嘉南藥理科技大學 化粧品科技研究所
碩士論文
中藥白芍和赤芍在化妝品生物活性之研究
Studies on the cosmetic bioactivities for Paeonia lactiflora Pall. and Paeonia veitchii Lynch
指導教授：丁秀玉 博士 研 究 生：許淑玲
中華民國九十六年七月
嘉南藥理科技大學 化粧品科技研究所 Department of Cosmetic Science,
Chia-Nan University of Pharmacy and Science
碩士論文
Thesis for the Degree of Master
中藥白芍和赤芍在化妝品生物活性之研究 Studies on the cosmetic bioactivities for Paeonia
lactiflora Pall. and Paeonia veitchii Lynch
指導教授：丁秀玉 博士（Dr. Hsiou-Yu Ding）
研 究 生：許淑玲（Shu-Ling Hsu）
中華民國九十六年七月
July 2007
中 文 摘 要
中藥白芍(Paeonia lactiflora Pall.)及赤芍(Paeonia veithii Lynch) 之乾燥根部進行有效成分分離及其在化妝品方面之生物活性試驗，實 驗進行是根據在化妝品之生物活性指標純化分離有效成分，並配合各 種光譜分析，加以證明及確認其化學結構式。從白芍中得到具有掃除 DPPH 自由基的化合物 Gallic acid (1)、Ethyl gallate (2)和 Methyl gallate (3)，具有抑制酪氨酸酶活性的化合物 Ethyl gallate (2)和 Methyl gallate (3)。化合物 2 和 3 抑制酪氨酸酶活性機制上均屬於競爭性的抑制作 用。
從赤芍得到具有掃除 DPPH 自由基的化合物 Gallic acid (1)、
Ethyl gallate (2)、Methyl gallate (3)、3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6) 和 4, 3'-Di-O-methylellagic acid (7)，具有抑制酪氨酸酶活性的化合物 Ethyl gallate (2)、Methyl gallate (3)、Benzoic acid (4)、p-Hydroxybenzoic acid (5)和 Paeoniflorin (8)，抑制酪氨酸酶活性機制上化合物 8 是屬於 非競爭性的抑制作用，其他化合物 2、3、4 和 5 皆屬競爭性的抑制作 用。化合物 6 和 7 首次自赤芍中分離得到，且首次發現具有掃除 DPPH 自由基作用。
關鍵字：白芍、赤芍、自由基、酪氨酸酶抑制劑
Abstract
The tradition Chinese medicine “Baishao” (roots of Paeonia lactiflora Pall.) and “Chishao” (roots of Paeonia veitchii Lynch) has been described to possess cosmetic bioactivities. The bioassay guided purification to get eight compounds. From “Baishao” was isolated three compounds, Gallic acid (1), Ethyl gallate (2) and Methyl gallate (3) show DPPH scavenging activity and Ethyl gallate (2) and Methyl gallate (3) inhibit tyrosinase activity. In the kinetic analysis, all the tyrosinase inhibitors were confirmed to inhibit mushroom tyrosinase with competitive manner.
From “Chishao” was isolated compounds, Gallic acid (1), Ethyl gallate (2), Methyl gallate (3), 3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6) and 4, 3'-Di-O-methylellagic acid (7) show DPPH scavenging activity and Ethyl gallate (2), Methyl gallate (3), Benzoic acid (4), p-Hydroxybenzoic acid (5) and Paeoniflorin (8) inhibit tyrosinase activity. In the kinetic analysis, compound 8 was confirmed to inhibit mushroom tyrosinase with noncompetitive manner. Compounds 2, 3, 4 and 5 were confirmed to inhibit mushroom tyrosinase with competitive manner. Among the purified compounds 6 and 7 were separated for the first from Chishao and were first identified with scavenging DPPH activity .
Key words : Baishao, Chishao, free radical scanvenger, tyrosinase
II
目 錄
頁數 中文摘要 I 英文摘要 ΙΙ
第一章 緒論 1
第一節 植物及藥材之槪述 1
第二節 研究背景 4
第三節 研究目的 7
第二章 白芍和赤芍有效成分之抽取與純化分離 9
第一節 白芍有效成分之抽取與純化分離 9
第二節 赤芍有效成分之抽取與純化分離 11
第三章 生物活性試驗 13
第一節 試劑的配製 13
第二節 掃除 DPPH 自由基能力分析 16
第三節 抑制酪氨酸酶活性分析 18
第四節 抑制劑對酪氨酸酶之抑制模式實驗 19
第四章 結果與討論 21
第一節 白芍和赤芍有效成分掃除 DPPH 自由基之作用 21
第二節 白芍和赤芍有效成分抑制酪氨酸酶之作用 23
第三節 白芍和赤芍有效成分作用於酪氨酸酶之抑制模式 25
第五章 結論 39
第六章 有效成分分離之實驗部份 41
第一節 儀器與材料 41
第二節 中藥材料及其抽取與純化分離 45
第三節 各化合物之物理及光譜數據 49
第七章 參考文獻 57
IV
圖 目 錄
頁數
圖一、芍藥之外觀繪圖 2
圖二、白芍之藥材 3
圖三、赤芍之藥材 3
圖四、 白芍有效成分之純化分離流程 10
圖五、 赤芍有效成分之純化分離流程 12
圖六、 Ethyl gallate 之 Lineweaver-Burk plots 34
圖七、 Methyl gallate 之 Lineweaver-Burk plots 35
圖八、 Benzoic acid 之 Lineweaver-Burk plots 36
圖九、 p-Hydroxybenzoic acid 之 Lineweaver-Burk plots 37
圖十、 Paeoniflorin 之 Lineweaver-Burk plots 38
表 目 錄
頁數
表一、白芍掃除DPPH 自由基有效成分之作用 31
表二、 赤芍掃除 DPPH 自由基有效成分之作用 31
表三、 白芍抑制酪氨酸酶有效成分之作用 32
表四、 赤芍抑制酪氨酸酶有效成分之作用 32
表五、白芍及赤芍有效成分作用於酪氨酸酶之抑制模式 33
VI
第一章 緒 論
第一節 植物及藥材之概述
芍藥在夏商時期，即已被中國人視為觀賞植物，遍佈於中國北
方，其根部可做藥用，不剝皮的為「赤芍」，剝皮的為「白芍」，所以
漢語中稱其為芍藥。
白芍(Paeonia lactiflora Pall.)為毛莨科(Ranunculaceae)，亦稱芍藥 科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeoina)之乾燥去皮根部。白芍又名金芍藥、
離草、餘容、可離、犂食、婪尾春、將離。主要分佈中國、日本、韓 國。其特徵生於山坡、山谷的灌木或草叢中。為多年生草本，高 60~80 厘米，根肥大。夏、秋採挖已栽植 3~4 年的芍藥根，除去根莖及鬚根，
洗淨，刮去粗皮，入沸水中略煮，使芍藥根發軟，撈出曬乾。乾燥根 呈圓柱形，粗細圴勻而平直，長 10~20 厘米，直徑 1~1.8 厘米。表面 淡紅棕色或粉白色。氣無，味微苦而酸(1,2)。
赤芍(Paeonia veitchii Lynch)亦為毛莨科(Ranunculaceae)，芍藥屬 (Paeoina)之乾燥根部。赤芍別名為木芍藥、紅芍藥、臭牡丹根、山芍 藥(3)。其特徵根肥大，通常為圓柱形或略呈紡錘形。莖直立，光滑無 毛。葉互生；具長柄；葉脈在下面隆起，葉基部常帶紅色。花甚大，
單生於莖的分枝頂端。多野生於內蒙古及東北等地(4)。藥材赤芍根之 氣微香，味甜帶苦、酸澀，呈圓柱形，稍彎曲，長 5~20 公分，表面 偶見栓皮層形成的斑痕，紅棕色或暗棕色；質鬆，斷面皮部黑褐色，
木部黃白色。去皮者表面呈淡紫紅色或肉白色；斷面則呈黃白色(5)。
圖一、芍藥之外觀繪圖 摘自「原色生藥學」
2
圖二、白芍之藥材
圖三、赤芍之藥材
第二節 研究背景
赤芍和白芍在漢朝不分，【神農本草經】通稱芍藥，所述功效主 治實際包括赤、白二種。至唐宋時，赤、白逐步分用。古代以產地、
顏色及大小而分，並以野生品為主。宋代以後則用栽培為主。在臨床 上，宋代將赤芍作為清熱藥，而將白芍當作補虛使用補陰藥。現代則 主要以栽培芍藥為主，採根後直接曬乾者為赤芍藥；先用沸水煮透再 去皮曬乾者為白芍藥。二者雖同出一物且藥性為寒，但在《本草求 真》：「赤芍藥與白芍藥主治略同。但白則有斂陰益營之力，赤則散 邪行血之意；白則能土中瀉木，赤則能於血中活滯」。赤芍味苦入肝，
臨床上則被用於清熱涼血化瘀止痛；用於血熱血瘀之證，白芍味酸苦 而入肝脾，用於肝陽上亢、肝失柔和、攣急作痛等證，臨床上則用於 補血斂陰平肝和柔肝止痛等作用。《名醫別錄》：「赤芍通順脈，緩 中，散惡血，逐賊血，去水氣，消癰腫」。《藥性論》：「赤芍消瘀 血，能蝕膿」。《醫學啟源》：「白芍可和血，固腠理，瀉肝，補脾 胃」。《滇南本草》：「白芍具瀉脾熱，止腹疼、止水瀉，收肝氣逆 疼，調養心、肝、脾經血，舒肝降氣，止肝氣庝痛」。《全國中成藥 產品集》：「赤芍疏肝清熱，活血化瘀；用於酒皶鼻、黃褐斑」。中 醫典籍中稱黃褐斑為蝴蝶斑或肝斑，皮損為對稱分佈於面部的黃褐色
4
斑片，常在顴骨部呈蝴蝶形。在《中國醫學大辭典》指出此症由憂思 抑鬱，血弱不華，火燥精滯而致肝火旺盛，上衝於面，皆均與肝有關，
故多從肝論治，在西醫方面則認為此症與腦下垂體及腎上腺素分泌失
調有關(6,7)。在中醫，區分斑症為以下幾型：
（1）氣滯血瘀型：斑色黑褐，患者或伴有其它慢性疾病，或見胸悶 脅痛、舌有瘀斑、苔薄、脈弦細。治宜理氣活血化瘀。
（2）脾虛溼熱型：患者除皮膚黃褐斑且斑色深褐色外，枯暗不榮並 見胃口差、消化不良或便秘、小便黃、舌質紅、苔黃膩、脈滑數。治 宜健脾利溼清熱。故以中醫觀點而言，治療斑點的藥材以舒肝解鬱、
補腎健脾和理氣活血為主。而白芍和赤芍在古籍記載皆具上述作用，
故選擇赤芍和白芍作為研究主題。
白芍現代藥理之研究具有解痙、降血壓、鎮痛、鎮靜、抗驚厥及 抗 潰 瘍 等 作 用 (8) 。 白 芍 已 被 確 定 之 化 學 成 分 有 Paeonol ， Oxypaeoniflorin ， Pentagalloylucose ， Gallic acid ， Albiflorin ， Paeoniflorin ， Benzoic acid ， Benzoylpaeoniflorin ， Paeonianins A ， Paeonianins B ， Paeonianins C ， Paeonianins D ， Paeonianins E 及 2-methoxy-5-(E)-propenyl-phenol-β-vicianoside等(9-12)。白芍在近代研究 指出具抗發炎、止痛及關節炎輔助藥物(13)、降低腦部栓塞 、(14) 降血脂
(15)、誘導肝癌細胞凋亡(16)等作用。
赤芍現代藥理之研究具有活血散瘀、止痛、消腫、清肝、涼血等 效能。為清熱涼血之藥(17)。已被純化分離出化學成分有Gallic acid，
Methyl gallate，Paeonol， Paeoniflorigenone， Gallotannin， Benzoic acid ， Paeoniflorin ， Paeonoside ， Paeonolide ， Albiflorin ， Oxypaeoniflorin ， Benzoylpaeoniflorin ， 9,12-Octadecadienoic acid ， n-Hexadecanoic acid ， Lactiflorin ， 2-Hydroxy-benaldehyde 及
1-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-ethanone等(18-24)。赤芍近代研究指出對 Klebsiella pneumoniae 、 Serratia marcescenshdr 、 Acinetobacter
baumannii、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌能力，並能與抗生素
產生協同作用(25)。抑制血小板聚集及血栓形成，達到活血化瘀之作用
(26)。對受損小鼠肝細胞具保護作用(27)。
6
第三節 研究目的
古代宮廷美容秘方中，使用率最高的為一些活血化瘀、祛風通絡 之品。中醫認為，有氣滯血瘀的人，往往會有肌膚粗糙、黑斑、面色 晦暗等現象，應當以活血祛瘀為基本治法。因此想從中藥研究中找到 真正有效成分。而選擇白芍及赤芍作為研究題材，除了二者是同屬同 種中藥並且在主要成分上有共同性，在藥理上二者亦有活血化瘀及清 熱涼血之作用。在《肘後備急方》著述中指出：”治人面無光潤、面 體黧黑、膚色粗陋、面血濁皮厚、頭不光澤等方藥時可使用芍藥來改
善”。《千金翼方》專辟「面藥」中記載令面光悅和卻老去皺的面膏方
中以芍藥作成方劑外敷。《壽養叢書》中提出黧黑斑、雀斑、黑子和 酒鼻查鼻等症皆有使用芍藥當方藥。而白芍、赤芍在中醫應用之分類屬 於補血和清熱涼血，功效上分為活血化瘀及清熱涼藥，活血即指防止 血液凝集，化瘀則指抑制血栓形成，促進血栓溶解，使血流順暢。在 藥理作用上具有抗菌消炎、抗氧化、抗過敏等作用。對皮膚的功效，
可改善皮膚黑斑、疤痕性組織增生、肌膚虛熱發疹、搔癢等症狀(28)。 赤芍在皮膚功效上具瘀滯腫痛、癰腫瘡瘍、目赤腫痛和鼻查鼻面黑干，白 芍則具平肝止痛、斂陰止汗、粉刺，黧黑斑等作用(29)。大陸學者研究 赤芍甲醇萃取物具有很強清除自由基作用(30-32)，白芍甲醇萃取物亦具
抗氧化作用(33)。上述學者之研究啟動了想去研究白芍和赤芍之有效成 分。因此本論文研究目的以體外實驗(in vitro)為主軸，期望藉由白芍、
赤芍有效成分純化分離之研究，以了解具抑制酪氨酸酶活性及抗氧化 作用等有效成分為何？並希望釐清白芍與赤芍在化妝品之生物活性 有何差異性。
8
第二章 白芍和赤芍有效成分之抽取與純化分離
第一節 白芍有效成分之抽取與純化分離
白芍(Paeonia lactiflora Pall.)磨成粉末以利於溶媒進行抽提，將 抽提物用不同極性之溶媒多次分配萃取，再將各層濃縮物進行抑制酪 氨酸酶及掃除 DPPH 自由基之活性試驗，結果顯示在 EtOAc 層有明 顯之生物活性。EtOAc 層以分子篩(Sephadex LH-20)、Lobar 及 HPLC 管柱層析進行純化分離，純化分離過程如圖四之流程所示。由白芍純 化分離得到三個純化學結構，其化合物經各種光譜分析方法鑑定證實 並與文獻比對證實為：
Aromatic acid dervatives：
Gallic acid (1) t
Ethyl gallate (2) Methyl gallate (3)
Goes to the skin root of Paeonia lactiflora (5.0 kg)
EtOH extract (305.0 g)
Extracted with EtOH(5L×5) at room temperature
n-Hexane / 95% MeOH
n-Hexane layer (34.0 g) 95% MeOH (267.0 g)
***EtOAc layer (30.0 g)
EtOAc/H2O
n-BuOH layer (109.0 g) H2O layer (126.0 g) H2O layer (235.0 g)
n-BuOH/ H2O
Fr.1 ***Fr.2 ***Fr.3 Fr.4
圖四、白芍有效成分之純化分離流程
Sephadex LH-20
*Gallic acid 【2.1 g】
***Ethyl gallate【13.1 mg】
***Metyl gallate【181.9 mg】
Lobar RP-8 HPLC-phenyl
Lobar RP-8 HPLC-phenyl
* Scavening DPPH activity
** Antityrosinase activity
*** Both scavening DPPH acivity and antityrosinase activities
10
第二節 赤芍有效成分之抽取與純化分離
赤芍(Paeonia veitchii Lynch)磨成粉末以利於溶媒進行抽提，將抽 提物用不同極性之溶媒多次分配萃取，將各層濃縮物進行抑制酪氨酸 酶及掃除DPPH自由基之活性試驗，結果顯示在 EtOAc層有明顯之生 物活性。EtOAc層以分子篩(Sephadex LH-20)、Lobar及HPLC管柱層 析進行分離工作，純化分離過程如圖五之流程所示。從赤芍純化分離 得到八個化合物，所有化合物經各種光譜分析方法鑑定證實，並與文 獻比對證實為：
A. Aromatic acid dervatives：
Gallic acid (1) Ethyl gallate (2) Methyl gallate (3) Benzoic acid (4)
p-Hydroxybenzoic acid (5)
3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6) 4, 3'-Di-O-methylellagic acid (7) B. Monoterpene glycosides：
Paeoniflorin (8)
Root of Paeonia veitchii (5.0 kg)
EtOH extract (1.40 kg)
Extracted with EtOH(5L×5) at room temperature
n-Hexane / 95% MeOH
n-Hexane layer (0.15 kg)
95% MeOH (1.25 kg )
***EtOAc layer (60.0 g)
EtOAc/H2O
n-BuOH layer (278.0 g) H2O layer (890.0 g)
H2O layer n-BuOH/ H2O
Fr.1 **Fr.2 ***Fr.3 ***Fr.4 *Fr.5
圖五、赤芍有效成分之純化分離流程
Sephadex LH-20
** Paeoniflorin【2.1 g】
** Benzoic acid【230.7 mg】
** p-Hydroxybenzoic acid【106.0 mg】
***Ethyl gallate【30.3 mg】
* Gallic acid【1.6 g】
***Metyl gallate【4.2 mg】
Lobar RP-8 HPLC-phenyl
Lobar RP-8 HPLC-phenyl
Lobar RP-8 HPLC-phenyl
Lobar RP-8
* Scavening DPPH activity
** Antityrosinase activity
*** Both scavening DPPH acivity and antityrosinase activities
*3, 3'-Di-O-methylellagic acid【9.3 mg】
*4, 3'-Di-O-methylellagic acid【10.1 mg】
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第三章 生物活性試驗
第一節 試劑的配製
(1) 50 mM磷酸緩衝溶液(Phosphate Buffer)
取0.680 g的KH2PO4加水定量至100 ml，另取0.870 g的K2HPO4加 水定量至100 ml，將兩溶液等體積混合，再將混合溶液之pH值調 至6.8。
(2) 1 mM酪氨酸水溶液
精秤0.018 g的酪氨酸，加磷酸緩衝溶液(50 mM)攪拌溶解，定量 至100 ml。
(3) 10 U酪氨酸酶水溶液
精秤3.5 mg (2870 units/mg)的酪氨酸酶，加磷酸緩衝溶液(50 mM) 攪拌至溶解，定量至1000 μl，置於4 ℃冷藏。
(4) 2.5 mM Dopa溶液
精秤5.0mg的Dopa，加磷酸緩衝溶液(50 mM)攪拌至溶解定量至 10 ml。
(5) 1 mM DPPH溶液
精秤 0.40g 的 DPPH，溶於 1 公升 50 %的甲醇中，震盪混合均勻
（呈深紫色），冷暗藏於 4 ℃保存。
(6) 標準品的備製
Kojic acid (MW= 142.1)配製成不同濃度溶液(5μM、10μM、15μM、
20μM、35μM)，α-Arbutin (MW= 272.2) 配製成不同濃度溶液(、
0.6 mM、0.8mM、1.0mM 、1.2mM、1.4mM)，L-Ascorbic acid (MW=
176.1) 配製成不同濃度溶液(10μM、15μM、20μM、25μM、
30μM )。
(7)待測藥物的備製
Gallic acid(MW=170) 掃 除 DPPH 自 由 基 時 所 配 製 濃 度 (2μM 、 4μM、7μM、10μM、13μM)抑制酪氨酸時所配製濃度為(5mM、
10mM、15mM、20mM、25mM)，Ethyl gallate(MW=198)掃除DPPH 自由基時所配製濃度(5μM、10μM、15μM、20μM、25μM)抑制 酪氨酸時所配製不同濃度(0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、
2.5mM)，Methyl gallate(MW=184)掃除DPPH自由基時所配製濃度 (4μM、6M、8μM、10μM、12μM)抑制酪氨酸時所配製濃度為 (0.4mM、0.9mM、1.4mM、1.9mM、2.4mM)，Benzoic acid(MW=122) 掃 除DPPH 自 由 基 時 所 配 製 濃 度 (0.5mM 、 1.5mM 、 2.5mM 、 3.5mM、4.5mM)抑制酪氨酸時所配製濃度為(0.2mM、0.4mM、
0.6mM、0.8mM、1.0mM)，P-Hydroxybenzoic acid(MW=138) 掃 除DPPH自由基時所配製濃度(0.5mM、1.5mM、2.5mM、3.5mM、
14
4.5mM)抑制酪氨酸時所配製濃度為(0.5mM、1.0mM、1.5mM、
2.0mM、2.5mM)，Paeoniflorin(MW=480)掃除DPPH自由基時所 配製濃度(0.3mM、0.6mM、0.9mM、1.2mM、1.4mM))抑制酪氨 酸時所配製濃度為(0.4mM、0.8mM、1.2mM、1.4mM、2.0mM)，
3, 3'-Di-O-methylellagic acid(MW=330)掃除DPPH自由基時所配 製濃度(2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM)抑制酪氨酸時所配製 濃 度 為 (5mM 、 10mM 、 15mM 、 20mM 、 25mM) ， 4, 3'-Di-O-methylellagic acid(MW=330) 掃除DPPH自由基時所配製 濃度(2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM)抑制酪氨酸時所配製濃 度為(5mM、10mM、15mM、20mM、25mM)。
第二節 掃除 DPPH 自由基能力分析
現代醫學指出人類的衰老和自由基有關連(34)。在抗氧化的研究 中，普遍使用DPPH來評估抗氧化劑的供氫能力。DPPH的甲醇溶液在 517 nm有很強的吸光值，當DPPH與抗氧化劑反應時吸光值會消失或 降低，故在517 nm吸光值越低即表示抗氧化劑的供氫能力愈強。
其化學反應式如下：
NO2
NO2
O2N
N.
N
NO2
O2N NO2
NH N
抗氧化劑
DPPH．
(Violet) λ517 nm
DPPH-H (decoloried)
參考 Sadhu SK 等人之方法(35)修飾測定。實驗步驟：
1. 加入 50 mM 的磷酸緩衝溶液 20 μl 至 96 孔微陣列盤(96-well microtiter plate)。
2. 依序將不同濃度的標準品(L-Ascorbic acid)及對照組(藥物組)，取
16
至96 孔微陣列盤。空白控制組以水代替藥物組。
3. 再加入 80μl DPPH 溶液至 96 孔微陣列盤內。
4. 最後加水補體積至每個 96 孔微陣列盤內總體積為 150 μl。
5. 96 孔微陣列盤內混合液避光反應 30 分鐘。
6. 將混合液以分光光度計於波長 517 nm 測其吸光值。
7. 掃除自由基(DPPH)能力之計算公式
DPPH radical Scavenging (%)= [(A-B) /A] × 100 A=空白控制組反應於 517 nm 測得吸光值。
B=藥物組反應於 517 nm 測得吸光值。
第三節 抑制酪氨酸酶活性分析
黑色素細胞內黑色體主要藉由酪氨酸酶的催化，最後氧化聚合成 黑色素(36)
。
酪氨酸酶活性檢測法，通常以生化酶法較為簡單成熟。酪氨酸和酪氨酸酶之混合液在492 nm有吸光，當吸光值變低時；表示 藥物具抑制酪氨酸酶活性越強，反之增加吸光值則具活化酪氨酸酶活 性。依據 Soung DY等人技術報告的方法(37) 稍加修飾。實驗步驟：
1. 加入 50 mM 的磷酸緩衝溶液 20 μl 至 96 孔微陣列盤。
2. 將不同濃度標準品(Kojic acid、α-Arbutin)及對照組(藥物組)，取 至96 孔微陣列盤。空白控制組以水代替藥物組。
3. 再加入 79 μl 的 1mM 酪氨酸溶液及 1 μl 的酪氨酸酶溶液至 96 孔 微陣列盤。
4. 最後加水補體積至每個 96 孔微陣列盤內總體積為 150 μl 。 5. 將 96 孔微陣列盤置於 37℃下震盪器上震盪反應 30 分鐘。
6. 反應完後，將混合液以分光光度計於波長 492 nm 測其吸光值。
7. 酪氨酸酶抑制率計算公式
Tyrosinase Inhibition (%) =[ (A-B) / A] × 100 A=空白控制組反應於 492 nm 測得吸光值。
B=藥物組反應於 492 nm 測得吸光值。
18
第四節 抑制劑對酪氨酸酶之抑制模式實驗
經由酵素動力學的研究可促使我們了解抑制劑對酵素是屬於何 種模式的抑制，使抑制劑在整個作用機轉之研究上更加完善。實驗參 考 Ley JP 等人的方法(38)，實驗步驟：
1. 每個比色槽中加入 50 mM 磷酸緩衝液。再加入不同濃度 Dopa 溶液 (0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1.0 mM)。
2. 每個比色槽再加入固定濃度的藥物後混和均勻。
3. 最後每個比色槽加入 2.5 μl(10U)之酪氨酸酶。
4. 震盪混合均勻後，以分光光度計於波長 475 nm、每 5 秒鐘記錄 其吸光值，記錄時間總計 2 分鐘。
5. 以線性回歸曲線圖，計算每個比色槽中酪氨酸酶的反應初速度。
6. 將每個比色槽中酪氨酸酶的反應基質 Dopa 濃度的倒數值當 X 軸 與酪氨酸酶的反應初速度倒數值當 Y 軸計算出來並繪製倒數 圖。
7. 改變藥物濃度重覆上述流程。
8. 當抑制劑濃度為零時，可利用下列公式計算酵素對此基質的最 大反應速度及與此基質的親和係數：
1/V = Km/Vmax * 1/S +1/Vmax
其中 ：S為酵素反應之基質濃度、V為酵素反應初速度、Km
為酵素與基質的親和係數、Vmax 為酵素對此基質之最大反應速 度。
9. 針對競爭型的抑制劑，由於不改變酵素對此基質的最大催化速 度，僅改變此酵素對該基質的親和係數。因此可利用在不同濃 度抑制劑的親和係數，求得酵素對此抑制劑的親和係數。其公 式如下：
Km’/ Km = 1+ I / Ki
其中：Km’為酵素在該抑制劑濃度下與基質的親和係數、Km為 在該抑制劑濃度為零時酵素與基質的親和係數、I 為抑制劑之濃 度、Ki 為此抑制劑與酵素的親和係數。
10. 針對非競爭型的抑制劑，由於改變酵素對此基質的最大催化速 度，但不改變酵素對此基質的親和係數。因此利用在不同濃 度時抑制劑的最大催化速度，求得酵素對此抑制劑的親和係 數。其公式如下：
Vmax / Vmax’ = 1+ I / Ki
其中：Vmax’為有抑制劑時酵素對此基質之最大反應速度、Vmax
為無抑制劑時酵素對此基質之最大反應速度、I為抑制劑之濃 度、Ki 為此抑制劑與酵素的親和係數。
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第四章 結果與討論
第一節 白芍與赤芍有效成分掃除 DPPH 自由基之作用
一、白芍有效成分掃除 DPPH 自由基之作用：
白芍(Paeonia lactiflora Pall.)經由掃除DPPH自由基分析指標來純 化分離得到三個純化合物，具有掃除DPPH自由基之活性，分別是 Gallic acid (1)、Ethyl gallate (2)和Methyl gallate (3)，其掃除DPPH自由 基之50 % (SC50) 如Table 1 所示。
二、赤芍有效成分掃除 DPPH 自由基之作用：
赤芍(Paeonia veitchii Lynch)，經由掃除DPPH自由基分析指標來 純化分離得到五個具掃除DPPH自由基的活性化合物，分別是Gallic acid (1)、Ethyl gallate (2)、Methyl gallate (3)、3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6)和 4,3'-Di-O-methylellagic acid (7)，其掃除DPPH自由基之 50 % (SC50) 如Table 2 所示。
三、討論：
年齡增加與日光傷害都可使自由基增加，皮膚老化的機轉可因過 量的自由基，造成皮膚出現皺紋、色素異常、微血管擴張等老化現象。
近年來，自由基所產生的氧化性損壞及對皮膚的影響，日益受到重視
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(39,40)。1996 年Rice-Evans等人研究指出(41)：化合物具有抗氧化能力則
是芳香環(Aromatic ring)上羧基(COOH)和OH基的數目多寡及位置不 同而異(42)。從Table 1、2 所列 4, 3'-Di-O-methylellagic acid (SC50 = 11 μM±0.9)，3, 3'-Di-O-methylellagic acid (SC50 = 26 μM±1.8)，Gallic acid (SC50 = 65 μM±1.7)，Ethyl gallate (SC50 = 106 μM±5.0)和Methyl gallate (SC50 = 92 μM±1.1) 等 芳 香 酸 衍 生 物 在 掃 除 自 由 基 能 力 皆 優 於 L-ascorbic acid (SC50 = 138 μM±5.5)，其中以 4, 3'-Di-O-methylellagic acid掃除自由基能力居冠，3, 3'-Di-O-methylellagic acid次之。而Gallic acid因具有羧基及三個OH基且是鄰位，故具有掃除自由基能力。Ethyl gallate和Methyl gallate，從結構上兩者皆以Gallic acid為主結構；但在 羧基上Ethyl gallate 接-C2H5而Methyl gallate則接-CH3故掃除自由基 結果有差異性。P-Hydroxybenzoic acid和Benzoic acid自由基掃除率 SC50分別為304 μM、1475 μM，p-Hydroxybenzoic acid因具有一個OH 基，所以清除自由基能力優於Benzoic acid。Benzoic acid没接OH基，
故没有H+可提供給DPPH，所以掃除DPPH自由基能力最弱。赤芍在 中醫藥應用屬清熱涼血，涼血即止血，可對抗細菌及病毒所引起之組 織發炎，血管通透性增加，血管內血栓，內皮細胞易受自由基傷害，
而赤芍具掃除DPPH自由基之作用，由此證實赤芍具清熱涼血之功 效 。
第二節 白芍和赤芍有效成分抑制酪氨酸酶之作用
一、白芍有效成分抑制酪氨酸酶之作用：
白芍(Paeonia lactiflora Pall.)經由抑制酪氨酸酶活性分析指標來 純化分離，最後得到具有抑制酪氨酸酶活性的化合物二個，分別為 Ethyl gallate (2)和Methyl gallate (3)，抑制酪氨酸酶活性之 50 % (IC50) 如Table 3 所示。
二、赤芍有效成分抑制酪氨酸酶之作用：
赤芍(Paeonia veitchii Lynch)經由抑制酪氨酸酶活性分析指標來 純化分離，最後得到具有抑制酪氨酸酶活性的化合物，分別為Ethyl gallate (2)、Methyl gallate (3)、Benzoic acid (4)、p-Hydroxybenzoic acid (5)和Peaoniflorin (8)，抑制酪氨酸酶活性之 50 % (IC50) 如Table 4 所 示。
三、討論：
黑色素的生成可以阻止紫外線的穿透，保護皮膚免受紫外線的傷 害，但過多的黑色素累積會導致斑點或黑色素瘤的形成(43)Table 3、4 所列與標準品kojic acid和 α-Arbutin比較，雖然抑制效果較kojic acid (IC50= 54 μM±2.5)弱，但Ethyl gallate (IC50= 1717 μM±33)、Methyl gallate (IC50= 598 μM±1.6) 、 Benzoic acid (IC50= 737 μM±7.1) 、
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P-Hydroxybenzoic acid (IC50= 797 μM±4.7)和 Paeoniflorin (IC50= 2000 μM±41)等化合物皆優於 α-Arbutin (IC50= 2536 μM±5.0)。
Conrad等人在1994年研究指出(44)芳香環上只要有一個羧基存在 的環境下，會與銅離子鍵結而形成猶如 monophenol 的結構，具抑制 酪氨酸酶的活性，徹底阻斷黑色素形成(45)。Benzoic acid在抑制酪氨 酸 酶 活 性 上 的 表 現 優 於 掃 除 DPPH自由基的能力，這可歸因於 Benzoic acid化合物在結構上與酪氨酸有相似的特性，故能作為酪氨 酸酶的受質進而抑制黑色素的生成(46)。而Methyl gallate與Ethyl gallate 具Dopa類似體可以與Dopa競爭，產生競爭性的抑制作用，使得黑色 素的生成減少(47,48)。
第三節 白芍和赤芍有效成分作用於酪氨酸酶之抑制模式
一、Ethyl gallate (2)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(Ethyl gallate)對不同濃度的 基質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪製如圖 六。圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.37、0.75 mM)的抑制劑 (Ethyl gallate) 所 得 的 數 據 。 由 於 雙 倒 數 圖 中 的 線 性 方 程 式 為 1/V=Km/Vmax*1/S+1/Vmax (其中S為酵素反應之基質濃度、V為酵素反 應初速度、Km為酵素與基質的親和係數、Vmax為酵素對基質之最大反 應速度)，因此經由圖中的三條直線的線性回歸分析所得到的回歸方 程式即可求得在不同濃度的抑制劑存在下，各種酵素動力學的參數。
其結果分別為:
當Ethyl gallate 濃度為 0 mM 時：
1/V = 0.2579*1/S + 0.9647，Vmax= 1.04 δOD475* min-1，Km= 0.27 mM 當Ethyl gallate 濃度為 0.37 mM 時：
1/V = 0.3219*1/S + 0.9889，Vmax= 1.01 δOD475* min-1，Km’= 0.33 mM 當Ethyl gallate 濃度為 0.75 mM 時：
1/V = 0.508*1/S + 0.9941，Vmax= 1.00 δOD475* min-1，Km”= 0.51 mM 結果顯示三條直線的斜率(代表Km/Vmax)不同，但是在Y軸上的截距(代 表 1/Vmax)卻相近，說明在不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質
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有不同的親和係數(Km)，但確有相近的最大反應初速度(Vmax)，顯示 Ethyl gallate是屬於競爭性的抑制劑。此外針對競爭性的抑制劑可以利 用在不同濃度的抑制劑存在下，測量酪氨酸酶對基質的親和係數(Km) 的改變，藉由方程式：Km’/ Km= 1+ I/ Ki (其中Km’ 為酵素在該抑制劑 濃度存在下與基質的親和係數、Km 為酵素與基質的親和係數、I為抑 制劑之濃度、Ki 為此抑制與酵素的親和係數)可求得此競爭型抑制劑 對酵素的親和係數。其結果分別為：
當 Ethyl gallate 濃度為 0.37 mM 時：
0.33 / 0.27 = 1 + 0.37 / Ki ，Ki = 1.66 mM 當 Ethyl gallate 濃度為 0.75 mM 時：
0.51 / 0.27 = 1+0.75 / Ki ，Ki = 0.84 mM
二、Methyl gallate (3)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(Methyl gallate)存在上，對不 同濃度的基質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪 製如圖七。圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.13、0.26 mM)的 抑制劑(Methyl gallate)所得的數據。經由線性回歸分析所得到的各種 酵素動力學的參數分別為:
當Methyl gallate 濃度為 0 mM 時：
1/V = 0.0888*1/S + 0.624，Vmax= 1.60 δOD475* min-1，Km= 0.14mM
當Methyl gallate 濃度為 0.13 mM 時：
1/V = 0.1819*1/S + 0.7132，Vmax= 1.40 δOD475* min-1，Km’= 0.25 mM 當Methyl gallate 濃度為 0.26 mM 時：
1/V = 0.3829*1/S + 0.7946，Vmax= 1.26 δOD475* min-1，Km”= 0.48 mM 結果顯示不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質有不同的親和係數 (Km)，但確有相近的最大反應初速度(Vmax)，顯示Methyl gallate亦是 屬於競爭性的抑制劑。抑制劑對酵素的親和係數之計算結果分別為:
當 Methyl gallate 濃度為 0.13 mM 時：
0.25 / 0.14 = 1 + 0.13 / Ki ，Ki = 165 μM 當 Methyl gallate 濃度為 0.26 mM 時：
0.48 / 0.14 = 1+0.26 / Ki ，Ki = 107 μM
三、Benzoic acid (4)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(Benzoic acid)對不同濃度的 基質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪製如圖 八。圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.20、0.40 mM)的抑制劑 (Benzoic acid)所得的數據。經由線性回歸分析所得到的各種酵素動力 學的參數分別為:
當Benzoic acid 濃度為 0 mM 時：
1/V = 0.1624*1/S + 0.683，Vmax= 1.46 δOD475* min-1，Km= 0.24mM
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當Benzoic acid 濃度為 0.20 mM 時：
1/V = 0.4507*1/S + 0.758，Vmax= 1.32 δOD475* min-1，Km’= 0.59 mM 當Benzoic acid 濃度為 0.40 mM 時：
1/V = 0.9184* 1/S + 0.746，Vmax= 1.34 δOD475* min-1，Km”= 1.23 mM 結果顯示在不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質有不同的親和係 數(Km)，但確有相近的最大反應初速度(Vmax)，顯示Benzoic acid亦是 屬於競爭性的抑制劑。其抑制劑對酵素的親和係數之計算結果分別 為：
當 Benzoic acid 濃度為 0.20 mM 時：
0.59 / 0.24 = 1 + 0.20 / Ki ，Ki = 137 μM 當 Benzoic acid 濃度為 0.40 mM 時：
1.23 / 0.24 = 1+ 0.40 / Ki ，Ki = 97 μM
四、p-Hydroxybenzoic acid (5)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(p-Hydroxybenzoic acid)對不 同濃度的基質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪 製如圖九。圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.50、1.00 mM)的 抑制劑(p-Hydroxybenzoic acid)所得的數據。經由線性回歸分析所得到 的各種酵素動力學的參數分別為:
當 p-Hydroxybenzoic acid 濃度為 0 mM 時：
1/V = 0.3506* 1/S + 1.036，Vmax= 0.97 δOD475* min-1，Km= 0.34 mM 當 p-Hydroxybenzoic acid 濃度為 0.50 mM 時：
1/V = 0.5384* 1/S + 1.0309，Vmax= 0.97 δOD475* min-1，Km’= 0.52 mM 當 p-hydroxybenzoic acid 濃度為 1.00 mM 時：
1/V = 0.8418* 1/S + 1.0533，Vmax= 0.95 δOD475* min-1，Km”= 0.80 mM 結果顯示在不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質有不同的親和係 數(Km)，但確有相近的最大反應初速度(Vmax)，顯示p-Hydroxybenzoic acid屬於競爭性的抑制劑。其抑制劑對酵素的親和係數之計算結果分 別為:
當 p-Hydroxybenzoic acid 濃度為 0.50 mM 時：
0.52 / 0.34 = 1 + 0.50 / Ki ，Ki = 0.94 mM 當 p-Hydroxybenzoic acid 濃度為 1.00 mM 時：
0.80 / 0.34 = 1+ 1.00 / Ki ，Ki = 0.74 mM
五、Paeoniflorin (8)作用於酪氨酸酶之抑制模式
測量酪氨酸酶在不同濃度的抑制劑(Paeoniflorin)對不同濃度的基
質(Dopa)的反應初速度，所得結果利用雙倒數法做圖可繪製如圖十。
圖中的三條直線是代表在不同濃度(0、0.50、1.00 mM)的抑制劑 (Paeoniflorin)所得的數據。經由線性回歸分析所得到的各種酵素動力 學的參數分別為:
當Paeoniflorin 濃度為 0 mM 時：
1/V = 0.2536*1/S + 0.7363，Vmax=1.36 δOD475* min-1，Km= 0.34 mM 當Paeoniflorin 濃度為 0.50 mM 時：
1/V = 0.5171* 1/S +1.4385，Vmax’=0.70 δOD475* min-1，Km= 0.36 mM 當Paeoniflorin 濃度為 1.00 mM 時：
1/V = 0.8032* 1/S + 2.2093，Vmax”=0.45 δOD475* min-1，Km= 0.37 mM 結果顯示三條直線的斜率(代表Km/Vmax)不同，但是在X軸上的截距(代 表 1/Km)卻相近，說明在不同濃度抑制劑存在下，酪氨酸酶對基質有 相近的親和係數(Km)，但確有不同的最大反應初速度(Vmax)，顯示 Paeoniflorin是屬於非競爭性的抑制劑。此外針對非競爭性的抑制劑可 以利用在不同濃度的抑制劑存在下，測量最大反應初速度的改變透過 方程式：Vmax / Vmax ’=1+ I/Ki (其中Vmax ＇為有抑制劑之最大反應初速 度、Vmax 為無抑制劑之最大反應初速度、I為抑制劑之濃度、Ki 為此 抑制劑與酵素的親和係數)可求得此非競爭型抑制劑對酵素的親和係 數。其結果分別為：
當 Paeoniflorin 濃度為 0.50 mM 時：
1.36 / 0.70 = 1 + 0.50 / Ki ，Ki = 0.53 mM 當 Paeoniflorin 濃度為 1.00 mM 時：
1.36 / 0.45 = 1+1.00 / Ki ，Ki = 0.49 mM
上述白芍與赤芍具抑制酪氨酸酶之抑制劑，針對酪氨酸酶抑制作用其
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抑制模式特性綜合整理列於Table 5。
Table 1. Scavening DPPH activity of the constituents isolated from the Paeonia lactiflora Pall.
Compounds SC50 (μM)
Gallic acid 65±1.7
Ethyl gallate 106±5.0
Methyl gallate 92±1.1
L-ascorbic Acida 138±5.5
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a Compound as positive control
Table 2. Scavening DPPH activity of the constituents isolated from the Paeonia veitchii Lynch
Compounds SC50 (μM)
Gallic acid 65±1.7
Ethyl gallate 106±5.0
Methyl gallae 92±1.1
Benzoic acid 1475±12
p-Hydroxybenzoic acid 304±3.5
Paeoniflorin 170±26 3, 3'-Di-O-methylellagic acid 26±1.8
4,3'-Di-O-methylellagic acid 11±0.9
L-ascorbic Acida 138±5.5
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a Compound as positive control
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Table 3. Inhibition effects on tyrosinase activity of the constituents isolated from the Paeonia lactiflora Pall.
Compounds IC50 (μM)
Ethyl gallate 1717±33
Methyl gallae 598±1.6
Kojic acida 54±2.5
α-Arbutina 2536±5
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a The standard inhibitors of tyrosinase
Table 4. Inhibition effects on tyrosinase activity of the constituents isolated from the Paeonia veitchii Lynch
Compound IC50 (μM)
Ethyl gallate 1717±33
Methyl gallae 598±1.6
Benzoic acid 737±7.1
p-Hydroxybenzoic acid 797±4.7
Paeoniflorin 2000±41
Kojic acida 54±2.5
α-Arbutina 2536±5.0
Each value represents the mean ± S.D. (n=3)
a The standard inhibitors of tyrosinase
Table 5. Inhibitory effects and kinetic constants of the constituents isolated from Paeonia lactiflora Pall. and Paeonia veitchii Lynch Compounds Type of inhibition Ki (μM) Ethyl gallate competitive 1252±410 Methyl gallae competitive 136±29 Benzoic acid competitive 117±20 p-Hydroxybenzoic acid competitive 840±10 Paeoniflorin noncompetitive 510±200
Ethyl gallate
0 1 2 3 4
-6 -4 -2 0 2 4 6
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖六、Ethyl gallate 之 Lineweaver-Burk plots ，■代表 Ethyl gallate 之 濃度為0 mM，◆代表Ethyl gallate 之濃度為 0.37 mM，▲代表 Ethyl gallate acid 之濃度為 0.75 mM
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Methyl gallate
0 1 2 3 4
-9 -6 -3 0 3 6
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖七、 Methyl gallate 之 Lineweaver-Burk plots ，◆代表Methyl gallate 之濃度為 0 mM，▲代表 Methyl gallate 之濃度為 0.13 mM，■代表 Methyl gallate 之濃度為 0.26 mM
Benzoic acid
0 2 4 6 8 10
-6 -3 0 3 6 9 12
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖八、Benzoic acid 之 Lineweaver-Burk plots， ◆代表Benzoic acid 之濃度為0μM，■代表 Benzoic acid 之濃度為 0.20 mM，▲代表 Benzoic acid 之濃度為 0.40 mM
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p- Hydroxybenzoic acid
0 1 2 3 4 5
-6 -4 -2 0 2 4 6 8
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖九、 p-Hydroxybenzoic acid 之 Lineweaver-Burk plots ，◆代表 p-Hydroxybenzoic acid 之濃度為 0 mM，■代表 p-Hydroxybenzoic acid 之濃度為0.50 mM，▲代表 p-Hyroxybenzoic acid 之濃度為 1.00 mM
Paeoniflorin
0 2 4 6 8 10 12
-5 0 5 10
1/[L-Dopa](mM)-1
1/V (O.D.475/min)-1
圖十、Paeoniflorin 之 Lineweaver-Burk plots，◆代表 Paeoniflorin 之 濃度為 0 mM，■代表 Paeoniflorin 之濃度為 0.50 mM，▲代表 Paeoniflorin 之濃度為 1.00 mM
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第五章 結 論
本論文之研究是針對我國傳統中藥補血藥及清熱涼血藥—白芍 和赤芍進行有效成分之分離及在化妝品之生物活性之試驗，其結果說 明如下 :
一、有效成分分離之結果
1. 從白芍分離 3 個有效成分 Gallic acid (1)、Ethyl gallale (2) 和 Methyl gallate (3) 。化合物 2 是首次從白芍根部分離得到。
2. 從赤芍分離 8 個有效成分 Gallic acid (1)、Ethyl gallate (2)、
Methyl gallate (3)、Benzoic acid (4)、p-Hydroxybenzoic acid (5)、
3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6) 、4, 3'-Di-O-methylellagic acid (7) 和 Paeoniflorin (8) 。其化合物 2、5、6 和 7 是首次從赤芍分離 得到。
二、生物活性試驗之結果
1. 具有掃除 DPPH 自由基之作用
白芍所得之化合物 Gallic acid (1)、Ethyl gallale (2)和 Methyl gallate (3)均具有掃除 DPPH 自由基之活性，且掃除 DPPH 自 由基作用皆優於抗氧化劑 L-ascorbic acid。
赤芍所得之化合物 Gallic acid (1)、Ethyl gallale (2)、Methyl
gallate (3)、3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6)和 4, 3'-Di-O- methylellagic acid (7)皆具有掃除 DPPH 自由基之活性，且掃除 自 由 基 能 力 皆 優 於 L-ascorbic acid ， 又 以 4, 3'-Di-O-methylellagic acid 掃除 DPPH 自由基能力最強。
2. 具有抑制酪氨酸酶之作用
白芍所得之化合物 Ethyl gallale (2) 和 Methyl gallate (3)具有 抑制酪氨酸酶之活性。
赤芍所得之化合物 Ethyl gallale (2)、Methyl gallate (3) 、 Benzoic acid (4)、p-Hydroxybenzoic acid (5) 和 Paeoniflorin (8) 具有抑制酪氨酸酶之活性。
3. 抑制酪氨酸酶之作用模式
由白芍及赤芍分離之有效成分 Ethyl gallate (2)、Methyl gallate (3)、Benzoic acid (4)和 p-Hydroxybenzoic acid (5)在抑制酪氨酸 酶皆屬競爭性的抑制作用，Paeoniflorin (8)抑制酪氨酸酶是屬 非競爭型抑制作用。
因此由上述之研究結果顯示白芍和赤芍的有效成分可應用於美 白及抗氧化化妝品中達到皮膚美白與抗氧化之作用。
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第六章 有效成分純化分離之實驗部分
第一節 材料與儀器
一. 溶劑：
1. 正己烷 (n-Hexane，景明化工，Taiwan)。
2. 正丁醇 (n-Butanol，景明化工，Taiwan)。
3. 二氯甲烷 (Dichloromethane，景明化工，Taiwan)。
4. 乙酸乙酯 (Ethyl Acetate，景明化工，Taiwan)。
5. 甲醇 (Methanol，景明化工，Taiwan)。
6. 乙醇 (Ethanol，景明化工，Taiwan)。
7. 二甲基亞楓 (Dimethyl sulfoxide，景明化工，Taiwan)。
8. 重氫甲醇 (CD3OD，景明化工，Taiwan)。
9. DMSO-d6 (景明化工，Taiwan)。
二. 生物活性分析之試藥：
1. L-tyrosine (from Calbiochem, CA, USA)。
2. L-Dopa、Tyrosinase、Kojic acid (from Sigma, Louis, USA)。
3. 2, 2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH, from Fluka , Milwaukee , USA)。
4. K2HPO4、KH2PO4、NaOH、CH3COOH、L-Ascorbic acid (from Wako, Osaka, Japan)。
5. α-Arbutin (from Kosfarm)。
三. 層析材料
1. Sephadex LH-20：Fine Chemicals AB Uppsala (25-100 μM, Pharmacia, Uppala, Sweden)。
2. 薄層色層層析片 (TLC plate):
(1)正相薄層色層層析片 (25 TLC aluminium sheets 20 x 20 cm silica gel 60 F254, Merck, Darmstadt, Germany)。
(2)逆相薄層色層層析片 (DC- Platten 5 x 10 cm RP-8 F254 S, Merck, Darmstadt, Germany)。
3. 低壓製備式碳-8 型逆相層析柱：
Lichroprep RP-8, 40~63μm, 25×310mm (Merck, Darmstadt, Germany)。
4. 製備式高效液相層析儀之製備式層析柱：
Phenyl Column : Shim-pack Prep-phenyl, 15μm, 25×250mm (Shimadzu Company, Kyoto, Japan)。
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四. 儀器設備
1. 粉碎機：(佑琦股份有限公司，彰化縣，台灣)。
2. 震盪混合機：Voetex-genie® 1 (Scientific Industries, New York , USA)。
3. 分光光度計：GENESYS 20 (Spectronic Instruments, Rochester , New York USA)。
4. TLC spots 之檢出：UV (短波 254nm，長波 365nm)，I2呈色試 劑檢測。
5. 迴轉真空濃縮機：BÜCHI R-200，真空幫浦：BÜCHI V-500 (BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)。
6. 過濾簿膜：(0.45μm, 47mm PVDF, MILLPORE)。
7. 製備式高效液相色層分析儀 (HPLC)：
(1)檢測器：SPD-10A 型 ，(2)系統控制器：SCL-10A 型，(3) 幫浦：LC-8A 型，(4)收集器：FCV-100B 型，(5)記錄器：C-R7A 型。(Shimadzu Company, Kyoto, Japan)。
8. 低壓液相層析幫浦：RP-SY-ICSC 型低壓幫浦。MFI company。
9. 熔點測定器 (Melting point)：
以 Fisher-Johns 及 Yanangimoto 熔點測定器測定熔點。
10. 紅外線光譜儀 (Infrared spectra, IR)：以 Hitachi 260-30 spectrophotometer 測定。
11. 紫外線光譜儀 (Ultraviolet spectra, UV)：
以 Hitachi U-200-20 spectrophotometer 測定。
12. 核磁共振光譜儀 (Nuclear Magnetic Resonance Spectra, NMR)：ARIAN UNITY INOVA-500。
13. 質譜儀 (Mass spectra, MS)：BRUKER APEX II。
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第二節 中藥材料及其抽取與純化分離
研究材料係購買自高雄縣廣德藥行，白芍之根部 5.0 公斤及赤芍 之根部5.0 公斤。
將 5.0 公斤的白芍絞成粉末於室溫下以乙醇浸泡連續抽取 5 次，
所得之抽取液減壓濃縮至乾後(305.0 g)，用n-Hexane和 95% MeOH (5% H2O)進行分配萃取(1:1)，n-Hexane 萃取層經減壓濃縮得到 34.0 g。另外 95% MeOH 層經減壓濃縮後得 267.0 g，再用EtOAc 和H2O 進行分配萃取(1:1)，收集EtOAc層經減壓濃縮得到 30.0 g。其H2O層 再和n-BuOH進行分配萃取(1:1)，收集n-BuOH層經減壓濃縮得到 109.0 g。另外H2O層經減壓濃縮後得 126.0 g。將n-Hexane層、EtOAc 層、n-BuOH層和H2O層之濃縮物進行抑制酪氨酸酶及掃除DPPH自由 基之生物活性試驗，結果在EtOAc層有明顯之生物活性，抑制酪氨酸 酶之抑制率為(IC50= 0.74 mg/ml)及掃除DPPH自由基之掃除率為 (SC50= 0.06 mg/ml)。將EtOAc層以分子篩(Sephadex LH-20)管柱層析 法，使用沖提溶媒為MeOH，並以矽膠薄層色層析片(TLC)來判斷結 果，在此共粗分成4 個Fraction (Fr. 1~4)。將Fr. 1~4 進行生物活性之 試驗，結果在Fr. 2 和Fr. 3 具有明顯的生物活性之作用。Fr. 2 以低壓 製備式碳-8 逆相層析法進行純化，沖提液為MeOH-H2O (1:1)，並利用
碳-8 逆相薄層析用玻璃片(C-8 TLC)檢測純化程度，經確認C-8 TLC片 上只剩一或二點後，再以製備級高效液相色層分析法以製備式苯基型 管柱進行純化分離，流動相為MeOH-H2O (30:70)，如此反覆純化分離 直至記錄器上只有單一波峰為止，再將收集液濃縮至乾，得到Gallic acid (1，2.1 g)及Ethyl gallate (2，13.1 mg)。Fr. 3 以低壓製備式碳-8 逆 相層析法進行純化，沖提液為MeOH-H2O (1:1)，並利用碳-8 逆相薄層 析用玻璃片(C-8 TLC)檢測純化程度，再以製備級高效液相色層分析 法以製備式苯基型管柱進行純化分離，流動相為MeOH-H2O (10:90)，
反覆純化分離直至記錄器上只有單一波峰為止，再將收集液濃縮至 乾，得到Methyl gallate (3，181.9 mg)。
將 5.0 公斤的赤芍絞成粉末於室溫下以乙醇浸泡連續抽取 5 次，
所得之抽取液減壓濃縮至乾後(1.40 kg)，用n-Hexane和 95% MeOH (5% H2O)進行分配萃取(1:1)，取 95% MeOH層經減壓濃縮後(1.25 kg)，再用EtOAc 和H2O 進行分配萃取(1:1)，收集EtOAc層經減壓濃 縮得到 60.0 g。其H2O層再和n-BuOH 進行分配萃取(1:1)，收集 n-BuOH層經減壓濃縮得到 278.0 g，H2O層經減壓濃縮後得 890.0g將
n-Hexane層、EtOAc層、n-BuOH層和H2O層之濃縮物進行抑制酪氨酸
酶及掃除DPPH自由基生物活性試驗，結果在EtOAc層有明顯之生物 活性，抑制酪氨酸酶之抑制率為(IC50= 0.63 mg/ml)及掃除DPPH自由
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基之清除率為(SC50= 0.04 mg/ml)。將EtOAc層以分子篩(Sephadex LH-20)管柱層析法，使用沖提溶媒為MeOH，且以矽膠薄層色層析片 (TLC)來判斷，在此共粗分 5 個Fraction (Fr. 1~5)。將Fr. 1~5 進行生物 活性之試驗，結果在Fr. 2~Fr. 5 具有明顯的生物活性作用。Fr. 2 以製 備式低壓碳-8 逆相層析法進行純化，並利用碳-8 逆相薄層析用玻璃 片(C-8 TLC)檢測純化程度，經確認C-8 TLC片上只剩一或二點後，再 以製備級高效液相色層分析法以製備式苯基型管柱進行純化分離，流 動相為MeOH-H2O (30:70)，如此反覆純化分離直至記錄器上只有單一 波峰為止，再將收集液濃縮至乾，得到Paeoniflorin (8，2.1 g)。Fr. 3 以低壓製備式碳-8 逆相層析法進行純化，沖提液為MeOH-H2O (1:1)，
再以製備級高效液相色層分析法以製備式苯基型管柱進行純化分 離，流動相為MeOH-H2O (10:90)，得到化合物Ethyl gallate (2，30.3 mg)、Benzoic acid (4，230.7 mg)與p-Hydroxybenzoic acid (5，106.0 mg)。Fr. 4 以低壓製備式碳-8 逆相層析法進行純化，沖提液為 MeOH-H2O (1:1)，並以製備級高效液相色層分析法以製備式苯基型管 柱進行純化分離，流動相為MeOH-H2O (10:90)，再將收集液濃縮至 乾，得到Methyl gallate (4，4.2 mg)，而Gallic acid (1，1.6 g)以流動相 為MeOH-H2O (30:70)純化分離得到。Fr. 5 以低壓製備式碳-8 逆相層 析法進行純化，沖提溶媒為MeOH-H2O (1:1)，在此部分得到 2 個化合
物 分 別 為 3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6 ， 9.3 mg) 和 4, 3'-Di-O-methylellagic acid (7，10.1 mg)。
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第三節 各化合物之物理及光譜數據
1. Gallic acid (1)之物化性質(49)
HO
HO
HO
COOH
Mol. Formula : C7H6O5 Mol. Wt : 170
M. P. : 235-237 ℃
UV λmax (MeOH) : 269, 216 nm
IR νmax (KBr) : 3495, 1685, 1560 cm-1
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ : 7.05 (2H, s, H-2, 6)
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ : 170.6 (C-7), 146.5 (C-3, 5), 139.7 (C-4), 122.1 (C-1), 110.5 (C-2, 6)
EI-MS m/z (rel. int. %) : 171 (12, [M+1]+ ), 170 (100,[M]+), 153 (87), 125 (30)
2. Ethyl gallate (2)之物化性質(50)
HO
HO
HO
COOC2H5
Mol. Formula : C9H10O5 Mol. Wt : 198
M. P. : 151-154 ℃
UV λmax (MeOH) : 274 nm
IR νmax (KBr) : 3443, 1700, 1610, 1525 cm-1
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ : 1.33 (3H, t, J=7.0 Hz, H-9), 4.27 (2H, q, J=7.0 Hz, H-8), 7.04 (2H, s, H-2, 6)
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ : 168.7 (C-7), 146.6 (C-3, 5), 139.8 (C-4), 121.9 (C-1), 110.1 (C-2, 6), 61.8 (C-8), 14.8 (C-9)
EI-MS m/ z (rel. int. %) : 199 (8, [M+1]+ ), 198 (46, [M]+), 170 (31), 153 (100), 125 (32)
50
3. Methyl gallate (3)之物化性質(51)
HO
HO
HO
COOCH3
Mol. Formula : C8H8O5 Mol. Wt : 184
M. P. : 201-203 ℃
UV λmax (MeOH) : 275, 219 nm IR νmax (KBr) : 3350, 1665, 1625 cm-1
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ : 3.80 (3H, s, OCH3), 7.05 (2H, s, H-2, 6)
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ : 169.2 (C-7), 146.5 (C-3, 5), 139.8 (C-4), 121.5 (C-1), 110.2 (C-2, 6), 52.4 (C-8)
EI-MS m/z (rel. int. %): 185 (8, [M+1]+), 184 (37, [M]+), 153 (46), 125 (12), 79 (11)
4. Benzoic acid (4)之物化性質(52)
COOH
Mol. Formula : C7H6O2 Mol. Wt : 122
M. P. : 120-121 ℃
UV λmax (MeOH) : 277.2 nm
IR νmax (KBr) : 1694, 1557, 1509 cm-1
1H-NMR (CD3OD, 500MHz) δ : 7.45 (2H, t, J=7.5 Hz, H-3, 5), 7.58 (1H, t, J=7.5 Hz, H-4), 8.01 (2H, d, J=7.5 Hz, H-2, 6)
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ : 170.0 (C-7), 134.2 (C-4), 132.2(C-2, 6), 130.9 (C-1), 129.6 (C-3, 5)
EI-MS m/z (rel. int. %): 123 (7, [M+1]+), 122 (83, [M]+), 105 (100), 77 (70)
52
5. p-Hydroxylbenoic acid (5)之物化性質(53)
COOH HO
Mol. Formula : C7H6O3 Mol. Wt : 138
M. P. : 255-256 ℃
UV λmax (MeOH) : 292.1, 285.0, 250.8 nm IR νmax (KBr) : 3541, 1689, 1553, 1508 cm-1
1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ : 6.83 (2H, d, J=7.0 Hz, H-3, 5), 7.87 (2H, d, J=7.0 Hz, H-2, 6)
13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ : 170.4 (C-7), 163.3 (C-4), 133.1 (C-2, 6), 122.7 (C-1), 116.2 (C-3, 5)
EI-MS m/z (rel. int. %): 139 (10, [M+1]+), 138 (63, [M]+), 121 (100), 93(42), 81(11), 73(21), 66(12)
6. 3, 3'-Di-O-methylellagic acid (6)之物化性質(54)
O O
OH
OCH3 H
H3CO
OH
H O
O
Mol. Formula : C16H10O8 Mol. Wt : 330
M. P. : 333-335 ℃
UV λmax (MeOH) : 246, 287, 354 nm IR νmax (KBr) : 3300, 2960, 2840 cm-1
1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ : 4.02 (6H, s, 3-OCH3, 3'-OCH3), 7.48 (2H, s, H-5, 5')
13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ : 158.9 (C-7, 7'), 152.8 (C-4, 4'), 141.4 (C-2, 2'), 140.5 (C-3, 3'), 112.2 (C-6, 6'), 111.7 (C-1, 1'), 111.6 (C-5, 5'), 61.1 (3, 3'-OCH3)
EI-MS m/z (rel. int. %) : 331 (15, [M+1]+), 330 (100, [M]+), 315 (60), 287 (17), 131 (7.5), 103 (50)
54
7. 4,3'-Di-O-methylellagic acid (7)之物化性質(55)
O O
OH H
H3CO
OH
H O
O OCH3
Mol. Formula : C16H10O8 Mol. Wt : 330
M. P. : 360-363 ℃
UV λmax (MeOH) : 221, 255 nm IR νmax (KBr) : 3420, 2900, 2840 cm-1
1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ : 3.93 (3H, s, 3'-OCH3), 4.02(3H, s, 4-OCH3), 7.40(1H, s, H-5), 7.44 (1H, s, H- 5')
13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ : 159.0 (C-7, 7'), 152.6 (C-4, 4'), 150.1(C-3), 141.8 (C-2, 2'), 140.2 (C-3'), 135.7 (C-6), 113.7 (C-6'), 112.9 (C-1'), 111.5 (C-5'), 106.7(C-5), 61.1 (3'-OCH3), 56.7 (4-OCH3)
EI-MS m/z (rel. int. %) : 331 (15, [M+1]+), 330 (97, [M]+), 315 (100), 287 (20), 203 (17), 103 (52)
