第三章 材料方法
第一節、 皿培式牛樟芝培養與成份分析
一、固態培養基配置
以每公升 39 公克的比例將馬鈴薯培養基(PDA，Potato Dextrose Agar, Sigma-Aldrich) 溶於二次水中，攪拌均勻再加熱至溶解。以 121℃高壓滅菌 20 分鐘，取出待溫度降至約 50℃再倒入約 25 mL 的培養基溶液於培養皿中，待冷凝固備用(Chang & Wang, 2005)。
二、 牛樟芝菌株培養
採集野生牛樟芝，將新鮮擔子菌(basidioms)切為片狀後，置入無菌水中，攪拌五分鐘 以獲得 basidiospore 上清液。將其培養在 MEA (2% malt extracts, 2% glucose, and 2%
Bacto agar)培養盤，25℃培養 15 天，為菌絲體。接續將菌株接種於 PDA (potato dextrose agar, Bacto) 培養皿，於 20-25℃的環境、避光培養，培養 4 個月後收集子實體(Chang &
Wang, 2008)，如圖 2-8。
圖 2- 8. 本實驗研究材料-皿培式牛樟芝
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貳、 樣品製備
一、 製備流程: 牛樟芝萃取物和其區分物
二、 牛樟芝(Antrodia cinnamomea)水萃粗萃物製備
本研究使用以洋菜膠為培養基質培養之牛樟芝子實體，實驗樣品皆由中國醫藥研究 所退休研究員周正仁老師所提供。將牛樟芝子實體磨成粉末後，樣品粉末與 80℃熱水 以 1:100 (w/w)的比例進行萃取 6 小時，萃取液經布氏漏斗過濾，剩餘粉末再加入同體 積 80℃熱水萃取 6 小時，過濾後水萃物以冷凍乾燥機(EYELA, FDU-1200)進行凍乾，
獲得之萃取物回溶於 DMSO 即得 Antrodia cinnamomea (ACW) stock solution 以進行後 續實驗。
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三、 牛樟芝水萃物 sub-fractions 製備
將牛樟芝粉末與 80℃熱水以 1:100 (w/w)的比例進行萃取 6 小時，萃取液經由布氏漏 斗過濾，剩餘粉末再加入同體積的 80℃熱水萃取 6 小時，將過濾後之萃取液加入 3 倍體 積 95 % 乙醇於 4℃中放置一晚，隔天將萃取液離心(9000 xg for 20 min)，沉澱物溶於 65
℃二次水後進行凍乾即為牛樟芝多醣(polysaccharide)粗萃物(PS)；可溶於乙醇之牛樟芝 水萃物經減壓濃縮後凍乾，即為牛樟芝非多醣(non-polysaccharide)粗萃物(NPS)，經凍乾 獲取之 PS、NPS 萃物回溶於 DMSO 得 PS、NPS 之 stock solution，再進行後續實驗。
四、 牛樟芝(Antrodia cinnamomea) 乙醇萃物製備
將牛樟芝子實體磨成粉末後，樣品粉末和 95%乙醇以 1:20 (w/v)的比例進行萃取 24 小時，萃取液經由布氏漏斗過濾，剩餘粉末再加入同體積的 95%乙醇萃取 24 小時，過 濾後乙醇萃物經減壓濃縮，獲得之萃取物回溶於 DMSO 即得 Antrodia cinnamomea ethanol (ACE) stock solution 以進行後續實驗。
參、 成分分析
一、 HPLC 分析牛樟芝乙醇萃物三萜類含量
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)原理是利用移動相通過固定相時，混 合物中的各成份在固定相和移動相之間的親和力差異，使其在管柱中滯留時間不同而可 分離，再經由偵測器的測定確定分析物的存在。若化合物與固定相親和力較強，則沖提 較慢(即滯留相對時間長)；當化合物與移動相親和力較強，則沖提較快(即滯留時間較短)，
因此依此原理可將樣品中成分進行初步分離、分析。此外，不同極性的固定相又可分為 正相層析法(Normal-Phase Chromatography)和逆相層析法(Reversed-Phase
Chromatography)，正相層析法的固定相為高極性，沖提液為低極性，逆相層析法則反之。
以 HPLC (Agilent 1100 series)分析牛樟芝乙醇萃物成分，首先設偵測波長，並使用 reversed phase column (Cosmosil 5C18-AR-II, 2504.6 mm, Kyoto, Japan)進行分析。取 9 mg 乙醇萃樣品加入 1 mL 50% methanol 溶解，通過 0.45 µm filter (Millpore-GX) 過濾後
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Standard compound Wavelength (nm) Retention time (min) Dehyrosulphurenic acid 243 82.121 15--acetyl-hydrosulphurenic acid 243 127.653
Dehydroeburicoic acid 243 139.453
Antcin K 254 24.992
methyl-antcin K 254 49.387
Antcin C 254 59.436
4,7-dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole 210 34.134
Eburicoic acid 210 140.774
Zhankuic acid C 270 63.107
Zhankuic acid B 270 83.007
Zhankuic acid A 270 91.687
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二、SEC 分析牛樟芝多醣體分子量分布
分子篩滲透層析儀(Size Exclusion Chromatography, SEC)或稱膠體滲透層析儀(Gel Permeation Chromatography, GPC)，是種快速測量高分子聚合物分子量或分子構型之技 術，適用於各種類高分子物質，包括蛋白質、天然高分子或是合成高分子物。
牛樟芝多醣體萃物(PS)經由 milli-Q water 配為濃度 1 mg/mL 之水溶液，以 0.22 μm filter (Millipore, USA)過濾後，使用分子篩滲透儀(size-exclusion chromatography , SEC) 分析多醣體的分子量分布。
以 Viscotek 儀器進行分析，SEC 訊號的偵測藉由 ViscoTek model TDA-3-1 relative viscometer (ViscoTek, USA)偵測，過程中以 0.5 mL/min 流速的 deionized water 為沖提液 (eluent)。校正曲線部分使用 authentic standard, Sodex P-82 series (Showa Denko America, USA)，其包含分子量(molecular weights) 78.8 × 104, 40.4 × 104, 21.2 × 104, 4.73 × 104, and 1.18 × 104 Da 之 polymaltotriose。並使用 TriSec software program 收集及分析 Viscotek data。
本實驗由衛生福利部中國醫藥研究所盧美光老師協助完成。
三、HPAEC 分析牛樟芝多醣類(PS)中單醣組成分
HPAEC-PAD (High pH anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection) 是利用醣類在高鹼性溶液中(pH 12-14)易於離子化(ionization)之特性，因此利用每一種單 醣分子有各自離子化的 pH 範圍，再由調整溶液的 pH，利用陰離子交換樹酯(Anion exchange column)來分離不同的單醣分子，再使用 pulse amperometric detector (PAD)來偵 測醣類因離子化而造成的氧化電位，判斷樣品單醣組成成分。
將 PS 進行酸水解，首先取 1 mg PS 加入 4.95 N trifluoroacetic acid (TFA)並於 80 ºC 熱水浴加熱 24 小時。將混合物冷卻，進行減壓濃縮乾燥後，再回溶 milli-Q water。水解 之 PS 樣品經由高效陰離子交換層析(high-performance anion-exchange
chromatography,HPAEC) pulsed amperometric detector (PAD-II) (Dionex BioLC, Sunnyvale, CA, USA)進行分析，HPAEC 儀器使用梯度 pump 及 anion-exchange column (Carbopac PA-10, 4.6 x 250 mm)。
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處理完成之 PS 樣品經由 autosampler (AS3500, SpectraSYSTEM)進行微量注射至 HPAEC 中，並由 PeakNet system (Dionex)進行資料收集和統整。
結果分析部分，以標準品比對分析出樣品中單醣的含量。單醣標準品包含:
myoinositol (99%)、sorbitol (98%)、fucose (99%)、galactose (99%)、glucose (99.5%)及 mannose (99%)，以上樣品接購自 Sigma。本實驗由衛生福利部中國醫藥研究所盧美光老 師協助完成。
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