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初探牛樟芝萃取物的抗肥胖效用

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Academic year: 2021

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(1)國立臺灣師範大學人類發展與家庭學系 碩士論文. 初探牛樟芝萃取物的抗肥胖效用 Preliminary study of anti-obesity potential of Antrodia cinnamomea. 指導教授:蔡帛蓉 博士 (Po-Jung Tsai, Ph.D.) 研 究 生:汪芝翎 (Chih-Ling Wang). 中華民國 103 年 6 月.

(2) 謝誌 轉眼間兩年的碩班生涯已接近尾聲,在這兩年中,真的很感謝一路上給予我需多幫助 和關懷的你們,讓我能順利完成這本論文。 回想剛考上碩班時,真的很幸運能跟著蔡帛蓉老師學習,一路上老師給予我諸多幫助, 讓毫無實驗基礎背景的我學到了許多,也不吝嗇地給予我諸多的建議和鼓勵,除了學術方 面,也不時地提醒我們做人處事的道理,真的很感謝老師的指導,讓我了解到研究的精隨 和意義;感謝溫柔的謝佳倩老師,不吝惜的撥空指導我動物實驗的技巧,也給予我論文撰 寫上的提點;感謝黃青真老師讓我能到貴實驗室學習並撥空參加論文口試指導及給予專業 的評論,老師的評論總是精闢、關鍵,讓我能有更全面性的思考,未來也要請老師多多指 教了!此外,也很感謝周正仁老師慷慨地提供我牛樟芝樣品,讓我的研究能順利完成;感 謝盧美光老師及張秉鈞學姊協助我進行成分分析相關實驗;感謝蔡宗憲醫生和陳威宇醫生 在病理切片上的協助;細想兩年的時光真的受到許多老師的幫忙,由衷的感謝各位老師給 予的協助,沒有您們我的論文無法如此順利的完成,謝謝! 接著,也很感謝一路上陪我走過的所有人: 感謝實驗室的成員一路上給予我的協助和照顧,感謝文程學長,從頭開始細心的教導 我實驗的方法與技巧,不吝嗇的幫助我解決實驗上的大小事務,研究中遇到困難時也總是 給予我諸多建議和協助,真的很開心能跟您學習,相信學長過不久就能順利拿到博士學位! 感謝貼心的雅欣學姊給予我不少的幫助,並細心的和我討論實驗,真的很開心能認識妳; 也感謝鳴綺、鈴媗、雅菱、渝珊、浩庭及虹均在實驗上大小事務的協助和陪伴,有你們的 幫忙讓我可以專心的做實驗,希望妳們未來實驗都能非常順利!此外感謝碩二娘子軍夥伴 們一路上互相的扶持,很開心有妳們這些好戰友的陪伴,相信我們都能順利拿到碩士學位, 加油!另外,也感謝夢婷學姊在動物實驗及各種事務上的不吝嗇的幫忙,感謝汶龍、偉倢 在動物飼料配製上的協助,讓我能順利進行動物實驗。 感謝求學過程中犧牲的小黑們,因為有祢們的貢獻,我才能有今天的成果,真的很感 謝祢們,希望祢們再另一個世界過的更快樂、安穩。 最後想感謝我的家人們,總是給我無限的鼓勵和溫暖,讓我可以專心在學業上。也謝 謝好友婷怡不時的陪我聊天寒暄,雯郁、侑容、嘉慈陪我吃大餐和逛街,真的很開心有妳 們這些好朋友的陪伴。 學海無涯,兩年的研究生涯真的相當充實,也謝謝老天爺帶給我許多貴人,讓我一路 上能克服重重難關繼續走下去,在此由衷的感謝所有幫助和關懷我的人們。. 謹以此論文分享給親愛的您們 芝翎 2014/7/14.

(3) 中文摘要 肥胖(obesity)為一種熱量攝取不平衡所致的慢性代謝疾病,導致肥胖的原因有很多, 像是基因、代謝、飲食、體能活動、社會文化環境等因素。肥胖對身體健康具有嚴重的危 害,如增加心血管疾病、睡眠窒息症、糖尿病、癌症等發生的風險,因此開發安全且具協 助體重控制效用之天然物質成為重要的議題。 牛樟芝( Antrodia cinnamomea)在傳統治療上常被用於治療食物及藥物中毒、腹瀉、腹痛、 高血壓及肝癌,然而目前仍不清楚牛樟芝改善肥胖發生的潛力,因此本研究以皿培式牛樟 芝為實驗材料,欲探討牛樟芝的抗肥胖(anti-adipogenic 及 anti-obesity)功效。 研究材料使用牛樟芝子實體粉末,經蒸餾水或酒精萃取,於成分分析中,牛樟芝乙醇 萃物至少包含十種三萜類,包括 antcin K、4,7-dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole、antcin C、zhankuic acid C,、dehydrosulphurenic acid、zhankuic acid A、zhankuic acid B、 15-α-acetyl-dehydrosulphurenic acid、dehydroeburicoic acid 及 eburicoic acid。牛樟芝水萃物 的部分,多醣萃物組成中主要以分子量小於 14 kDa 的醣類為主;單醣成分以 galactose 含 量最多,其次為 fucose。 細胞實驗中以 3T3-L1 分析不同分化期給予牛樟芝乙醇(ACE)或水萃物(ACW)下,對脂 肪細胞脂質堆積的影響,結果發現乙醇和水萃物均有降低脂質堆積的效用。其中牛樟芝水 萃暨其區分物(牛樟芝多醣類萃物(PS)及牛樟芝非多醣類萃物(NPS))具顯著 anti-adipogenic 效用。於 anti-adipogenic 功效上,研究發現 ACW 及 NPS 可藉由抑制分化期初期 mitotic clonal expansion,進而降低 adipogenesis 過程中脂肪細胞分化相關指標 C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ、 FAS 及 aP2 mRNA 表現;PS 則可藉由降低 DMI 誘發分化初期 ERK 蛋白質磷酸化的表現, 影響後續 PPARγ 及 aP2 mRNA 表現,最終降低脂肪細胞油滴的生成。 進而以動物實驗探討 ACW 抗肥胖效用,使用 5 週齡大 C57BL/6J 公鼠給予高脂飲食 (HFD)誘發肥胖之實驗模式,評估同時投與高熱量飼料與牛樟芝水萃物飼養 12 週後對小鼠 的影響。目前的實驗結果顯示給予 HFD 飲食顯著增加小鼠體重及出現體內代謝的異常, 再給予 ACW 伴隨 HFD 飲食下,顯著降低小鼠血清中胰島素(insulin)、瘦體素(leptin)與 HMOA-IR 指數,並改善高脂飲食所致的肝損傷(降低 AST 指數及肝臟中 TG 和 TC 濃度), 也發現 ACW 的給予經由減緩高脂飲食所致的腹部體脂(腎週脂肪、腸系膜脂肪)堆積,顯 著降低小鼠體重增加幅度。 總和以上結果,牛樟芝水萃暨其區分物在細胞實驗中具有 anti-adipogenic 效用,於動物 實驗中也具有減緩高脂飲食誘發肥胖發生的潛力。我們的實驗結果顯示牛樟芝萃物在未來 可應用於協助體重控制。. 關鍵詞:牛樟芝(Antrodia cinnamomea)、3T3-L1、脂質生成作用(adipogensis)、高脂飲食、抗 肥胖.

(4) Abstract Obesity is a chronic metabolic disease resulting from an imbalance between energy intake and energy output. It is caused by the interaction of multiple genetic and environmental factors. Health hazards associated with obesity are serious and include heart disease, sleep apnea, diabetes, and cancer. Thus, the development of agents that may offer safer and more effective alternatives for weight management is needed. Antrodia cinnamomea, known as “niu-chang-chih”, has been traditionally used for the treatment of food and drug intoxication, diarrhea, abdominal pain, hypertension, and liver cancer. However, little is known about anti-obesity potential of A. cinnamomea. In this study, we evaluate the anti-adipogenic and anti-obesity activities of extracts of A. cinnamomea cultured on artificial agar plates. The aqueous and ethanolic extracts were prepared form dried fruiting bodies of A. cinnamomea. There are 10 triterpenoids found in ethanolic extracts of A. cinnamomea, including antcin K, 4,7-dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole, antcin C, zhankuic acid C, dehydrosulphurenic acid, zhankuic acid A, zhankuic acid B, 15-α-acetyl-dehydrosulphurenic acid, dehydroeburicoic acid, and eburicoic acid. The results showed that a low molecular weight polysaccharide (less than 14kDa) was predominantly present in the polysaccharide fractions of A. camphorata. In addition, galactose and fucose were major neutral sugars in polysaccharide fractions of A. cinnamomea. We investigated effects of ethanolic (ACE) and aqueous extract (ACW) of A. cinnamomea on adipogenesis of murine 3T3-L1 cells at different differentiation stages. Our results showed that both extracts inhibited lipid deposits. ACW, polysaccharides (PS) and non-polysaccharides fractios (NPS) of ACW exhibited significant anti-adipogenic effect. The anti-adipogenic function of ACW is through inhibition of mitotic clonal expansion in the early phase of adipogenesis. During adipocyte differentiation period, ACW and NPS significantly decreased key adipocyte differentiation-associated markers, PPARγ, C/EBPβ, C/EBPα, FAS, and aP2 expression. PS suppressed DMI-induced ERK phosphoylation and mRNA expressions of PPARγ and aP2. ACW was assayed for alleviative effects on obesity. An obesity animal model was established in 5-wk-old C57BL/6J male mice fed with high-fat diet (HFD) for 12 weeks. The HFD mice exhibited significant body weight gain and impaired glucose metabolism. Mice with ACW co-administration (HFD+ACW group) showed significantly lower serum insulin, leptin and HOMA-IR value and ameliorated liver damage (AST values and hepatic cholesterol and triglyceride levels). HF+ACW group had significantly lower body weight gain due to decrease HFD-induced visceral fat accumulation (perirenal adipose tissue, and mesenteric adipose tissue). In conclusion, A. cinnamomea aqueous extract and its fractions had anti-adipogenic effect in vitro. Furthermore, A. cinnamomea aqueous extract showed the anti-obesity potential in vivo. Our results suggested that A. cinnamomea extract may be applied to body weight control in future. Keywords: Antrodia cinnamomea, 3T3-L1, adipogensis, high-fat diet, anti-obesity.

(5) 目錄 第一章 緒論............................................................................................................................................... 1 一、研究動機與目的............................................................................................................................. 1 第二章 文獻探討 ....................................................................................................................................... 2 第一節 肥胖與脂肪細胞生成 ............................................................................................................... 2 第二節 肥胖機轉及相關因子 ............................................................................................................... 5 一、 Adipogenesis ............................................................................................................................ 8 1.p-ERK ...................................................................................................................................... 9 2.PPARγ .................................................................................................................................... 10 3.C/EBP family ......................................................................................................................... 11 二、Lipogenesis ............................................................................................................................... 12 第三節 高脂飲食誘發小鼠肥胖模式 ................................................................................................. 14 第四節 牛樟芝的生理活性 ................................................................................................................. 15 一、 牛樟芝簡介 ............................................................................................................................. 15 二、 牛樟芝成分 ............................................................................................................................. 15 三、 牛樟芝萃物的生物活性 ......................................................................................................... 17 四、 牛樟芝安全性 ......................................................................................................................... 19 第三章 材料方法 ..................................................................................................................................... 20 第一節、皿培式牛樟芝培養與成份分析 ........................................................................................... 20 壹、 皿培式牛樟芝培養方法 ......................................................................................................... 20 一、固態培養基配置 .............................................................................................................. 20 二、牛樟芝菌株培養 .............................................................................................................. 20 貳、 樣品製備 ................................................................................................................................ 21 一、製備流程: 牛樟芝萃取物和其區分物 ............................................................................ 21 二、牛樟芝(Antrodia cinnamomea)水萃粗萃物製備 ............................................................. 21 三、牛樟芝水萃物 sub-fractions 製備 .................................................................................... 22 四、牛樟芝(Antrodia cinnamomea) 乙醇萃物製備 ............................................................... 22 參、 成分分析 ................................................................................................................................ 22 一、HPLC 分析牛樟芝乙醇萃物三萜類含量 ........................................................................ 22 二、SEC 分析牛樟芝多醣體分子量分布 ............................................................................... 24 三、HPAEC 分析牛樟芝多醣類(PS)中單醣組成分 .............................................................. 24 第二節、細胞實驗(IN VITRO STUDY) .................................................................................................. 26 壹、實驗架構 .................................................................................................................................. 26 貳、 細胞培養 ................................................................................................................................ 26 一、3T3-L1 前脂肪細胞 ......................................................................................................... 26 二、細胞解凍及活化 .............................................................................................................. 27 i.

(6) 三、細胞繼代 .......................................................................................................................... 27 四、 細胞冷凍保存 ................................................................................................................ 27 五、細胞計數 .......................................................................................................................... 27 六、3T3-L1 分化處理 ............................................................................................................ 28 參、 細胞實驗方法 ........................................................................................................................ 28 一、 細胞存活率分析(MTT assay) ........................................................................................ 28 二、 3T3-L1 脂質堆積實驗模式建立 .................................................................................... 29 三、油滴染色實驗 (Oil red O staining )................................................................................. 29 四、3T3-L1 脂質堆積實驗 ..................................................................................................... 29 五、模式建立: 3T3-L1 細胞加入分化劑後 p-ERK 表現之 time course study ....................... 30 六、牛樟芝水萃暨其區分物對 p-ERK 表現之影響 ............................................................... 30 七、牛樟芝水萃物對 3T3-L1 分化初期 mitotic clonal expansion 的影響 ............................. 34 八、牛樟芝水萃物影響脂質生成(adipogenesis)相關基因 mRNA 之表現 ............................ 34 肆、 研究材料 ................................................................................................................................ 37 一、藥品與試劑 ....................................................................................................................... 37 (一) 細胞培養 ....................................................................................................................... 37 (二) 細胞存活率測定 ........................................................................................................... 37 (三) 脂質堆積實驗 ............................................................................................................... 38 (四) 西方墨點法(Western-blot) ............................................................................................ 38 (五) 定量聚合酶連鎖反應(Quantitative-Polymerase Chain Reaction,Q-PCR).................... 39 (六) 化學純品 ....................................................................................................................... 40 二、儀器設備及耗材 ............................................................................................................... 40 (一) 儀器設備 ....................................................................................................................... 40 (二) 拋棄式無菌耗材 ........................................................................................................... 41 伍、 統計分析 ..................................................................................................................................... 41 第三節 動物實驗(IN VIVO STUDY)....................................................................................................... 42 壹、 實驗一:預實驗 ........................................................................................................................ 42 一、 模式建立:預實驗架構 .................................................................................................... 42 二、實驗動物飼養 ................................................................................................................... 42 三、飼料 ................................................................................................................................... 43 (一)牛樟芝凍乾粉末 ............................................................................................................. 43 (二)動物飼料配製 ................................................................................................................. 43 (三)動物犧牲與樣品收集 ..................................................................................................... 44 (四)血脂分析 ......................................................................................................................... 45 (五)肝臟脂質萃取與分析 ..................................................................................................... 46 (六)組織切片染色 ................................................................................................................. 47 (七) 肝臟與脂肪組織 mRNA 萃取分析 .............................................................................. 48 貳、實驗二 ...................................................................................................................................... 50 一、 模式建立:實驗架構 ........................................................................................................ 50 ii.

(7) 二、實驗動物飼養 ................................................................................................................... 50 三、飼料 ................................................................................................................................... 51 (一)牛樟芝凍乾粉末 ............................................................................................................. 51 (二)動物飼料組成與配製 ..................................................................................................... 51 四、動物犧牲與樣品收集 ....................................................................................................... 52 五、血清及血脂分析 ............................................................................................................... 52 (一)血清葡萄糖(gluscose)分析 ............................................................................................. 52 (二)血清膽固醇(total cholesterol)分析 ................................................................................. 52 (三)血清三酸甘油酯(triglyceride)分析 ................................................................................ 53 (四)血清游離脂肪酸(NEFA)分析 ........................................................................................ 53 (五)胰島素(insulin)分析 ....................................................................................................... 53 (六)Adiponectin 分析 ............................................................................................................ 54 (七)Leptin 分析 ..................................................................................................................... 54 (八) Aspartate aminotransferase(AST)分析 ........................................................................... 55 (九) Alanine aminotransferase(ALT)分析 .............................................................................. 56 參、統計分析 .................................................................................................................................. 57 第四章 結果............................................................................................................................................. 58 第一節 皿培式牛樟芝成分分析 ......................................................................................................... 58 壹、牛樟芝乙醇萃物成分分析 ....................................................................................................... 58 貳、 牛樟芝水萃物組成分析.......................................................................................................... 61 一、牛樟芝水萃物萃取率 ....................................................................................................... 61 二、多醣體組成分析 ............................................................................................................... 61 三、 牛樟芝多醣粗萃物之單醣組成分析 .............................................................................. 63 第二節 細胞實驗結果 ......................................................................................................................... 64 壹、牛樟芝萃物對細胞存活率的影響............................................................................................ 64 貳、牛樟芝萃物抑制脂質堆積能力評估........................................................................................ 66 一、模式建立:不同分化期給予牛樟芝萃物影響脂質堆積之功效 ....................................... 66 二、牛樟芝水萃及其區分物抑制脂質堆積功效評估 ............................................................ 69 參、牛樟芝萃物對分化初期 p-ERK 表現的影響 .......................................................................... 72 一、模式建立: 3T3-L1 細胞 p-ERK 表現之 Time course study ............................................. 72 二、牛樟芝水萃暨其區分物對 p-ERK 表現之影響 ............................................................... 73 肆、牛樟芝水萃物對 3T3-L1 分化初期 mitotic clonal expansion 的影響 .................................... 74 伍、牛樟芝水萃暨其區分物對 3T3-L1 細胞基因表現之影響 ..................................................... 76 第三節、動物實驗............................................................................................................................... 78 壹、 實驗一:預實驗結果 ................................................................................................................ 78 一、牛樟芝對小鼠體重變化、攝食量及攝食效率的影響 .................................................... 78 二、牛樟芝對小鼠組織絕對重量、相對重量的影響 ............................................................ 80 三、小鼠副睪脂肪組織切片與 H&E 染色 ............................................................................. 82 四、牛樟芝對小鼠血清三酸甘油酯及膽固醇含量影響 ........................................................ 83 iii.

(8) 五、牛樟芝對小鼠肝臟三酸甘油酯含量影響 ........................................................................ 83 六、牛樟芝對小鼠肝臟及脂肪組織內 adipogenic gene 表現的影響 .................................... 84 (一)分析肝臟組織中 adipogenic gene 表現量...................................................................... 84 (二)分析副睪脂肪組織中 adipogenic gene 表現量 .............................................................. 85 貳、實驗二結果 ............................................................................................................................... 86 一、牛樟芝對小鼠體重變化及生長情形 ................................................................................ 86 二、攝食量、攝食效率及能量效率........................................................................................ 86 三、牛樟芝小鼠組織絕對重量及相對重量的影響 ................................................................ 89 四、脂肪組織切片分析 ........................................................................................................... 93 五、血清生化數值含量測定 ................................................................................................... 94 1.血清葡萄糖濃度分析 ......................................................................................................... 95 2.血清胰島素含量測定 ......................................................................................................... 95 3.牛樟芝對胰島素抗性的影響 ............................................................................................. 96 4.血清三酸甘油酯及膽固醇含量測定 ................................................................................. 97 5.血清游離脂肪酸含量測定 ................................................................................................. 97 6.血清 leptin 濃度測定.......................................................................................................... 98 7.血清 adiponectin 濃度測定 ................................................................................................ 98 8.血清 ALT、AST 濃度分析 ................................................................................................ 99 六、肝脂分析與組織切片 ..................................................................................................... 100 第五章 討論與結論 ............................................................................................................................... 102 第一節、討論 .................................................................................................................................... 102 壹、牛樟芝成分分析 ..................................................................................................................... 102 貳、牛樟芝於細胞實驗中 ANTI-ADIPOGENIC 效用 ...................................................................... 103 參、牛樟芝水萃物對高脂飲食誘發 C57BL/6J 肥胖的影響 ........................................................ 106 1.小鼠攝食情形、攝食效率及能量效率 ............................................................................... 107 2.小鼠體重變化 ...................................................................................................................... 108 3.牛樟芝的抗肥胖效用 .......................................................................................................... 108 4.牛樟芝對高脂飲食誘發代謝異常的影響 ........................................................................... 109 (1)Insulin & glucose level .................................................................................................... 109 (2)Triglyceride, totoal cholesterol & no-ester fatty acid level .............................................. 110 (3)Leptin & adiponectin concentrations ............................................................................... 111 5.肝功能指標與脂肪肝 .......................................................................................................... 112 肆、綜合討論與未來改善方向 ......................................................................................................... 113 第二節、結論 .................................................................................................................................... 116 第六章 參考文獻 ................................................................................................................................... 118 附錄 ........................................................................................................................................................ 127. iv.

(9) 圖目錄 圖 2- 1. 亞洲人(台灣人)及白種人(Caucasians)身體質量指數與所有原因死亡率相對風險(relative risks, RR)之比較(Wen et al., 2009) .................................................................................................... 2 圖 2- 2. 脂肪組織擴張(expansion)引發巨噬細胞浸潤,導致發炎反應及胰島素阻抗 (McArdle, Finucane, Connaughton, McMorrow, & Roche, 2013) ....................................................................... 3 圖 2- 3. 數種天然化合物作用於脂肪細胞生成或脂質合成的各階段,具有抑制脂肪細胞生成和脂質 堆積的作用(Rayalam et al., 2008) ..................................................................................................... 5 圖 2- 4. 脂肪細胞的形成(Overview of adipocyte formation) (Henry et al., 2012) .................................... 6 圖 2- 5. 3 種分化劑結構圖 A. DEX; B. IBMX; C. insulin......................................................................... 7 圖 2- 6. 調控 3T3-L1 細胞分化過程中之轉錄因子(從 mitotic clonal expansion 至 terminal differentiation) (Moreno-Navarrete & Fernández-Real, 2012) ........................................................... 9 圖 2- 7. 3T3-L1 細胞分化過程中各基因表現時期(Ntambi & Kim, 2000) ............................................. 12 圖 2- 8. 本實驗研究材料-皿培式牛樟芝 ................................................................................................ 20 圖 3- 1. 3T3-L1 脂質堆積實驗加入萃物時間點指示圖…………………………………………………29 圖 4- 1 牛樟芝三萜類標準品及乙醇萃物 HPLC 分析圖譜…………………………………………….59 圖 4- 2. 牛樟芝多醣體粗萃物之分子篩色層分析圖譜.......................................................................... 62 圖 4- 3. ACE、ACW 、PS 及 NPS 對 3T3-L1 細胞毒殺之影響 ........................................................... 65 圖 4- 4. ACE 及 ACW 在 3T3-L1 細胞不同分化期共培養下脂質堆積之抑制效用 ............................. 67 圖 4- 5. ACE 於不同分化期添加時對 3T3-L1 細胞脂質堆積之影響 .................................................... 68 圖 4- 6. ACW 於不同分化期添加時對 3T3-L1 細胞脂質堆積之影響................................................... 68 圖 4- 7. ACW、PS 及 NPS 在 3T3-L1 分化期共培養下脂質堆積之抑制效用 ..................................... 70 圖 4- 8. ACW、PS 及 NPS 對 3T3-L1 細胞脂質堆積之影響................................................................. 71 圖 4- 9.分化劑刺激 3T3-L1 細胞後 p-ERK 表現量之 time course study ............................................... 72 圖 4- 10. ACW、PS 及 NPS 對 3T3-L1 分化初期 p-ERK 表現的影響.................................................. 73 圖 4- 11. ACW、PS 及 NPS 對 DMI 誘發 3T3-L1 細胞增生的影響 ..................................................... 75 圖 4- 12. ACW、PS 及 NPS 於 3T3-L1 分化第十天時對細胞存活率的影響。 ................................... 75 圖 4- 13. ACW、PS 及 NPS 對 3T3-L1 細胞 C/EBP β、C/EBPα、PPARγ、FAS 及 aP2 mRNA 表現量 之影響 .............................................................................................................................................. 77 圖 4- 14. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週攝取量變化 ............................................................................ 79 圖 4- 15. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週之生長曲線 ............................................................................ 79 圖 4- 16. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週後肝臟、腎臟組織絕對及相對重量 .................................... 80 圖 4- 17. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週後副睪脂肪及腎週脂肪組織絕對及相對重量 ..................... 81 圖 4- 18. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週後總脂肪組織相對重量 ........................................................ 81 圖 4- 19. C57BL/6N 小鼠餵食各組飲食 10 週後蘇木精-伊紅染色之副睪脂肪組織切片 ................... 82 圖 4- 20. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週後血清中膽固醇及三酸甘油酯含量變化............................. 83 圖 4- 21. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週後肝臟中三酸甘油酯含量變化 ............................................ 83 圖 4- 22. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週後肝臟 PPARγ、C/EBPα、aP2、FAS mRNA 表現量的影響 .......................................................................................................................................................... 84 v.

(10) 圖 4- 23. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週後副睪脂肪組織 PPARγ、C/EBPα、aP2、FAS mRNA 表現 量的影響 .......................................................................................................................................... 85 圖 4- 24. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週攝取量變化 ............................................................................. 87 圖 4- 25. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週之生長曲線 ............................................................................. 88 圖 4- 26. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週後肝臟、腎臟、脾臟絕對重量及相對重量 .......................... 90 圖 4- 27. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週後副睪脂肪、腎週脂肪及腸系膜脂肪組織絕對及相對重量 .......................................................................................................................................................... 91 圖 4- 28. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週後總肪組織相對重量 ............................................................. 92 圖 4- 29. C57BL/6J 小鼠餵食各組飲食 12 週後蘇木精-伊紅染色之副睪脂肪組織切片 ..................... 93 圖 4- 30. C57BL/6J 小鼠飼養 12 週後血清葡萄糖濃度變化 ................................................................. 95 圖 4- 31. C57BL/6J 小鼠飼養 12 週後血清胰島素濃度變化 ................................................................. 95 圖 4- 32.牛樟芝伴隨高脂飲食餵食 12 週對小 HOMA-IR index 的影響............................................... 96 圖 4- 33. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週後血清中膽固醇及三酸甘油酯含量變化 .............................. 97 圖 4- 34. C57BL/6J 小鼠飼養 12 週後血清游離脂肪酸濃度變化 ......................................................... 97 圖 4- 35. C57BL/6J 小鼠飼養 12 週後血清 leptin 濃度 .......................................................................... 98 圖 4- 36. C57BL/6J 小鼠飼養 12 週後血清 adiponectin 濃度變化 ......................................................... 98 圖 4- 37. C57BL/6J 小鼠飼養 12 週後血清麩丙酮酸轉胺脢麩(ALT)、草醋酸轉胺脢(AST)濃度 ...... 99 圖 4- 38.牛樟芝對 C57BL/6J 小鼠肝臟中三酸甘油酯及膽固醇濃度的影響 ...................................... 100 圖 4- 39. C57BL/6J 小鼠餵食各組飲食 12 週後蘇木精-伊紅染色之肝臟組織切片........................... 101 圖 5- 1. 細胞分化相關機轉表現時間流程圖(Newell et al., 2006)…………………………………….104 圖 5- 2. C57BL/6 小鼠餵食高脂飲食 6、8、12、16、22 週時體重(A)、副睪脂肪組織(B)及 HOMA-IR index (第六週)的變化(Strissel et al., 2010) ................................................................................... 114 圖 5- 3. 總結 ACW、PS、NPS 抑制 3T3-L1 細胞脂質堆積的途徑................................................... 116. vi.

(11) 表目錄 表 2- 1. 脂肪細胞分化相關之 mRNA 及 gene 表現 (Park et al., 2012) .................................................. 8 表 2- 2. 脂質代謝相關之 mRNA 及 gene 表現 (Park et al., 2012) ........................................................ 13 表 3- 1. HPLC 移動相梯度沖提條件……………………………………………………………………..23 表 3- 2. 牛樟芝各標準品吸收波長及滯留時間 ..................................................................................... 23 表 3- 3. 10%分離膠體及 4%焦集膠體溶液配方 ..................................................................................... 31 表 3- 4. Q-PCR 反應步驟 ........................................................................................................................ 36 表 3- 5. primer 序列 ................................................................................................................................. 36 表 3- 6. 預實驗飼料組成 ......................................................................................................................... 44 表 3- 7.牛樟芝給予劑量換算表 ............................................................................................................... 44 表 3- 8. 實驗飼料組成............................................................................................................................. 51 表 4- 1. 牛樟芝乙醇萃物中各三萜類含量………………………………………………………………60 表 4- 2. 牛樟芝多醣粗萃物經 TFA 水解後其單醣組成分析 ................................................................ 63 表 4- 3. C57BL/6N 小鼠餵食飼料 10 週體重增加、平均攝食量及攝食效率 ...................................... 78 表 4- 4. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週之初始體重、最終體重、平均攝食量、能量攝取、攝食效率 及能量效率 ...................................................................................................................................... 87 表 4- 5. C57BL/6J 小鼠餵食飼料 12 週後組織絕對及相對重量 ........................................................... 89 表 4- 6. C57BL/6J 小鼠飼養 12 週後血清生化數值濃度分析 ............................................................... 94 表 4- 7. 牛樟芝餵食 C57BL/6J 小鼠 12 週後對肝脂濃度的影響 ....................................................... 100 表 5- 1. 綜合討論牛樟芝萃物於細胞實驗中 anti-adipogenic 功效……………………………………106 表 5- 2. 飲食誘發小鼠代謝性疾病(metabolic disease)比較 (Gajda et al., 2007) ................................ 111 表 5- 3. 總結牛樟芝水萃物對高脂飲食誘發肥胖相關指標的影響 .................................................... 117. vii.

(12) 第一章 緒論 一、研究動機與目的 近年來肥胖問題逐漸受到大眾的重視,肥胖不僅影響外觀,更是健康的隱形殺手。 醫學上已證實諸多的慢性病或文明病,例如糖尿病、高血壓、心血管疾病等,都與肥胖 有著密切的關係。因應肥胖問題的出現,各種千奇百怪的減肥方法隨之而出,像是吃肉 減肥法、喝茶減肥法、抽脂、吃減肥藥等。就醫學營養的觀點來看,上述減肥法往往有 著諸多的副作用,例如:吃肉減肥法會增加腎臟的負擔,至於減肥藥的部分,目前市面 上的減肥藥多作用在抑制食慾或腸道吸收,常見副作用包含失眠、焦慮、腸胃脹氣、直 腸漏油等,另外也有作用於中樞神經類之減肥藥,例如 Sibutramine(Reductil® ;諾美婷 ® ),其主要機轉為抑制中樞 5-HT (serotonin)、NE (norepinephrine)、DA (dopamine) 的 再回收,進而抑制下視丘食慾中樞,但有口乾、心悸、失眠、便秘等副作用。就因減肥 藥物在使用後常伴隨著各種不適的副作用,促使近年來學界著重於探討天然物中抗肥胖 的成分及功效,在許多研究中也發現天然食物中存在著多種植化素(phytochemicals)確實 具有抗肥胖的效用(Rayalam, Della-Fera, & Baile, 2008),因而被視為能減緩肥胖及相關疾 病發生的風險。雖然目前仍認為飲食控制和運動為健康的體重控制方法,但若無法從這 兩方面著手,則尋找能夠誘導脂肪細胞凋亡(apoptosis)、抑制脂肪細胞形成(adipogenesis) 或促進脂肪細胞脂解(lipolysis)作用的天然成分(natural products)和植化素(Park & Kim, 2011; Rayalam et al., 2008)用以改善肥胖所引起的相關疾病也不失為一種好的方法。 因此本研究選用皿培式牛樟芝為實驗材料,目前有數種培養牛樟芝的方式,例如段 木培養、液態發酵培養菌絲體、固態培養等。我們建立以洋菜膠為培養基質,培養牛樟 芝子實體,並經 HPLC 方法確認其組成分。雖然已知牛樟芝具多種生理活性,例如:抗 癌、抗發炎、抗氧化及護肝等功效,但是關於牛樟芝在抑制脂肪細胞分化及抗肥胖的相 關研究很少,所以我們決定我們使用皿培式牛樟芝,並藉由細胞模式(in vitro)和動物實 驗(in vivo)初探牛樟芝於抗肥胖上之潛力。 1.

(13) 第二章 文獻探討 第一節 肥胖與脂肪細胞生成 全球約有 30%的成年人有過重或肥胖的問題(Henry et al., 2012),目前已知導致肥胖 (obesity)的原因有很多,像是基因、代謝、飲食、體能活動、社會文化環境等因素,均 可能影響肥胖的發生率(Afridi & Khan, 2004)。研究發現肥胖者,易促使代謝性(metabolic) 及慢性(chronic)疾病發生,如糖尿病、高血壓、心血管疾病等(Singla, Bardoloi, & Parkash, 2010),甚至可能對情緒造成影響,例如:過重者可能較易受到排擠進而有自卑、自尊心 受損的情形,長久下來易產生消沉、抑鬱等現象(胡 等, 1993)。 在解剖學上,又可將肥胖者依體脂肪(body fat)分布位置做分類,主要分成內臟型 (visceral, abdominal)及皮下型(peripheral, subcutaneous)。研究中發現內臟型相較於皮下型 而言更易導致代謝疾病的發生(Gonzalez-Castejon & Rodriguez-Casado, 2011)。 除此之外,肥胖還可依其發生的病因區分為: primary 或 secondary。Primary 肥胖主要 是因能量不平衡(長期正能量攝取)造成,而 secondary 則主要屬於醫源性(iatrogenic),也 就是因藥物的使用或疾病而導致肥胖的發生(Aronne, 2002)。目前在肥胖定義上,臨床以 身體質量指數(BMI)作為肥胖程度定義及疾病發生風險之評估,但於定義上會因種族差 異而有所不同(圖 2-1),進而訂定出符合族群的數值標準以作為評估準則(Wen et al., 2009)。. 圖 2-1. 亞洲人(台灣人)及白種人(Caucasians)身體質量指數與所有原因死亡率相對風險 (relative risks, RR)之比較(Wen et al., 2009) 2.

(14) 過度的能量攝取是導致肥胖發生的主要原因,脂肪細胞(adipocytes)可將過多能量儲 存起來,當有過多能量存在時,脂肪組織(adipose tissues)中的脂肪細胞會有增生 (hypertrophy)及肥大(hyperplasia)的現象出現,其會分泌一些化學趨化物質 (chemoattractant substances),進而促使巨噬細胞(macrophage)侵入(infiltration)脂肪組織 (Ouchi, Parker, Lugus, & Walsh, 2011; Suganami et al., 2007),在脂肪組織中活化的巨噬細 胞會分泌各種促發炎性(pro-inflammatory)的細胞激素(cytokine)、抗發炎因子 (anti-inflammatory factors)、脂肪細胞激素(adipokine) 或其他相關因子(Fantuzzi, 2005), 最終導致脂肪組織處於一個低度發炎(low-grade local inflammation)的環境中(圖 2-2)。. 圖 2- 2 脂肪組織擴張(expansion)引發巨噬細胞浸潤,導致發炎反應及胰島素阻抗 (McArdle, Finucane, Connaughton, McMorrow, & Roche, 2013). 目前研究已證實,當脂肪組織肥大,其分泌的發炎介質,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α; TNF-α)、介白素-6 (interleukin-6; IL-6)、單核球趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1; MCP-1)與一氧化氮 (nitric oxide; NO),這些發炎介質的大量表現將 促使脂肪組織處於低度發炎的環境,長期下來可能會誘發胰島素抗性(insulin resistance) 3.

(15) 的形成(Xu et al., 2003)及增加心血管疾病的風險(Fantuzzi, 2005)。 此外致肥胖的發生也可能與大腦控制中樞的神經傳遞過程出現問題有關,導致飲食 的攝取不受控制,出現過量攝食的行為 (Ravussin & Bouchard, 2000)。 過剩的能量攝取導致脂肪細胞增生和脂肪組織肥大(adiposity)。脂肪細胞增大 (hypertrophy)或數目變多(hyperplasia)造成脂肪組織(adipose tissues)增加導致肥胖 (obesity),因此,抑制脂肪細胞中脂質過度堆積和阻斷新的脂肪細胞生成,就能抑制肥 胖症。方法上可藉由調控脂肪細胞的生成過程,例如: 抑制脂肪前驅細胞的增生、阻斷 脂肪前驅細胞分化成為脂肪細胞、促進脂肪細胞的脂解(lipolysis)或是誘發其細胞凋亡 (apoptosis)等,以達到減少脂肪細胞數量、脂質堆積,產生抗肥胖的效果。人類脂肪組 織中每年約有 10%脂肪細胞會新陳代謝(turn over),若能調控這些新形成的脂肪細胞將 有助於改善各類代謝疾病(Lowe, O'Rahilly, & Rochford, 2011)。 近年來肥胖問題逐漸受到大眾的重視,目前市面減肥藥易有失眠、焦慮、腸胃脹氣、 直腸漏油等副作用,因而促學界著重於探討天然物中抗肥胖的成分及功效。在許多研究 也發現天然食物中存在著許多植化素確實具有抗肥胖或降低脂肪組織發炎反應的效用 (圖 2-3),因而被視為能減緩肥胖及相關疾病發生的風險(Gonzalez-Castejon & Rodriguez-Casado, 2011)。目前相關學界也仍積極尋找能夠誘導脂肪細胞凋亡、抑制脂肪 細胞形成或促進脂肪細胞的脂解作用的天然成分和植化素,希望可以用來改善肥胖所引 起的相關疾病(Park & Kim, 2011; Rayalam et al., 2008)。. 4.

(16) 圖 2- 3. 數種天然化合物作用於脂肪細胞生成或脂質合成的各階段,具有抑制脂肪細胞 生成和脂質堆積的作用(Rayalam et al., 2008). 第二節 肥胖機轉及相關因子 近年來研究已發現肥胖和代謝性及慢性疾病發生的關聯性(Singla et al., 2010),脂肪 細胞的生成(adipogenesis)是間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells)受到許多因子: pro-adipogenic 及 anti-adipogenic factors 的調控,進行分化最終成為成熟的脂肪細胞(圖 2-4) (Henry et al., 2012)。脂肪細胞分化的過程可以依其特徵廣泛區分為兩個階段,分別 為 Determination phase 及 Terminal differmtiation phase (Moreno-Navarrete & Fernández-Real, 2012)。 (1) Determination phase: 於此階段間葉系幹細胞轉換成為前脂肪細胞(preadipocyte),在 此階段雖然細胞型態上沒有太大的改變,但間葉系幹細胞已失去轉換成其他細胞種 類的潛力。 (2) Terminal differmtiation phase: 在此時期,前脂肪細胞型態改變而形成成熟脂肪細胞 (mature adipocyte)。細胞分化前具備活躍的增生能力,細胞長滿後便停止生長,給予 適當荷爾蒙刺激可促使 DNA 複製再次進入細胞週期稱之為 mitotic clonal expansion (MCE),MCE 由許多轉錄因子(transcription factor cascade)所控制,也被認為是 adipogenesis 過程中之重要調控因子,再經 1 到 2 回合細胞週期後停止生長,其中 5.

(17) 第 1 回有絲分裂(mitosis)約在給予分化劑後 24~36 小時完成,第 2 回有絲分裂約在分 化劑後 48~60 小時完成(Tang, Otto, & Lane, 2003b),接著進入最終分化期(terminal differentiation),此時脂肪細胞基因被表現,例如 transcription factor CCATT enhancer-binding protein β (C/EBPβ) 被活化而起動 proliferator-activated receptor-γ (PPARγ)、transcription factor CCATT enhancer-binding protein α(C/EBPα)和 Sterol regulatory element-binding protein-1(SREBP-1),最終成為成熟脂肪細胞(Schadinger, Bucher, Schreiber, & Farmer, 2005)。因此,MCE 於細胞 adipogenesis 過程中也是重要 的調控因子之一,若能減緩 MCE 發生的時間,則可藉由影響細胞週期進而延遲細胞 在 24 小時內從 G0/G1 phase 進入 G2/M phase 的過程,最終影響到脂肪細胞後期油滴 的形成(Tang et al., 2003b)。 目前對於 adipogenesis 調控機制的研究常使用細胞模式,例如: 3T3-L1 小鼠纖維母 細胞(fibroblasts),用 insulin、glucocorticoid receptor agonist 和 phosphodiesterase inhibitor 等試劑處理 3T3-L1 細胞可誘導細胞分化,使 3T3-L1 細胞由紡錘型狀的前脂細胞分化為 圓鼓型具油滴的脂肪細胞。. 圖 2- 4. 脂肪細胞的形成(Overview of adipocyte formation) (Henry et al., 2012). 6.

(18) 在誘導3T3-L1 細胞分化的過程中,一般使用dexamethason (DEX)、Insulin和 3-isobutyl 1-methyl-xanthine (IBMX) (圖2-5)作為分化劑,一起添加於細胞培養基,以誘 導前脂肪細胞型態及特性的改變。. 3-isobutyl 1-methyl-xanthine. Dexamethason. Insulin. 圖 2- 5. 3 種分化劑結構圖 A. DEX; B. IBMX; C. insulin. 其中DEX為一種人工合成的glucocorticoid receptor agonist,可與glucocorticoid receptor 結合,進而活化下游基因,例如 C/EBPβ 等;insulin主要是與類胰島素生長因 子受體 (IGF-1 receptor)進行作用,促進脂肪細胞三酸甘油酯的合成;IBMX則為一種環 化腺甘酸磷酸二酯酶 (cAMP-phosphodiesterase) 抑制劑,其可增加細胞內環化腺苷酸 (cAMP)的含量(洪,2005)。 於細胞分化過程中,目前研究發現許多基因和細胞分化有所關聯(Park et al., 2012) (表2-1),因此若能調控這些基因的表現,也可能為影響細胞分化的一種機轉。. 7.

(19) 表 2- 1. 脂肪細胞分化相關之 mRNA 及 gene 表現 (Park et al., 2012) Name. Gene description. Slc2a4 Cebpb. solute carrier family 2, member 4 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), β. Cebpa Srebf1 Pparg Adipoq Adn Lxra. CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), α sterol regulatory element binding factor 1 peroxisome proliferator activated receptor γ adiponectin complement factor D (adipsin) (Cfd) nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3. Ncor2 Fabp4 Lpin1 Retn Scd1. nuclear receptor corepressor 2 fatty acid binding protein 4, adipocyte (aP2) lipin 1 resistin stearoyl-coenzyme A desaturase 1. Plin. perilipin. 在脂肪細胞成熟的過程中,有 adipogenesis 及 lipogenesis 兩種不同的定義。以下將 簡單介紹兩者: 一、 Adipogenesis Adipogenesis 是指從前脂肪細胞分化到成熟脂肪細胞的過程。目前研究已發現許多 轉錄因子均會影響 adipogenic gene 的表現 (圖 2-6),其中 PPARγ、C/EBP family 等因子 廣泛被大家應用於脂肪細胞分化之指標 (Rosen et al., 2000),此外,於 3T3-L1 adipogenesis 模式中,已證實 cAMP 的活化可誘發下游相關基因表現,進而促使 adipogenesis 持續進行,其中 insulin 的存在也扮演著重要角色,insulin 主要作用於 IGF-1 receptor,可促進前脂肪細胞轉變為正常脂肪細胞(Smith et al., 1988)。目前研究發現 IGF-1 及 insulin receptor,其於不同細胞株中會藉由活化許多訊息傳導路徑(signaling pathway), 例如: Ras-MAPK pathway,進而影響細胞之表現(Prusty et al., 2002)。於 3T3-L1 模式中, 越來越多研究也指出 ERK 和 AKt pathway 於 adipogenesis 過程中扮演著重要的角色(So et al., 2013; Kwak et al., 2012)。 8.

(20) 圖 2- 6. 調控 3T3-L1 細胞分化過程中之轉錄因子(從 mitotic clonal expansion 至 terminal differentiation) (Moreno-Navarrete & Fernández-Real, 2012). Adipogenesis 過程中,許多機轉皆會參與細胞分化及增生的過程,以下將簡單介紹幾 項研究上常使用的機轉路徑。 1.. p-ERK 目前發現於 MAPK pathway 中,當 p42(ERK2)、p44(ERK1)被磷酸化後會進入細胞核. 中,而激活或抑制生長、分化相關之轉錄因子表現(Seger & Krebs, 1995)。許多學者做過 p42/p44 MAPK 在調控 adipogenesis 上的相關機轉的研究,不過各研究在結論上往往有 所爭議,像是有些研究主張藉由 effectors 活化 MAPK 後具有中斷 adipogenesis 的效用 (Font de Mora, Porras, Ahn, & Santos, 1997; Shimba, Wada, & Tezuka, 2001),另一派則認為 降低 p42/p44 MAPK 的表現可抑制 adipogenesis,進而減少前脂肪細胞分化形成成熟脂 肪細胞(Dieudonne et al., 2002; Zhang et al., 1996)。再經學界近年來的探討後,發現這兩 派說法均是正確的,過往之所以有兩派說法主要跟 MAPK 活化的時間需很精確有所關 9.

(21) 聯,即為 p-ERK 若不是在正確的時間點表現,均可能會導致抑制 adipogenesis 的現象出 現(Prusty et al., 2002)。 像是於 p-ERK 不表現期若給予 effectors 時,會造成 MEK/ERK 路徑在不對的時間點 被活化,進而中斷 adipogneic gene,例如: PPARγ 的表現(Camp & Tafuri, 1997; Hu, Kim, Sarraf, & Spiegelman, 1996);相反的,如果 p-ERK 於正確的時間點表現,其可促進細胞 分化作用及活化轉錄因子,進而可促使 PPARγ 及 C/EBPα 開始表現,促進 adipogenesis 過程的進行(Prusty et al., 2002)。 因此 p-ERK 的表現也成為 adipogenesis 過程的指標之一,於 Prusty et al (2002)的研究 發現,於 3T3-L1 模式中,加入分化劑後 MEK/ERK 約 5 分鐘 p-ERK 表現量就開始有明 顯上升的趨勢,之後表現量逐漸降低,於 2 小時後幾乎沒有表現。由此可知,p-ERK 為 adipogenesis 過程中早期的分化指標,若萃物能在早期抑制其表現或在不對的時間點增 加其表現,均有可能達到降低 adipogenesis 而降低脂肪細胞形成成熟脂肪細胞之效用。. 2.. PPARγ PPAR family 中包含 PPARα、PPARβ 和 PPARγ,其為三種不同的同工異構蛋白質. (Dreyer et al., 1992),其中 PPARγ 是位於核內的接受器,對於脂肪細胞的生成及基因調 控扮演關鍵角色。PPARγ 包含兩種蛋白質異構體(protein isoforms): PPARγ1 及 PPARγ2, 兩者皆由同一個基因所轉錄出來,但由於轉錄後的基因剪接(alternative splicing) 不同, 形成兩種不同的蛋白質序列。其中 PPAR-γ2 在 N 端較 PPAR-γ1 多出 30 胺基酸序列, 且此序列在脂肪細胞中為主要功能型態(dominant isoform) (Tontonoz, Hu, Devine, Beale, & Spiegelman, 1995)。PPAR 的同功異構蛋白質具有組織特異性,PPARα 主要表現於肝 臟,調控脂肪代謝和發炎反應;PPAR β/δ 參與胚胎和骨骼的發育,而 PPARγ 主要表現 在脂肪組織,調控細胞分化、脂肪形成、和胰島素敏感度。PPARγ1 除了存在於脂肪細 胞外,也發現存在於其他組織,例如:巨噬細胞(macrophages)、膀胱(bladder)、乳房(breast)、 前列腺(prostate)等,不過表現量均不多;而 PPARγ2 專一表現於脂肪組織,且表現量較 多,主要調控著脂肪細胞分化 (Mansen, Guardiola-Diaz, Rafter, Branting, & Gustafsson, 10.

(22) 1996; Michael, Lazar, & Mendelson, 1997; Mueller et al., 1998; Tontonoz, Nagy, Alvarez, Thomazy, & Evans, 1998)。 PPARγ 為脂質生成作用中主要的調節者,其參與許多 adipogenic 和 lipogenic 基因的 轉錄和活化,例如: aP2, CCAAT/enhancer-binding protein-α (C/EBPα),perilipin 及 GLUT4, 這些基因的表現常為調控脂肪細胞成熟、脂質堆積、胰島素敏感性的重要因子 (Schadinger et al., 2005)。. 3.. C/EBP family C/EBPs 屬於一群具有basic-leucine zipper 結構之轉錄因子家族,其有不同的isoform. 形式,包含C/EBPα、 C/EBPβ、C/EBPδ、C/EBPγ及C/EBPε等(洪,2005)。 在C/EBP family的成員中,C/EBPα、 C/EBPβ及 C/EBPδ在脂肪細胞分化過程扮演重 要的角色。首先,在前脂肪細胞開始誘導分化時,初期會先引發 C/EBPβ及 C/EBPδ mRNA開始的表現,其中分化劑包含的DEX及IBMX 能分別活化 C/EBPβ及C/EBPδ的表 現,且在移除分化劑後,C/EBPδ 於48小時內表現量快速下降,而C/EBPβ則在8天內逐 步降低(Ntambi & Kim, 2000) (圖2-6)。 研究發現,當 C/EBPβ 及 C/EBPδ 被活化後,會進一步去促使 C/EBPα 及 PPARγ 的表 現,C/EBPα 及 PPARγ 的活化會共調節(cross-regulate)彼此,以維持彼此基因的表現不因 C/EBPβ、C/EBPδ 表現量降低而減少(Shao & Lazar, 1997),除此之外,C/EBPβ 的表現也 被認為與分化早期 mitotic clonal expansion 過程有高度關聯性(Tang, Otto, & Lane, 2003a)。 當 C/EBPα 及 PPARγ 單獨或共存在時會更進一步去引發許多 adipocyte gene 開始表現 (Gregoire, Smas, & Sul, 1998),像是 C/EBPα 在許多脂肪代謝酵素相關基因的啟動子 (promoter)上均有其結合位置,例如:aP2、葡萄糖轉運子-4 (GLUT4)及硬脂酸輔酶 A 去 飽和酶(SCD-1)等,而可促進或維持脂肪細胞的分化。. 11.

(23) 圖 2- 7. 3T3-L1 細胞分化過程中各基因表現時期(Ntambi & Kim, 2000). 二、Lipogenesis Lipogenesis 主要指脂肪酸及三酸甘油脂(Triglyceride)合成,lipogenesis 在肝臟及脂肪 細胞中皆會進行 (Kersten, 2001)。 目前已知 lipogenic genes 包含 adipocypte fatty acid-binding protein 4(aP2, FABP4)、fatty acid synthase (FAS)、stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1)、acetyl-CoA carboxylase-1 and -2 (ACC)等,其中 FAS 主要參與脂質的合成作用;aP2 則與 fatty acid 具有高度的親和性 (affinity),在脂肪組織中為運送細胞內和代謝脂肪酸的重要介質(mediator)。 除了上述機轉外,在脂質代謝過程中,許多因子也會參予脂質代謝、合成及轉運的 過程(Park et al., 2012),這些因子如表 2-2 所示。. 12.

(24) 表 2- 2. 脂質代謝相關之 mRNA 及 gene 表現 (Park et al., 2012) Process. Name. Gene description. Lipid Biosynthetic Process. Fasn. fatty acid synthase. Acsl1. acyl-CoA synthetase long-chain family member 1. Acsl5. acyl-CoA synthetase longchain family member 5. Scd1. stearoyl-coenzyme A desaturase 1. Fads3. fatty acid desaturase 3. Cyp51. cytochrome P450, family 51. Gpd1. glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 (soluble). Dgat2. diacylglycerol Oacyltransferase 2. Dgat1. diacylglycerol Oacyltransferase 1. Adipor1. adiponectin receptor 1. Adipor2. adiponectin receptor 2. Pld4. phospholipase D family, member 4. Plcg1. phosphoinositide phospholipase C-γ-1 (ELP). Clps. colipase, pancreatic. Plcd1. phospholipase C, δ 1. Acot7. acyl-CoA thioesterase 7. Pla2g2d. phospholipase A2, group IID. Hexa. hexosaminidase A. Oc90. otoconin 90. Cel. carboxyl ester lipase. Slc37a4. solute carrier family 37, member 4. Slc27a4. solute carrier family 27, member 4. Slc22a4. solute carrier family 22, member 4. Cd36. CD36 antigen (Fatcd36). Lpl. lipoprotein lipase. Apoc2. apolipoprotein C-II. Fabp4. fatty acid binding protein 4, adipocyte (ap2). Fabp5. Mal1 mrna for keratinocyte lipid-binding protein. Slco2a1. prostaglandin transporter PGT mrna, complete cds. Lipid Catabolic Process. Uptake and Transport. 13.

(25) 第三節 高脂飲食誘發小鼠肥胖模式 以高脂飲食誘發小鼠或大鼠體重增加常用於肥胖或糖尿病模式,但並非所以品系的 老鼠均適用於此模式,像是在小鼠品系中,A/J mouse和C57BL/KsJ mouse 相較於 C57BL/6J mouse 對高脂飲食有較高的耐受性,因此不易觀察到體重差異(Rossmeisl, Rim, Koza, & Kozak, 2003)。其中,以高脂誘發C57BL/6J (B6) mouse 肥胖更為模擬人體代謝 失調的優良動物模式,研究發現給予高脂飲食可成功誘發小鼠肥胖、高胰島素血症 (hyperinsulinemia)、高血糖(hyperglycemia)及高血壓(hypertension)等代謝失調症狀,但若 單純給予chow diet飲食,則小鼠可維持瘦小體型,且沒有任何代謝異常的症狀出現 (Collins, Martin, Surwit, & Robidoux, 2004)。 研究發現供給B6 mouse高脂飲食(任意取食)約1~2週就可看到體重明顯與chow diet 飲食組出現差異,隨著飼養時間增加,體重差距會逐漸增加,飼養16~20週高脂飲食後, 高脂組小鼠體重與chow diet相比增加20~30% (Wang & Liao, 2012)。血糖部分則與高脂飲 食設計有關,一般大約給予高脂飲食4週後會開始出現高血糖(hyperglycemia)的現象(Sato et al., 2010),禁食血糖的增加通常也會伴隨著禁食insulin level的提升,此外隨著肥胖的 發生,小鼠血脂濃度(TG、TC、游離脂肪酸)、adipokine表現(leptin、adiponectin)也會開 始出現異常(Wang & Liao, 2012)。在高脂飲食有發小鼠肥胖的模式中,已知餵食高脂飲 食16週後藉由增加脂肪細胞增生、脂肪沉積於腸系膜(mesentery)及脂肪量增加,最終提 高糖尿病,高血壓等慢性疾病的發生機率(Inui, 2003)。. 14.

(26) 第四節 牛樟芝的生理活性 一、 牛樟芝簡介 牛樟芝( Antrodia cinnamomea) 又名牛樟菇、樟菇、窟內菰、紅樟芝、神明菇等,甚 至被稱為「蕈類的紅寶石(ruby in mushroom)」(Wu, Ryvarden, & Chang, 1997)。 牛樟芝主產地為台灣,是台灣特有真菌,生長於山區中低海拔約 200~1600 公尺之牛 樟樹(Cinnamomun kanehirar Hay.)上,過去因大量採伐,造成野生牛樟芝數量也就越來 越少,目前僅剩零星見於交通不便之中、高海拔 450~2000 公尺山區(王,2011)。 牛樟芝主要生長於樹幹腐朽之內壁,少數會生長於倒伏牛樟木才潮濕之表面(Chang & Chou, 1995)。其子實體外觀形態多變,且形狀會隨著牛樟樹形狀而有變化,故有皮塊 狀(層紋板狀)、板狀、鐘乳石狀(鐘狀)、馬蹄狀或塔狀等模樣。初生時顏色鮮紅色,漸 長變為白色、淡紅褐色、淡褐色或淡黃褐色之孔狀構造,牛樟芝子實體帶有苦味,且具 有黃樟香味(Wu et al., 1997)。 牛樟芝菌絲體則為其剛開始發育生長時的主要組織,初期生長時為一絲絲的,隨著菌 絲數增加,會逐漸形成菌絲團,接著再成為菌絲體,以為接著要發育成子實體打下良好 基礎(王,2011)。. 二、 牛樟芝成分 目前已鑑定出至少78 種牛樟芝內具活性之成分(bioactive ingredients),例如: triterpenoids、sesquiterpene lactone、steroid及polysaccharide等(Chen, Yang, & Shen, 1995a; Chen, Yang, & Shen, 1995b; Cherng, Chiang, Cheng, & Wang, 1995; Cherng, Wu, & Chiang, 1996)。有關牛樟芝的成分及生物活性研究中,成分研究上多著重於大分子的多醣體 (polysaccharides)和小分子的三萜類(triterpenoids)和固醇類(steroids)。. 1. 多醣體(polysaccharides): 藥用菌中(真菌類、靈芝、牛樟芝等)多醣類常為其具生物活性(預防及抑制腫瘤、免 15.

(27) 疫生理活性)之有效成分。 牛樟芝中影響免疫反應主要為多醣類,例如: 菌絲體多醣可促使 IFN-γ、TNF-α 的表 現,進而增加樹突細胞與巨噬細胞數量(Chen et al., 2008)。除此之外,多醣體之所以有 預防及抑制腫瘤的效用,主要是因多醣類中含有 β-glucan (β-葡聚醣)的成份,β- glucan 能透過刺激巨噬細胞、T 淋巴細胞、B 淋巴細以及自然殺手細胞等,增強免疫功能進而 達到抗腫瘤的效果(Mizuno, 1996)。 多醣類除了能抑制腫瘤和改善免疫調節外,亦有研究指出牛樟芝菌絲體的多醣成分可 以抑制 NOS 表現與一氧化氮等發炎因子的生成(Chen, Lin, Liao, & Shieh, 2007; Shen et al., 2004)。. 2. 三萜類(triterpenoids): 牛樟芝成分中,目前發現以三萜類佔絕大的比例,其中結構部分以 ergostane 爲骨架 和 lanostane 爲骨架的化合物居多,例如: 以 ergostane 爲骨架的 antcin A、antcin B (zhankuic acid A)、antcin C 等;及以 lanostane 爲骨架的 dehydroeburicoic acid、 dehydrasulphurenic acid 等(Chen et al., 1995b; Cherng et al., 1995; Cherng et al., 1996)。 三萜類是牛樟芝的主要化學成份之一,研究發驗牛樟芝子實體中高達 63%為三萜類, 其也被認為是牛樟芝苦味的來源 (Geethangili & Tzeng, 2011)。目前研究大多於探討三萜 類成分對於腫瘤細胞抑制及機制,在體外培養實驗也證實牛樟芝乙醇萃物可透過巨噬細 胞的活化,生成大量 TNF-α 與 IL-1β,進而可抑制肝癌細胞 (HepG2 及 PLC/PRF/5)生長 (Chang et al., 2011);除此之外,有研究也提出牛樟芝中的三萜類於體外實驗中對乳癌 (MDA-MB-231)、結腸癌(HT-29,. HCT-116 & SW-480)細胞具有毒殺效用(Yeh et al.,. 2009)。 從實驗證實三萜類化合物有抑制肝癌細胞增殖作用,和多醣體同樣扮演著抗腫瘤活 性調節之重要角色。而三萜類在牛樟芝抗發炎功效上也扮演重要的角色,在抗發炎機制 上,目前認為與 NF-κB 傳遞路徑的抑制作用是有所關聯的(謝 等,2013)。. 16.

(28) 三、 牛樟芝萃物的生物活性 全世界約 80 % 的人口依賴傳統藥物(traditional medicines)或仿間用藥(folk medicine) 做為初級保護或治療,而這些傳統治療所使用的材料大多屬於草本萃物(herbal extracts), 且多以水溶性為主(Patwardhan, Warude, Pushpangadan, & Bhatt, 2005)。 在臺灣牛樟芝就為一種仿間使用已久的藥材,可用於改善過量飲酒造成的不適及無 力感(Wu et al., 1997),除此之外,部分民眾也認為牛樟芝具有延長壽命的效用。 於牛樟芝子實體相關研究中,發現其可應用於預防或治療多種疾病,包含肝臟疾病、 食物或藥物中毒、腹瀉(diarrhea)、腹部疼痛、高血壓、皮膚搔癢以及改善免疫功能 (Geethangili & Tzeng, 2011)。. 1.. 抗癌功效(Anti-Cancer Activities) 於in vivo及in vitro實驗中發現不論是牛樟芝子實體還是菌絲體均具有降低多種癌細. 胞增生的功效。於文獻中指出牛樟芝子實體以CHCl3/MeOH 進行粗萃對Jurkat、Hep G2、 Colon 205及MCF 7等細胞株具毒殺效果(Rao, Fang, & Tzeng, 2007)。牛樟芝固態培養菌 絲體(AC-SS,1 μg/mL)在in vitro實驗中發現於肝癌細胞株C3A及PLC/PRF/5中,給予牛樟 芝可輔助抗癌藥物cisplatin (10 μM)或mitomycin (10 μM) 抑制癌細胞增值的效用(Chang et al., 2008)。 牛樟芝多醣體的部分也有文獻指出其不論是在vivo及in vitro實驗均可顯著抑制腫瘤 細胞的生長,且此機制與免疫作用有關(Liu et al., 2004)。. 2.. 抗發炎功效 (Anti-Inflammatory Effects) 降低發炎反應的產生有幾種不同的方式,像是減少reactive oxygen species(ROS)的生. 成、降低促發炎細胞激素(cytokine)的分泌等。在相關研究中發現牛樟芝菌絲體萃物可減 緩 因 fMLP(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine) 及 PMA(phorbol. 12-myristate. 13-acetate)誘發 peripheral human neutrophils(PMN)或mononuclear cells(MNC)而產生的 ROS (Shen et al., 2004);發酵培養之牛樟芝菌絲體(25~100 µg/mL)可改善RAW 264.7巨噬 17.

(29) 細胞因LPS誘導產生之NO、PGE2、TNF-α及IL-1β,除此之外,牛樟芝的給予中斷了LPS 所誘發之IB-降解,進而可減緩NF-B的活化(Hseu et al., 2005)。這樣的結果在牛樟芝 子實體甲醇(6~50 μg/mL)、CHCl3(3~25μg/mL)萃物中也可看到相同的現象,即可藉由降 低巨噬細胞iNOS、TNF-和 IL-12的產生而改善發炎現象(Rao et al., 2007)。 研 究 中 指 出 , 野 生 牛 樟 芝 子 實 體 甲 醇 萃 物 (50 μg/mL) 在 小 鼠 microgli 細 胞 株 (EOC13.31)中,可藉由降低iNOS、COX-2及TNF-的表現而達到抗發炎之效用,且甲醇 萃物功效優於水萃物,抑制效用分別為子實體>固態發酵>液態發酵(Liu et al., 2007)。. 3.. 抗氧化活性(Anti-Oxidant Activities) 大量文獻指出牛樟芝具有清除自由基(free radical)的能力,像是可清除. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)、抑制脂質過氧化等功效(Hsiao et al., 2003; Mau, Huang, Huang, & Chen, 2004; Shu & Lung, 2008; Song & Yen, 2002)。 於Shu和Lung (2008)的研究中發現牛樟芝甲醇萃取物及菌絲體培養後之過濾液具有 清除DPPH自由基、脂質過氧化、超氧陰離子自由基(superoxide anion)等抗氧化效用。. 4.. 護肝效用(Hepatoprotective Activity) 相關研究中指出在牛樟芝在護肝效用上是藉由不同機轉達成,像是清除自由基減少. 細胞損傷、增強抗氧化酵素活性、抑制發炎介質(inflammatory mediators)和誘導肝細胞 的再生(Geethangili & Tzeng, 2011)。. 5.. 免疫調節作用(Immunomodulatory Effect) 牛樟芝成分中,主要以多醣類影響免疫反應,除此之外,研究指出牛樟芝菌絲體純. 化出的免疫調節蛋白可藉由調節TLR2受體活化NF-κB途徑之相關基因表現,最終達到活 化巨噬細胞(謝 等,2013)。. 18.

(30) 6.. 其他功效 除了上述功效外,研究發現牛樟芝的給予,於動物實驗中具有改善疲勞的功效(Huang,. Hsu, Huang, Yang, & Hou, 2012);牛樟芝萃物也可經由調節內皮細胞鈣離子通道,增加 NO釋放和活化cGMP系統而促使血管舒張以改善血脂及心血管問題;在美容部分,牛樟 芝可降低細胞受到紫外光的傷害,同時也具有抑制細胞被光線照射後產生酪氨酸酶 (Tyrosinase,一種使人體皮膚形成黑色素的酵素)的活性,進而可降低皮膚因受紫外光所 導致的黑色素沉積(王,2011);神經保護功效上,牛樟芝萃物可經由PKA-dependent路徑 抑制JNK和p38活性,而避免PC-12(神經細胞)的凋亡(Lu, Cheng, Lai, Lin, & Huang, 2008)。. 四、 牛樟芝安全性 近年來牛樟芝食用上的安全性問題也逐漸受到大眾的重視,於吳銘芳等人(2012)的研 究中,建立小鼠(BALB/c mice)進行28天亞急性與90天亞慢性毒性分析模式,每組十隻老 鼠,以16.7、833.3與1666.7 mg/kg/day三種牛樟芝劑量連續28天管灌餵食或90天口服餵食, 觀察亞急性毒性反應或亞慢性毒性反應,以了解人體每日牛樟芝建議攝取劑量1倍(16.7 mg/kg/day)、50倍(833.3 mg/kg/day)與100倍(1666.7 mg/kg/day)下,是否會影響到小鼠之 肝、脾、腎內臟器官產生病變。除此之外,進一步透過生化與血液常規檢驗,觀察毒性 是否產生。實驗結果發現各組老鼠均存活,且實驗組老鼠之血液與生化檢驗結果皆與對 照組無統計上的差異;組織切片的部分各組也皆未有明顯的病理與毒理變化。 此外,Chen, Chen, Lin, Tsai, and Nam (2011)以Sprague–Dawley rats進行90天亞慢性毒 性分析以評估牛樟芝之安全性,實驗中,大鼠分別以管餵方式給予不同的劑量之牛樟芝 (3000, 2200 and 1500 mg/kg BW/day),連續餵食90天後各組老鼠均存活,且沒有明顯的 臨床病徵和體重差異,進一步透過生化與血液常規檢驗結果皆與對照組無統計上的差異。 因此,由本篇實驗結果,Chen et al.(2011)證實於SD大鼠中,牛樟芝的無毒性顯示劑量(no observed adverse effect level, NOAEL)為3000 mg/kg BW/day。. 19.

(31) 第三章 材料方法 第一節、皿培式牛樟芝培養與成份分析 壹、 皿培式牛樟芝培養方法 一、固態培養基配置 以每公升 39 公克的比例將馬鈴薯培養基(PDA,Potato Dextrose Agar, Sigma-Aldrich) 溶於二次水中,攪拌均勻再加熱至溶解。以 121℃高壓滅菌 20 分鐘,取出待溫度降至約 50℃再倒入約 25 mL 的培養基溶液於培養皿中,待冷凝固備用(Chang & Wang, 2005)。. 二、 牛樟芝菌株培養 採集野生牛樟芝,將新鮮擔子菌(basidioms)切為片狀後,置入無菌水中,攪拌五分鐘 以獲得 basidiospore 上清液。將其培養在 MEA (2% malt extracts, 2% glucose, and 2% Bacto agar)培養盤,25℃培養 15 天,為菌絲體。接續將菌株接種於 PDA (potato dextrose agar, Bacto) 培養皿,於 20-25℃的環境、避光培養,培養 4 個月後收集子實體(Chang & Wang, 2008),如圖 2-8。. 圖 2- 8. 本實驗研究材料-皿培式牛樟芝. 20.

(32) 貳、 樣品製備 一、 製備流程: 牛樟芝萃取物和其區分物 皿培式牛樟芝乾燥子實體粉末 粉碎成粉末 以 1:20 (w/v)之比例加入 95 %乙醇,萃取 24 小時,. 子實體粉末和二次水以 1:100 (w/w) 比例萃取,於 80℃加熱 6 小時,共 萃取 2 次. 共萃取兩次。 過濾後經減壓濃縮。. 水萃取物(ACW) 以 1:3 (v/v)之比例加入 95 % ethanol, 密封、4℃沉澱至隔天,第二天以 9000 xg 離心 20 分鐘. 乙醇粗萃物(ACE). 上層萃取液乾燥後,取 得非多醣體的區分物. 沉澱物乾燥後,取得多醣 類區分物(PS). (NPS). 二、 牛樟芝(Antrodia cinnamomea)水萃粗萃物製備 本研究使用以洋菜膠為培養基質培養之牛樟芝子實體,實驗樣品皆由中國醫藥研究 所退休研究員周正仁老師所提供。將牛樟芝子實體磨成粉末後,樣品粉末與 80℃熱水 以 1:100 (w/w)的比例進行萃取 6 小時,萃取液經布氏漏斗過濾,剩餘粉末再加入同體 積 80℃熱水萃取 6 小時,過濾後水萃物以冷凍乾燥機(EYELA, FDU-1200)進行凍乾, 獲得之萃取物回溶於 DMSO 即得 Antrodia cinnamomea (ACW) stock solution 以進行後 續實驗。. 21.

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