第三章 材料方法
第二節、 細胞實驗( IN VITRO STUDY )
一、 細胞存活率分析(MTT assay)
原理: 3- (4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)為黃色化合物，
是一種接受氫離子的染劑，作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈，其在琥珀酸脫氫酶(SDH) 和細胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環開裂，生成藍紫色的 formazan 結晶，formazan 結 晶生成量與活細胞數目成正比，且此物質在 OD550有最大的吸光值，因此可藉由測 OD550
得知細胞還原 MTT 的能力(formazan 形成量)，作為細胞存活率的指標。
將 3T3-L1 細胞(3×104 cell/well)種於 96 well 中，等細胞貼附後，移除培養液，實驗組 加入不同濃度的 ACW、PS、NPS、ACE，培養 24 小時後，移除培養液，加入 100 L 1X MTT solution 放入 37℃培養箱中反應 2 小時，移除 MTT 試劑，加入 100 L isopropanol (含 0.04N HCl)，輕搖 30 分鐘以溶解藍紫色的 formazan 結晶，使用 ELISA reader 讀取 OD550，得出 OD 值後，以 control 組為 100%計算出各實驗組細胞存活率。
細胞存活率(%) = 實驗組吸光值(OD550) / 控制組吸光值(OD550) × 100%
由 MTT 實驗得知萃物對細胞沒有造成毒殺影響的劑量，進而使用無毒殺效果的劑量 繼續進行後續實驗。
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二、 3T3-L1 脂質堆積實驗模式建立
將 3T3-L1 細胞(3×104 cell/well)種於 24 well 中，細胞滿盤後進行分化處理(培養三天 使細胞滿盤，接著培養兩天使細胞過滿)，第五天後更換為分化Ⅰmedium 開始誘導脂肪 細胞分化為期四天，第九天更換為分化Ⅱ medium，為期六天，並於不同分化階段給予 牛樟芝萃物共培養，加入樣品時間點如圖 3-1 所示，於細胞分化第十天時進行油滴染色，
觀察細胞油滴生成情形。以 control 組(單純給予 DMI 共培養)為 100 %，計算出各模式中 抑制脂質堆積效果的百分比。
圖 3- 1. 3T3-L1 脂質堆積實驗加入萃物時間點指示圖
三、 油滴染色實驗 (Oil red O staining )
於細胞分化第十天時進行，以觀察各組細胞油滴生成情形。首先以 PBS 清洗 2 次，
加入 10% paraformaldehyde 固定細胞 30 分鐘，再次以 PBS 清洗 2 次，加入稀釋過之 oil red O solution 250 L/well 於室溫中反應 40 分鐘，移除染劑以 PBS wash 4~5 次，於倒立 式顯微鏡下進行觀察及照相。風乾後，加入 200 L/well isopropanol 以溶出染劑，進行 OD500檢測。以 control 組為 100%，計算出各實驗組脂質堆積百分比。
四、 3T3-L1 脂質堆積實驗
由實驗模式中選擇 D 模式進行正式實驗。並將牛樟芝水萃物再分為 PS 及 NPS sub-fraction，以探討 ACW、PS 及 NPS 對 3T3-L1 油滴生成的影響。
牛樟芝萃物共培養
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首先將 3T3-L1 細胞(3×104 cell/well)種於 24 well 中，培養三天使細胞滿盤，接著培養 兩天使細胞過滿，第五天後更換為分化Ⅰmedium (內含 10% FBS、0.5 mM IBMX、0.2 M DEX、10g/mL insulin)，同時實驗組給予不同濃度 ACW、PS 及 NPS，開始誘導脂肪 細胞分化為期四天，第九天更換為分化Ⅱmedium (內含 10% FBS、10g/mL insulin)實驗 組持續給予牛樟芝萃物，為期六天。並以 rosiglitazone 做為正對照組，GW9662 及前驅 脂肪細胞做為負對照組。
於細胞分化第十天時進行油滴染色，計算出各實驗組脂質堆積百分比，以 control 組 (單純給予 DMI 共培養)當 100 %。
五、模式建立: 3T3-L1 細胞加入分化劑後 p-ERK 表現之 time course study
首先參考相關文獻以建立模式(Kwak et al., 2012; Lii et al., 2012; Prusty et al., 2002)，
並於 time course study 觀察於 3T3-L1 細胞中加入分化劑後於 15 分鐘、30 分鐘、1 小時、
1.5 小時及 2 小時後細胞內 p-ERK 的表現量。
將 3T3-L1 細胞種於 6 cm dish (1×106 cell/ dish)，培養 2 天使細胞過滿後，移除培養液，
加入分化Ⅰmedium，並分別於刺激 15 分鐘、30 分鐘、1 小時、1.5 小時及 2 小時後以 lysis buffer 收取細胞之蛋白質，再經由 western blot 分析不同時間點 p-ERK 的表現量。
六、 牛樟芝水萃暨其區分物對 p-ERK 表現之影響
將 3T3-L1 細胞種於 6 cm dish (1×106 cell/ dish)，培養 2 天使細胞過滿後，移除培養 液，加入分化Ⅰmedium，實驗組同時包含不同濃度 ACW(100 µg/mL、200 µg/mL)、PS (100 µg/mL、200 µg/mL)、NPS (50 µ g/mL、100 µg/mL)，培養 15 分鐘後，以 lysis buffer 收 取細胞之蛋白質。
a. 細胞蛋白質抽取
將 3T3-L1 細胞種於 6 cm dish (1×106 cell/well)，滿盤後，移除培養液，加入含 ACW、
PS 或 NPS 之分化Ⅰmedium 培養 15 分鐘，移除培養液，以 PBS (1X)沖洗 4~5 次，每個
31 標準品使用胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，以序列稀釋做出標準曲線，之 後將樣品所測得之吸光值代入標準曲線，再回乘稀釋倍數後即可算出樣品中蛋白質濃度。
再以 ddH2O 將各樣品蛋白質稀釋為 1 mg/mL 之濃度完成定量。
c. 配置 10% SDS-polyacrylaminde gel
首先製備 10% 分離膠體(Separation gel)及 4% 焦集膠體(Stacking gel)，比例如表 3-3，
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d. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 變性電泳 將膠片組合架於電泳槽，取電泳緩衝液加入正負極槽內。
完成定量之蛋白質以 4:1 的比例與 5X 的 sample buffer 混勻，接著以 100℃加熱 15 分鐘，使蛋白質變性，冷卻後將 sample loading 到 10% SDS-polyacrylaminde gel 的齒槽 中，以 70 ~100V 電壓、3 小時進行電泳。
e. 西方墨點法(Western-blot) (1) 試劑配置
Lysis buffer：
10X Lysis buffer 200 µ L
PMSF (100mM) 20 µ L
H2O 1780µ L
總體積 2 mL A 液：
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) solution B 液(分離膠體緩衝液)：
Tris (Tris Base, 1.5 M) 90.8 gm
TEMED 1.8 mL
溶於 300 mL 水中，調整 pH 至 8.8，加水定量至 500 mL。
C 液(焦集膠體緩衝液)：
Tris (Tris Base, 1.5 M) 6.0 gm
TEMED 0.4 mL
溶於 40 mL 水中，調整 pH 至 6.8，加水定量至 100 mL。
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後依序在轉印三明治夾負極放上 3M 濾紙、SDS-PAGE、PVDF 膜及 3M 濾紙(在放置過 程中需注意夾層不能有氣泡)，最後將上蓋蓋好，整個三明治卡夾裝好後放入轉印槽中，
於槽中填滿轉印緩衝液，以 400 mA 轉印 1 小時。
轉印完後取出 PVDF 膜，用明膠-NET (另加 0.1% BSA (10 mg/mL)溶液)於 4℃中 blocking overnight，隔天取出後加入分別加入 p-ERK (goat anti rabbit monoclonal antibody，
以明膠-NET 稀釋 2000 倍)或 t-ERK (goat anti rabbit monoclonal antibody，以明膠-NET 稀 釋 2000 倍)或 β-actin (goat anti mouse monoclonal antibody，以明膠-NET 稀釋 2000 倍)一 級抗體，於 4℃反應 overnight。隔天取出以 1X PBST 清洗三次，每次 15 分鐘，加入二 級抗體(p-ERK 和 t-ERK 為 goat anti-rabbet antibody，β-actin 為 goat anti-mouse antibody，
分別以明膠-NET 稀釋 5000 倍)於室溫反應一小時，再以 1X PBST 清洗三次，每次 15 分鐘後，浸潤 ECL 溶液反應，以照相系統(Bio-Rad, USA)拍攝影像。
七、牛樟芝水萃物對3T3-L1 分化初期 mitotic clonal expansion 的影響
3T3-L1 細胞種於 24 well 中(3×104 cell/well)，培養 2 天使細胞過滿後，移除培養液，
加入含不同濃度 ACW、PS 或 NPS 之分化Ⅰmedium，並於培養 24h、48h 時，以 trypsin 切下細胞，並以 trypan-blue 染色後經血球計數器進行細胞計數，觀察各組細胞數的變 化。
另以 MTT assay 評估在脂肪細胞分化過程中同時給予牛樟芝萃物培養 10 天後，對各 組細胞存活率的影響。將 3T3-L1 細胞種於 24 well 中(3×104 cell/well)，培養 2 天使細胞 過滿後，移除培養液，加入含不同濃度 ACW、PS 或 NPS 之分化Ⅰmedium，之後更換 含相同濃度牛樟芝水萃物之分化П medium，培養六天(每三天換一次 medium)，於第十 天加入 MTT 試劑，反應 2h 後以 0.4% HCl/isopropanol 溶出紫色結晶，檢測 OD550。
八、牛樟芝水萃物影響脂質生成(adipogenesis)相關基因 mRNA 之表現
將 3T3-L1 細胞種於 6 cm dish (1×106 cell/well)，培養 2 天使細胞過滿後，移除培養液，
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加入含不同濃度 ACW、PS 或 NPS 之分化Ⅰmedium，培養 4 天時抽取 RNA。
結果分析部份，各組基因表現量降低百分比為跟 DMI 組(單純給予分化劑培養)做比 較之結果，即以 DMI 組為 100% 時求出其他組別之百分比，因此計算上將以「實驗組 倍數/ DMI 組倍數×100」，再計算出實驗組各基因表現降低之百分比，以得出各組基因表 現降低之差異。
a 細胞 RNA 抽取
將 3T3-L1 細胞種於 6 cm dish (1×106 cell/well)，加入分化Ⅰmedium(含不同濃度樣品) 處理後，於第 4 天進行 RNA 抽取。首先，將 dish 中之培養液移除，以 PBS 清洗兩次 後，加入 1 mL TRIzol reagent，搖晃 dish 使細胞溶解，抽入 1.5mL 離心管中冰至-80℃
備用，或直接進行 RNA 抽取。
將加入 TRIzol reagent 之細胞，每管加入 200 L choloform，上下搖勻 15~30 秒使液 體呈現乳白色，室溫靜置 3 分鐘後，以 4℃ 12000 rpm 離心 15 分鐘，離心後會分為三 層，取最上層約 500 L (透明澄清液)於新的離心管中，加入同體積 isopropanol，輕搖混 勻後於冰上靜置 10 分鐘，於 4℃ 12000 rpm 離心 15 分鐘，移除上清液，加入 1 mL 70%
EtOH / DEPC-H2O 洗淨管壁，以 4℃ 12000 rpm 離心 5 分鐘，移除上清液，風乾沉澱物 約 1 分鐘，加入 15 L DEPC-H2O 回溶，以 OD260 / OD280來判定 RNA 純度；並以 OD260
來計算 RNA 濃度以進行定量。
b 將 mRNA 反轉錄為 cDNA
將上述抽取好的 RNA 定量為濃度 5000 ng/mL，經 70℃加熱 5 分鐘，4℃ 5 分鐘後，
至於冰上備用。
於離心管中加入 MgCl2 2.4 L、GoScript 5X reaction buffer 4 L、PCR Nucleotide Mix 1
L、inhibitor 0.5 L、oligo(dT) primer 0.5 L、random primer 0.5 L、nuclease-free water 8.1 L、GoScript RT 1 L，總體積為 18 L，再加入上述處理過之 RNA 2 L，於 8-strip PCR tube 總體積為 20 L，放入傳統式 PCR 儀器中以 25℃反應 5 分鐘；42℃反應 30
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分鐘；再以 85℃反應 5 分鐘終止反應，cDNA 保存於-80℃備用。
c. 定量聚合酶連鎖反應(Quantitative-Polymerase Chain Reaction, Q-PCR)
各取 1 L 反轉錄完成之 cDNA 於 8-strip PCR tube 中，每管包含 0.8 L formard primer、
0.8 L reverase primer, 10 L reagent(SYBR○R premix Ex TaqΠ(2X conc.，內含 TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+、Tli RNaseH、SYBR○R GreenⅠ)、0.4 L ROX reference dye Π (50X conc.)，以滅菌水調整體積為 20 L，放入定量聚合酶連鎖反應儀(Bio-Rad, USA) 進行表 3-4 之步驟反應。並以 GAPDH 作為 mRNA 表現的內部控制組。
Gene forward primer 5’ to 3’ C/EBP CCTGCGGGGTTGTTGATG TCACTTTAATGCTCGAAACGGAAA 89 C/EBP AACTGAGACTCTTCACTAACG ACTACTACATACACCCTTGGA 120 PPAR
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肆、 研究材料
一、 藥品與試劑 (一) 細胞培養
1. DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium High Glucose 1X) (Gibco 21068 , USA) 2. Bovine serum (Gibco 10091-148 , USA)
3. Fetal bovine serum (Gibco 10437-028, USA) 4. Antibotic-Antimycotic (Gibco 15240, USA) 5. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco 25200, USA)
6. PBS (Phosphate Buffered Saline, 10X) stock solution
NaCl (Sodium chloride) (Sigma S7653, USA) 80.0g NaH2PO4 (Disodium hydrogen phosphate) (Sigma S8282, USA) 14.4g KH2PO4 (Potassium phosphate monobasic) (Sigma 1551139, USA) 2.4g KCl (Potassium chloride) (Sigma P9333, USA) 2.0g
溶於 800 mL 二次水混勻後，以 4N NaOH 及 4N HCl 調 pH 值至 7.0~7.3 之間，再定 量為 1000 mL，即為 10X PBS stock solution。
使用前先以二次水 10 被稀釋為 1X PBS 後，經高壓滅菌斧(121℃，30 分鐘)滅菌後備 用。
7. DMSO (Dimethyl suLfogxide)(Sigma #D8418, USA)
8. IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine) (Sigma SI-I7018, USA) 9. DEX (Dexamethasone ) (Sigma D4902, USA)
10. Insulin (Sigma SI-I5523, USA)
(二) 細胞存活率測定
1. 0.4% Tyrpan blue solution (Sigma T8154, USA)
2. MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)(Sigma M5655 ,
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USA)
將 MTT 溶於 1X PBS 中，濃度為 5mg/mL 之 MTT stock solution，以 25mm / 0.2m Supor 無菌針頭過濾夾過濾後避光儲存於-20℃保存，使用前 10X 稀釋。
3. 0.04N HCL Isopropanol
將 12N HCL 以 isopropanol (Sigma 9084-03, USA) 做 300X 稀釋，即為 1 mL HCL 加 入 299 mL isopropanol，混勻後備用。
(三) 脂質堆積實驗
1. Paraformaldehyde (SigmaP6148, USA) 2. Oil red O (Sigma O0624, USA)
Oil red O 以 isopropanol (Sigma 9084-03, USA)配為濃度 0.5%之 stock solution，於室溫 中保存。使用前再將 stock solution 和 PBS 以 3:2 的比例稀釋，以 25mm / 0.2m Supor 無菌針頭過濾夾過濾後使用。
3. Isopropanol (Sigma 9084-03, USA) 4. PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X)
(四) 西方墨點法(Western-blot)
1. Bovine serum albumin, BSA(Sigma A2153, USA) 2. PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X)
3. Lysis buffer (Cell Signaling, USA)
4. PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride) (Sigma P7626, USA) 5. Protein assay reagent (Bio-Rad 500-0006EDU, USA)
6. 一級抗體
(1) Mouse phospho-ERK1/2 (Novus Biologicals NBP1-19869-0, USA) (2) Mouse total-ERK1/2 (Novus Biologicals NBP1-19924-0, USA)
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(2) Anti-β-actin Mouse pAb (Novus Biologicals NB600-501, USA) 7. 二級抗體
(1) Goat anti mouse IgG alkaline phosphatease (Sigma A3562, USA) (2) Goat anti rabbit IgG alkaline phosphatease (Sigma A3687, USA) 8. Glycine (Sigma G8898, USA)
9. SDS (Sodium dodecyl sulfate) (Sigma L3771, USA)
10. TEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine) (Sigma T9281, USA) 11. Tris (Tris (hydroxymethyl)-aminomethane) (Sigma 252859, USA)
12. Tween 20 (Sigma P1379, USA)
13. APS (Ammonium persulfate) (Sigma A3678, USA)
14. 40% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) solution (Bio-rad 161-0146, USA) 以二次水稀釋為 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) solution 後使用。
15. NaCl (Sigma S7653, USA)
16. Isopropanol (Sigma 9084-03, USA) 17. KH2PO4 (Sigma 1551139, USA) 18. Methanol (Sigma 34860, USA)
(五) 定量聚合酶連鎖反應(Quantitative-Polymerase Chain Reaction,Q-PCR) 1. Trizol reagent (Invitrogen 15596-018, USA)
2. Chlorofrom (Merk 102445, Germany) 3. Isopropanol (Sigma 9084-03, USA)
4. DEPC treated water (Invitrogen 4387937, USA) 5. 70% EtOH / DEPC-H2O
6. 反轉錄試劑套組 GoScripTM Reverase Transcription System (Promega corporation,
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RA5000, USA)
7. SYBR○R premix Ex Taq Π (2X conc.,內含 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+,Tli RNaseH, SYBR○R GreenⅠ) (TaKaRa #RR820Q, Japan )
8. ROX Reference Dye Π (50X conc.) (TaKaRa #RR820Q, Japan)
(六) 化學純品
1. Rosiglitazone (cayman 71740, USA) 2. GW9662 (cayman 70785, USA) 3. PD98059 (cayman 10006726, USA)
二、 儀器設備及耗材 (一) 儀器設備
1. 細胞計數器(hemacytometer) (Sigma, USA) 2. 倒立式顯微鏡(Nikon, Japan)
3. 離心機(Hettich)
4. 無菌操作台(LIAN SHEN)
5. 冷凍乾燥機(EYELA, FDU-1200) 6. 自動吸管(autopipet)
7. 二氧化碳培養箱(Thermo Co., USA) 8. ELISA reader (Biotek Instruments, USA) 9. 定量聚合酶連鎖反應怡 iQ5 (Bio-Rad, USA) 10. 電泳槽(Bio-Rad, USA)
11. 影像分析系統 CheneDoc XRS+ 配合 Image Lab 影像分析軟體(Bio-Rad, USA) 12. -80℃冰箱(Thermo, USA)
13. 顯微鏡照相系統 (Nikon, Japan)
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(二) 拋棄式無菌耗材 1. 10 cm dish、6 cm dish
2. 96 well、24 well 細胞培養盤
3. 離心管(15 mL、50 mL)、微量離心管(0.5 mL 、1.5 mL、2 mL) 4. 冷凍小管(2 mL)
5. 拋棄式血清移液管(5 mL、10 mL) 6. 8-strip PCR tube
7. 0.22 µM PVDF filter
伍、 統計分析
使用 SPSS 19 版進行統計分析，實驗結果皆以 mean±SD 表示，以單因子變異數分 析(one way ANOVA)及事後檢定 LSD 作為判定各組和刺激組間的差異。
以*表示有達到顯著差異的水準，*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。
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