討論

壹、牛樟芝成分分析

牛樟芝為台灣特有的蕈類，野生牛樟芝生長緩慢且取得不易，因此，近年來逐漸有 多種研究發展以人工培養方式獲得牛樟芝菌絲體及子實體，野生子實體生長時間較長，

相較之下，人工短時間的培養往往能累積的成分就較少。牛樟芝中所包含大量的三萜類，

其中又簡單可分為 lanostane-type 及 erogstane-type，菌體體中主要以 lanostane-type 為主，

經由營養生長轉換為生殖生長而形成子實體時，才逐漸轉換為 erogstane-type (陳，2013)，

而在子實體更包含了 63%的三萜類(Geethangili & Tzeng, 2011)，在本研究中發現，皿培 式牛樟芝乙醇萃物中至少包含十種三萜類，包含 antcin K、

4,7-dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole、antcin C、zhankuic acid C、dehydrosulphurenic acid、zhankuic acid A、zhankuic acid B、15-α-acetyl-dehydrosulphurenic acid、

dehydroeburicoic acid、eburicoic acid，其中含量最高的為屬於 lanostane-type 的

dehydrosulphurenic acid (佔 32.691±0.459 µg/mg ACE)及 dehydroeburicoic acid (佔 49.465±

1.303 µg/mg ACE) (表 4-1)，成分中以出現子實體特有的 erogstane-type 三萜類，由此可 知我們已成功培養出牛樟芝子實體。

多醣體被認為與免疫調節有高度關聯性，過去研究中已發現植物中萃取之多醣體多 數具有抗發炎及抗腫瘤效用(Wang, Zha, & Feng, 2010)，其中，蕈類中的多醣體更備受學 者重視，在牛樟芝菌絲體分離出的多醣類，目前已被證實具有提高免疫力及抗腫瘤的功 效(Chen et al., 2008; Mizuno, 1996)，抗發炎上，亦有研究提出菌絲體所含之多醣類可調 控發炎因子的生成(Liu et al., 2007)。本研究中，以分子篩層析儀分析多醣萃物中多醣體 分子量的組成分，先前文獻提出不同分子量的多醣類具有不同的生理活性，在 Chen, Lu, Cheng, and Wang (2005)的研究中指出分子量約在 304~325 kDa 和 2693~2876 kDa 之多醣 體具有抗血管新生的效用，除此之外，分子量介於 500 kDa~2000 kDa 之多醣體具有抗

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腫瘤的效用，且分子量越大效果越佳(Wasser, 2002)，但於本篇研究中，分析結果顯示多 醣粗萃物的組成中主要是以分子量小於 14 kDa 的醣類為主(圖 4-2)。除了分子量分布上，

多醣萃物中單醣的組成也是影響生物活性的重要因子之一，本研究中含量最高的

galactose (佔 327.68±0.64 µmol/g PS)，次高的為 fucose (佔 46.24±0.81 µmol/g PS) (表 4-2)，

一般而言隨著使用菌株及培養方式的不同，單醣成分的比例也會有所差異，大致上以 galactose 和 glucose 最常為主要單醣(Lee et al., 2002)，在本研究 PS 樣品中也是以 galactose 為主要單醣成分。

貳、牛樟芝於細胞實驗中 anti-adipogenic 效用

肥胖的發生與眾多慢性疾病的形成有著密切的關係，當過度的能量攝取將導致脂肪 組織增生和肥大，肥大的脂肪組織會開始分泌化學趨化物質而誘發巨噬細胞浸潤到脂肪 組織，導致組織處在慢性發炎的環境，長期下來增加了慢性疾病發生的風險。因此，減 緩肥胖的發生成為現今大眾關注的議題之一，除了飲食控制及運動外，市面上也有多種 減肥藥物，但於使用後往往伴隨不適的副作用，進而促進學界尋找具有抗肥胖效用的天 然物。牛樟芝在過去已廣泛被學界探討及研究，也證實了牛樟芝確實具有抗癌、抗發炎、

抗氧化、護肝及調節免疫等生理功效，於本研究中選用皿培式牛樟芝，並用於探討其與 先前文獻不同的生理活性效用，於細胞實驗發現，牛樟芝乙醇萃、水萃暨其區分物均可 顯著抑制 3T3-L1 脂肪細胞油滴的生成，此外，在不同時間點給予萃物的模式中(圖 4-4)，

也可發現 ACE 和 ACW 主要是藉由影響前驅脂肪細胞化的過程進而降低油滴的生成。

另更進一步探討水萃暨其區分物抑制脂質堆積的效用(圖 4-7)，研究結果發現 PS 和 NPS 均可顯著降低脂肪細胞油滴生成，其中又以 NPS 在抑制脂質堆積的效果最佳，於 濃度 100 µg/mL 的濃度下可降低 35.8%油滴的生成。

於上述實驗結果中，我們觀察到牛樟芝水萃暨其區分物得給予可顯著抑制脂肪細胞 油滴的生成，因此，以下將進一步探討水萃物在不同時間點與肥胖相關機轉(圖 5-1)的影 響:

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圖 5- 1 細胞分化相關機轉表現時間流程圖(Newell et al., 2006)

首先，在 p-ERK 部分，先前文獻已證實 ERK 磷酸化蛋白質的表現為脂肪細胞早期 分化指標之一(Prusty et al., 2002)，過去文獻指出分化早期若 ERK 蛋白質磷酸化表現被 抑制，確實會影響到下游 PPARγ、C/EBPα、aP2 基因的表現(Gwon, Ahn, Jung, Moon, & Ha, 2013)，本研究實驗結果顯示，ACW 在濃度低於 100 µg/mL 下未顯著抑制 DMI 刺激後 ERK 蛋白質磷酸化的表現。PS 於濃度 100 µg/mL、200 µg/mL 下，具顯著降低 ERK 蛋 白質磷酸化的表現。NPS 則沒顯著抑制 DMI 刺激後 ERK 蛋白質磷酸化的表現(圖 4-10)。

因此，由此實驗結果中我們可推測 PS 抑制脂肪細胞油滴形成的機轉之一為調控早期 ERK 蛋白質磷酸化的表現而影響後續分化相關因子的表現；而 ACW 及 NPS 在影響 adipogenesis 過程中，可能並非以調控 p-ERK 表現為主要途徑。

Mitotic clonal expansion 已被證實為 adipogenesis 過程所需，於 Tang et al. (2003b)

的研究中指出 MCE 進行的過程會受到 MAPK pathway 及 cdk2 蛋白質表現量的影響，於 MAPK pathway 中，研究發現給予 MEK inhibitor (U0126)後，影響 cell-cycle maker protein cylcin A 及 cdk2 的表現及後續 adipogenic gene (PPARγ、C/EBPα)的活化，進而抑制脂肪 細胞油滴的生成與堆積。除此之外，Tang et al.(2003b)也藉由抑制 cdk2 蛋白質表現的實

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驗，證實抑制 MCE 過程中 G1-S checkpoint 確實會影響到後續脂肪細胞分化的過程。在 本篇研究結果中發現 ACW 及 NPS 的給予有顯著降低 DMI 誘發細胞增生的現象(圖 4-11)。

Adipogenic gene 中，我們發現 ACW 可降低 C/EBPα、PPARγ、FAS、aP2 mRNA 表 現；PS 降低 PPARγ 及 aP2 mRNA 表現；NPS 則可降低 C/EBPβ, C/EBPα, PPARγ, FAS 及 aP2 mRNA 的表現量(圖 4-12)。

因此，經上述相關機轉探討後，可知 ACW 及 NPS 的給予抑制 DMI 所誘發的細胞 增生現象，於 Tang et al.(2013)的研究中也發現 MCE 的抑制機轉可能與 cell-cycle maker protein 的表現受到抑制有關，進而延緩細胞在 24 小時內從 G0/G1 phase 進入 G2/M phase 的過程，最終確實會影響到後續 adipogenic gene (如 C/EBPα、PPARγ、FAS、aP2)的活 化(Tang et al., 2003b)。我們目前僅以細胞計數實驗觀察到 ACW 及 NPS 具減緩 DMI 誘 發之細胞增生現象，仍未更深入以 flow cytometry 再次確認其是否會影響到分化初期之 細胞週期或以 western blot 確認細胞週期相關蛋白質的表現，因此未來仍有待確認 ACW 和 NPS 對分化早期 MCE 過程中確切的影響，以便更深入了解降低脂肪細胞油滴的形成 的相關機制。PS 的部分，於目前研究結果中發現在給予 PS 伴隨分化劑培養下，於 24 小時時，有減緩 3T3-L1 細胞的增生的現象，但於 48 小時下，細胞數則與 DMI 組未有 明顯差異，推測可能與 PS 雖可抑制 ERK 蛋白質在分化早期磷酸化，但仍未完全中斷 adipogenesis 相關機轉有關，進而後續 adipogenic gene 中我們目前也僅觀察到 PPARγ 及 aP2 gene 的表現受到抑制，最終雖有抑制油滴的生成的現象，但抑制率明顯低於 NPS。

細胞實驗部分，整體而言，牛樟芝非多醣類萃物具有最好的 anti-adipogenic 效用。

在相關機制上，NPS 可減緩 MCE 的過程，並抑制 adipogeic gene 的指標中至少 5 種分化 指標的表現，因而最終抑制脂質堆積的效用也明顯優於其他組別(表 5-1)。

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表 5- 1 綜合討論牛樟芝萃物於細胞實驗中 anti-adipogenic 功效

Table 5.1 General Discussion of Antrodia cinnamomea extracts anti-adipogenic effect in 3T3-L1 cells.

Mitotic clonal expansion - NS

Adipogenic

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周後兩組小鼠體重未有十分明顯的差異(圖 4-15)，進而開始探討 C57BL/6 品系的差別，

在 Wang & Liao(2012)的研究中提到高脂飲食誘發小鼠肥胖的模式會因小鼠品系的差異 而有不同的結果，其認為在高脂誘發小鼠肥胖的模式中，C57BL/6J 小鼠為較佳的選擇，

在國家實驗動物中心的介紹中也提到 C57BL/6N 及 C57BL/6J 的差別，C57BL/6J 次品系 的小鼠因 Nnt(Nicotinamide nucleotide transhydrogenase)基因刪除(deletion)，而影響到 C57BL/6J 小鼠葡萄糖代謝的生理平衡及胰島素的分泌，因此在相同實驗模式中 組(p<0.05)，也反應高脂飲食的高熱量，其中，HF+ACW 組略低於 HF 組，但未達顯著 差異(表 4-4)。

飲食設計上，牛樟芝水萃物粉末主要以取代營養素方式添加在飼料中，以維持 HF 組和 HF+ACW 組三大營養素的比例是相當的，此外實驗中我們觀察到添加 ACW 的組 別其攝食量未明顯低於 HF 組，由此可知我們目前給予的牛樟芝劑量並不會造成小鼠因

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牛樟芝的特殊味道，而影響其食慾的情況出現(表 4-4、圖 4-24)。

2. 小鼠體重變化

小鼠體重部分，可以發現給予高脂飲食一週後，體重開始明顯高於正常飲食組，且

隨著飼養時間的增加，高脂組體重也逐漸與正常飲食組差距加大，此現象與先前文獻相 符(Wang & Liao, 2012; Winzell & Ahrén, 2004)。本實驗在經過第 12 週後，control 組體重 增加了 10.2g (與初始體重相比增加了 52.2%)，HF 組則增加了 21.8g (與初始體重相比增 護等效用(Geethangili & Tzeng, 2011)，但仍很少研究探討其抗肥胖的效用，在本研究中，

我們從細胞實驗發現牛樟芝藉由抑制脂肪前驅細胞分化為成熟脂肪細胞的過程，最終觀

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4. 牛樟芝對高脂飲食誘發代謝異常的影響

脂肪組織與體內的代謝有著高度關聯性，adipocyte 分泌之 adipokines 是 obesity 引 發 insulin resistance 之重要因素，正常脂肪細胞會藉由游離脂肪酸、glycerol、adipokine (例:leptin)及促發炎 cytokine 的釋放以調節代謝，而肥胖者，因分泌失調而導致代謝異常，

增加胰島素阻抗及慢性疾病發生的機率。

因此，我們後續探討牛樟芝對 obesity-related blood marker 的影響:

(1) Insulin & glucose level

首先，我們分析各別餵食三種飲食 12 週後 C57BL/6J 小鼠血清 insulin 及 glucose 濃 度的變化，insulin 部分，我們發現 HF+ACW 組 insulin 濃度明顯低於 HF 組(p<0.01)(表 4-6、圖 4-31)，血糖部分 HF+ACW 組 glucose level 與 control 組和 HF 組均沒有顯著差異 (表 4-6、圖 4-30)，牛樟芝多醣成分中，目前探討最多的為其包含的 β-glucan，β-glucan 在先前研究中發現具有降低血糖及減緩胰島素阻抗的功效(Chen & Raymond, 2008;

Zheng, Shen, Wang, & Zhao, 2013)，但 β-glucan 不只存在於牛樟芝當中，大多真菌類和燕 麥中也包含此多醣體成分(Chen & Raymond, 2008)，在 Zheng et al. (2013)的研究中使用 高脂伴隨高果糖飲食誘發 ICR 小鼠胰島素阻抗及代謝異常，結果發現補充燕麥 β-glucan (500 mg/kg BW)可抑制胰島素阻抗的發生及有助於血糖的調控；在血糖調控部分，早在 Lo, Tsai, Wasser, Yang, and Huang (2006)的研究中發現糖尿病患者給予 β-glucan(來

Tremella mesenterica)有助於協助其血糖的調控，但其相關調控血糖的機制仍不明確，仍

Tremella mesenterica)有助於協助其血糖的調控，但其相關調控血糖的機制仍不明確，仍