活性測試

將本研究中各分層萃取物或分離之化合物，測試其對於α-glucosidase活性抑制與清除

DPPH自由基活性效果，篩選適當的fraction進行細部分離純化。

3.2.1 抑制α-glucosidase 活性

α-葡萄糖苷酶，是一種醣類分解酶。在實驗過程中，以p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNPG)代替作為被分解的醣類，當PNPG被分解後，在波長400nm下會有吸收(呈現黃色)，

故藉由測定400nm下的吸收值來判斷樣品是否具有抑制α-glucosidase活性的能力。

實驗步驟：

A. α-glucosidase：配製α-glucosidase 0.4U/mL B. 配製0.7mM PNPG溶液

C. 待測樣品100 λ加入α-glucosidase 100 λ，37℃，溫浴10分鐘 D. 加入PNPG溶液100 λ，繼續溫浴20分鐘

E. 測量400nm之OD值 F. 計算抑制活性

3.2.2 清除 DPPH 自由基活性測試

DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil)是一種穩定的自由基。DPPH 的甲醇溶液在 517nm 波長下會有強烈吸收並且呈現紫色；當被抗氧化物還原時，DPPH 在 517nm 波長下吸光值 則會減低，造成顏色轉變為黃色或無色，當呈現的顏色愈淡，則代表清除 DPPH 自由基的 能力愈強，亦表示此成分樣品所具有的抗氧化能力愈好。故藉由測試在 517nm 波長下之吸 收值來判斷樣品是否具有清除自由基的能力。

實驗步驟：

A. 配製 1mM DPPH 甲醇溶液

B. 取 100 λ 之待測樣品，加入 100 λ DPPH 溶液，室溫下避光靜置 5 分鐘 C. 使用光度計檢測 517nm 之吸光值

D. 計算清除率

3.2.3 清除過氧化氫能力之測定

過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)是常見的活性氧物質之一，當過氧化氫與金屬離子 作用時會產生氫氧自由基。這些氫氧自由基容易與人體內許多重要的生物分子反應，而引 起脂質氧化連鎖反應。

Horseradish peoxidase (HRPase)為測定過氧化氫能力最常使用的方法，HRPase與H₂O₂ 作用會使酚紅(phenol red)氧化，此氧化物會在610nm有最大吸收波峰。故藉由測定610nm波 長下的吸收值來判斷樣品是否具有清除H₂O2的能力。

實驗步驟：

A. 配製 4mM H2O2溶液

B. 配製 horseradish peoxidase 0.5mg/mL C. 配製 7.5mM phenol red 溶液

D. 待測樣品1mL加入H₂O₂ 0.4mL，靜置10分鐘

E. 加入HRPase-phenol red溶液0.6mL，靜置10分鐘，冰浴10分鐘 F. 測量610nm之OD值

G. 計算清除率

3.2.4 抑制氫過氧化物產生之測定

抑制過氧化率之測定是採用硫氰酸鐵法(Ferric thiocyanate method)，以評估抗氧化劑之 抗氧化性。

硫氰酸鐵法是利用脂質氧化形成的氫過氧化物，將 Fe²⁺氧化成 Fe^3＋，Fe³⁺會與硫氰酸 根離子(SCN^－)反應生成紅色的硫氰酸鐵錯合物[Fe(SCN)₆^3－]，此錯合物在 500nm 有最大吸 收波峰。故藉由測試在 500nm 波長下的吸收值來判斷樣品的抗氧化能力。

實驗步驟：

A. 配製linoleic acid emulsion (pH 7.0)

B. 取0.02M之linoleic acid emulsion 2.5mL，加入樣品及0.2M之potassium phosphate buffer (pH=7) 2mL，靜置於37℃

C. 取上述樣品混合物0.1mL，依序加入75％乙醇溶液4.7 mL，30％ ammonium thiocyanate 0.1 mL和0.02M iron(Ⅱ) chloride tetrahydrate 0.1 mL，靜置3分鐘

D. 測量500nm之OD值 E. 計算抑制率

3.2.5 共軛雙烯之測定

不飽和脂肪酸氧化初期會因為脫氫作用而形成自由基，此自由基再經分子內重排而產 生共軛雙烯鍵，而共軛雙烯在與空氣長時間接觸後，會因為氧化而打斷鍵結並且形成羰基，

此共軛雙烯產物可經由測234nm之吸光值來得知其產生量。故藉由測定234nm波長之吸光值 來判斷樣品的抗氧化能力。

實驗步驟：

A. 配製linoleic acid emulsion (pH 6.6)

B. 取10mM之linoleic acid emulsion 2mL，加入0.1 mL的樣品，靜置於37℃

C. 於0及15小時，分別取出上述樣品混合物0.2mL，依序加入80％甲醇溶液7 mL D. 測量234nm之OD值

E. 計算抑制率

3.2.6 微脂粒氧化作用之抑制(Thiobarbituric acid reacting substance，TBARS 法)

利用TBA(thiobarbituric acid)之呈色法來測定脂質過氧化之產物。

在脂質過氧化過程中會產生丙二醛(malondialdehyde，MDA)，而加入的

TBA(thiobarbituric acid)會與MDA反應生成產物，利用532nm之吸光值測定產物的多寡，由 此判定脂質過氧化過程中MDA的量，故可得知脂質氧化的情況。

實驗步驟：

A. 製備微脂粒 10mg/mL 溶液

B. 配製 2.8％trichloacetic acid (TCA) 溶液 C. 1.0％thiobarbuturic acid (TBA) 溶液

D. 配製 20mg/mL butylated hydroxytoluene (BHT) 溶液 E. 配製 25mM FeCl3溶液

F. 配製 25mM ascorbic acid 溶液

G. 取 2mL 微脂粒懸浮液，加入 0.1mL FeCl₃、0.1 mL ascorbic acid、1.2mL 之 20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩衝溶液(pH=7.4)及加入 0.5mL 的待測樣品，靜置 37℃，2 小時 H. 加入 1mL BHT、2mL TBA 與 1mL TCA，在 100℃加熱 20 分鐘

I. 測量475nm之OD值 J. 計算清除率