第四章 結果與討論
第三節 白芍和赤芍有效成分作用於酪氨酸酶之抑制模式
一、Ethyl gallate (2)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(Ethyl gallate)對不同濃度的 基質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪製如圖 六。圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.37、0.75 mM)的抑制劑 (Ethyl gallate) 所 得 的 數 據 。 由 於 雙 倒 數 圖 中 的 線 性 方 程 式 為 1/V=Km/Vmax*1/S+1/Vmax (其中S為酵素反應之基質濃度、V為酵素反 應初速度、Km為酵素與基質的親和係數、Vmax為酵素對基質之最大反 應速度)，因此經由圖中的三條直線的線性回歸分析所得到的回歸方 程式即可求得在不同濃度的抑制劑存在下，各種酵素動力學的參數。
其結果分別為:
當Ethyl gallate 濃度為 0 mM 時：
1/V = 0.2579*1/S + 0.9647，Vmax= 1.04 δOD475* min-1，Km= 0.27 mM 當Ethyl gallate 濃度為 0.37 mM 時：
1/V = 0.3219*1/S + 0.9889，Vmax= 1.01 δOD475* min-1，Km’= 0.33 mM 當Ethyl gallate 濃度為 0.75 mM 時：
1/V = 0.508*1/S + 0.9941，Vmax= 1.00 δOD475* min-1，Km”= 0.51 mM 結果顯示三條直線的斜率(代表Km/Vmax)不同，但是在Y軸上的截距(代 表 1/Vmax)卻相近，說明在不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質
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當Methyl gallate 濃度為 0.13 mM 時：
1/V = 0.1819*1/S + 0.7132，Vmax= 1.40 δOD475* min-1，Km’= 0.25 mM 當Methyl gallate 濃度為 0.26 mM 時：
1/V = 0.3829*1/S + 0.7946，Vmax= 1.26 δOD475* min-1，Km”= 0.48 mM 結果顯示不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質有不同的親和係數 (Km)，但確有相近的最大反應初速度(Vmax)，顯示Methyl gallate亦是 屬於競爭性的抑制劑。抑制劑對酵素的親和係數之計算結果分別為:
當 Methyl gallate 濃度為 0.13 mM 時：
0.25 / 0.14 = 1 + 0.13 / Ki ，Ki = 165 μM 當 Methyl gallate 濃度為 0.26 mM 時：
0.48 / 0.14 = 1+0.26 / Ki ，Ki = 107 μM
三、Benzoic acid (4)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(Benzoic acid)對不同濃度的 基質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪製如圖 八。圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.20、0.40 mM)的抑制劑 (Benzoic acid)所得的數據。經由線性回歸分析所得到的各種酵素動力 學的參數分別為:
當Benzoic acid 濃度為 0 mM 時：
1/V = 0.1624*1/S + 0.683，Vmax= 1.46 δOD475* min-1，Km= 0.24mM
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1/V = 0.3506* 1/S + 1.036，Vmax= 0.97 δOD475* min-1，Km= 0.34 mM 當 p-Hydroxybenzoic acid 濃度為 0.50 mM 時：
1/V = 0.5384* 1/S + 1.0309，Vmax= 0.97 δOD475* min-1，Km’= 0.52 mM 當 p-hydroxybenzoic acid 濃度為 1.00 mM 時：
1/V = 0.8418* 1/S + 1.0533，Vmax= 0.95 δOD475* min-1，Km”= 0.80 mM 結果顯示在不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質有不同的親和係 數(Km)，但確有相近的最大反應初速度(Vmax)，顯示p-Hydroxybenzoic acid屬於競爭性的抑制劑。其抑制劑對酵素的親和係數之計算結果分 別為:
當 p-Hydroxybenzoic acid 濃度為 0.50 mM 時：
0.52 / 0.34 = 1 + 0.50 / Ki ，Ki = 0.94 mM 當 p-Hydroxybenzoic acid 濃度為 1.00 mM 時：
0.80 / 0.34 = 1+ 1.00 / Ki ，Ki = 0.74 mM
五、Paeoniflorin (8)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(Paeoniflorin)對不同濃度的基
質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪製如圖十。
圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.50、1.00 mM)的抑制劑 (Paeoniflorin)所得的數據。經由線性回歸分析所得到的各種酵素動力 學的參數分別為:
當Paeoniflorin 濃度為 0 mM 時：
抑制模式特性綜合整理列於Table 5。
Table 1. Scavening DPPH activity of the constituents isolated from the Paeonia lactiflora Pall.
Compounds SC50 (μM)
Gallic acid 65±1.7
Ethyl gallate 106±5.0
Methyl gallate 92±1.1
L-ascorbic Acida 138±5.5
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a Compound as positive control
Table 2. Scavening DPPH activity of the constituents isolated from the Paeonia veitchii Lynch
Compounds SC50 (μM)
Gallic acid 65±1.7
Ethyl gallate 106±5.0
Methyl gallae 92±1.1
Benzoic acid 1475±12
p-Hydroxybenzoic acid 304±3.5
Paeoniflorin 170±26 3, 3'-Di-O-methylellagic acid 26±1.8
4,3'-Di-O-methylellagic acid 11±0.9
L-ascorbic Acida 138±5.5
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a Compound as positive control
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Table 3. Inhibition effects on tyrosinase activity of the constituents isolated from the Paeonia lactiflora Pall.
Compounds IC50 (μM)
Ethyl gallate 1717±33
Methyl gallae 598±1.6
Kojic acida 54±2.5
α-Arbutina 2536±5
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a The standard inhibitors of tyrosinase
Table 4. Inhibition effects on tyrosinase activity of the constituents isolated from the Paeonia veitchii Lynch
Compound IC50 (μM)
Ethyl gallate 1717±33
Methyl gallae 598±1.6
Benzoic acid 737±7.1
p-Hydroxybenzoic acid 797±4.7
Paeoniflorin 2000±41
Kojic acida 54±2.5
α-Arbutina 2536±5.0
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a The standard inhibitors of tyrosinase
Table 5. Inhibitory effects and kinetic constants of the constituents isolated from Paeonia lactiflora Pall. and Paeonia veitchii Lynch Compounds Type of inhibition Ki (μM) Ethyl gallate competitive 1252±410 Methyl gallae competitive 136±29 Benzoic acid competitive 117±20 p-Hydroxybenzoic acid competitive 840±10 Paeoniflorin noncompetitive 510±200
Ethyl gallate
0 1 2 3 4
-6 -4 -2 0 2 4 6
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖六、Ethyl gallate 之 Lineweaver-Burk plots ，■代表 Ethyl gallate 之 濃度為0 mM，◆代表Ethyl gallate 之濃度為 0.37 mM，▲代表 Ethyl gallate acid 之濃度為 0.75 mM
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Methyl gallate
0 1 2 3 4
-9 -6 -3 0 3 6
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖七、 Methyl gallate 之 Lineweaver-Burk plots ，◆代表Methyl gallate 之濃度為 0 mM，▲代表 Methyl gallate 之濃度為 0.13 mM，■代表 Methyl gallate 之濃度為 0.26 mM
Benzoic acid
0 2 4 6 8 10
-6 -3 0 3 6 9 12
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖八、Benzoic acid 之 Lineweaver-Burk plots， ◆代表Benzoic acid 之濃度為0μM，■代表 Benzoic acid 之濃度為 0.20 mM，▲代表 Benzoic acid 之濃度為 0.40 mM
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p- Hydroxybenzoic acid
0 1 2 3 4 5
-6 -4 -2 0 2 4 6 8
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖九、 p-Hydroxybenzoic acid 之 Lineweaver-Burk plots ，◆代表 p-Hydroxybenzoic acid 之濃度為 0 mM，■代表 p-Hydroxybenzoic acid 之濃度為0.50 mM，▲代表 p-Hyroxybenzoic acid 之濃度為 1.00 mM
Paeoniflorin
0 2 4 6 8 10 12
-5 0 5 10
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖十、Paeoniflorin 之 Lineweaver-Burk plots，◆代表 Paeoniflorin 之 濃度為 0 mM，■代表 Paeoniflorin 之濃度為 0.50 mM，▲代表 Paeoniflorin 之濃度為 1.00 mM
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