為 0.5 mg/cm2，而第二階段膜則明顯多許多，累積濃度皆大於10 mg/cm2，因此，
愈接近出水端，此時濃縮液之濃度愈高，導致鈣或其他元素之化合物於膜 表面沉澱析出。
Si Fe Mg Al Sr Ca Ba Mn
0.46 1.68 4.13 2.39 10.54
141.4
6.21 0.02
圖 4.6 白沙淡化廠 RO 膜表面累積元素所佔比例(a)第一階段 RO 膜(b) 第二階段 RO 膜
Total scalants (mg/cm2)
0.40
inner layer<--------->outer layer
(a)
Total scalants (mg/cm2)
15
inner layer<--------->outer layer
(b)
圖4.7 白沙淡化廠 RO 膜表面累積結垢之總量分布(a)第一階段 RO 膜(b) 第二階段RO 膜
(4) 微生物分析
經由DAPI染色計數，所得結果如圖 4.8 所示，圖 4.8 (a)屬第一階段膜，
圖 4.8 (b)屬第二段膜，由圖可得知，二段膜表面皆有大量微生物存在，特 別是第一階段膜，微生物累積量可達1.5 ~ 3×108 cells/cm2，而第二階段累積 量亦有 0.5 ~ 2.5×108 cells/cm2，因此生物性阻塞對鹹井水淡化膜阻塞之影 響，亦為實廠操作改善策略之考量中必須加以重視之課題。
(5) FTIR 分析結果
FTIR之分析結果如圖 4.9 所示，由圖可知，相較於乾淨之薄膜，第一、
二階段膜圖譜之波峰明顯少許多，此乃因為薄膜本身之訊號已多被表面沉 積物覆蓋，其中第一階段RO膜存在四個特徵波峰，1035 cm-1及 916 cm-1為 多醣類之特徵波峰，1631 cm-1及1562 cm-1則為蛋白質之特徵波峰，二者顯 示EPS之存在。第二階段膜之圖譜，其所顯示之波峰極為單純，根據專書
「Infrared spectral interpretation-a systematic approach」中以主要成分為非有 機物之樣品進行分析之結果，比對後本試驗結果與該書之碳酸鈣FTIR圖譜 十分相似，分別於1444 cm-1及874 cm-1二處出現特徵波鋒，其為無機碳酸 根之表徵，加上本試驗所得之主要元素為鈣，故推測第二階段薄膜表面之 結垢物屬碳酸鈣結垢。
Total cell count (*108 cell/cm2)
inner layer<--------->outer layer
(a)
Total cell count (*108 cell/cm2)
0.5
inner layer<--------->outer layer (b)
圖4.8 白沙淡化廠 RO 膜表面總菌數之分布(a)第一階段 RO 膜(b)第二階
圖4.8 白沙淡化廠 RO 膜表面總菌數之分布(a)第一階段 RO 膜(b)第二階