研究儀器設備及工具

本研究利用 Biosampler (SKC Inc., Eighty Four, PA)及 MAS-100 (MAS-100 microbial air sampler, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)生物氣 膠採樣器進行作業現場之空氣中微生物採樣，鐵氟龍濾紙則是置於 2 件 式濾紙匣中來進行總粉塵之採樣。Biosampler 為高濃度生物氣膠場所經常 使用之生物氣膠採樣器。而MAS-100 生物氣膠採樣器則是便於攜帶之生

本研究所使用的 Biosampler 採樣器，一般適用於生物氣膠濃度較高 之地點，為玻璃製的採樣器，採樣流量為12.5L/ min，採樣介質為無菌去

圖二、Biosampler 採樣器。頂端為氣體採樣頭，中間則為連接採樣泵之接 頭，底部標示的部份為能使空氣達到音速的噴頭。(取自 SKC 網頁)

(三) MAS-100 生物氣膠採樣器

MAS-100 生物氣膠採樣器適用於一般的環境，為不鏽鋼製且為使用 電池之可攜式生物氣膠採樣器，採樣流量為100L/ min ± 2.5%，內含數位 式的風速計及流量偵測器，可自動調整流量至設定值。採樣頭內可放置9 公分之塑膠培養皿。使用 MAS-100 生物氣膠採樣器來進行採樣之地點 為，距離切削機台10 公尺及工廠戶外。MAS-100 生物氣膠採樣器如圖三 所示。

圖三、MAS-100 生物氣膠採樣器(取自 Merck 網頁) (四) 培養基

本研究將以可培養性細菌為主要生物氣膠分析種類，以 Trypticase Soy Agar (TSA, Difco, Detroit MI, USA)採集並培養樣品中之細菌，其中 TSA 培養基為每公升二次去離子水中加入 40 克，其成分中含有 Tryptone 15 克、Soytone 5 克、氯化鈉 5 克、Agar 15 克。

培養基調配均勻後置入高壓滅菌釜中以攝氏 121 度滅菌 15 分鐘以達 到滅菌效果。滅菌後之培養基則須置於水浴中維持在攝氏55 度，並在無 菌操作檯中利用蠕動式幫浦每次定量 20 毫升置入直徑 9 公分之培養皿 中，並放置過夜使培養基凝固乾燥，再保存於室溫培養箱中待用。

(五) Biosampler採樣流程⁽⁵⁷⁾ 採樣前的準備步驟：

(1)將 Biosampler 採樣器注入採樣時所用的無菌水後，連接至流量校 正器後再連接至採樣泵，調整採樣泵之流量至12.5 L/min。

(2)先利用鋁箔紙封住分解後的 Biosampler 採樣器開口面，再將 Biosampler 採樣器與微量滴管及二次去離子水置入高壓滅菌釜中 用軟管連接採樣泵與 Biosampler 採樣器。並確認軟管沒有打結或 有影響氣流通過之情況出現，如果有則要排除影響氣流通過之情

(2) 利用微量滴管把 200μl 的採樣介質移到 TSA 培養基上，並利用滅 菌後之培養皿塗抹棒塗抹，使採樣介質平均的分布於培養基上。

(3) 待採樣介質乾燥後，利用石蠟膜密封培養基，並倒置於 37℃之恆 溫培養箱中。

(六) 細菌菌種鑑定流程

(1)現場採樣回到實驗室後，將細菌之培養基放置於37℃之恆溫培養 箱中放置24小時後，做菌落計數。計數後分別進行細菌之革蘭氏染色鏡 檢型態及菌種鑑定。

(2)先利用目視的方式把不同型態的細菌菌落取出後，再利用革蘭氏 染色劑進行染色。革蘭氏染色 (Gram stain, Difco^TM, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD) 是細菌辨認上重要的區分技術，經由染色可將細 菌區分為兩大類，一為革蘭氏陽性菌，另一為革蘭氏陰性菌，並用光學 顯微鏡觀察其型態，主要區分成桿菌及球菌，總共可分為革蘭氏陽性桿 菌、革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏陽性球菌或革蘭氏陰性球菌。知道是陽性 菌或陰性菌後再把菌落分離到新鮮的培養基中，把培養基放到 37℃之恆 溫培養箱中放置24 小時，使單一菌種的菌落數可以達到細菌菌種套件所 要求的菌落量。培養後再依不同的染色結果選用不同的套件來進行細菌 菌種鑑定。細菌菌種鑑定流程如圖四所示。

現場採樣

在37℃之恆溫培養箱中放置24小時

革蘭式染色

利用顯微鏡觀察並決定是革蘭式陽性球菌/革蘭式陰性球菌/革蘭式陽性 桿菌/革蘭式陰性桿菌

把菌落分離到新鮮的培養基中，放到37℃之恆溫培養箱中放置24小時

選用不同的api^TM套件來進行細菌菌種鑑定

圖四、細菌菌種鑑定流程

(七) api^TM細菌菌種鑑定套件選擇流程

在細菌鑑定方面，本研究參考行政院勞工委員會勞工安全衛生研究 所研究報告「養豬場生物氣膠暴露危害研究(二)-細菌菌種分析與探討」

的細菌鑑定流程⁽⁵⁸⁾，利用api^TM鑑定套件(bioMerieux, Inc., Hazelood, MO) 來針對重要菌種進行鑑定。

革蘭氏陽性球菌先以氧化氫酶 (Catalase) 測試，產生氣泡為葡萄球 菌，輔以api^TM Staph 之鑑定套組鑑定，可檢出的菌種有：Staphylococcus aureus, Staph. hyicus, Staph. auricularis, Micrococcus spp., Stomatococcus mucilaginosus 等；若無產生氣泡則為鏈球菌，輔以 api^TM Strep 之鑑定套組 鑑定，可檢出的菌種有：Streptococcus agalactiae, Strep. suis, Enterococcus faecalis, Aerococcus viridans, Listeria grayi 等。

革蘭氏陽性桿菌先以氧化酵素(Oxidase)測試，若菌落呈深藍紫色，表 陽性結果，無顏色變化為陰性結果，陽性以 api^TM 50CHB 之鑑定套組鑑 定，可檢出的菌種有：Bacillus cereus, B. anthracis, B. cereus, B. mycoides；

陰性以api^TM Coryne 之鑑定套組鑑定，可檢出的菌種有：Corynebacterium aquaticum, C. bovis, C. pseudodiphtheriticum, C. jeikeium, C. renale, Actinomyces pyogenes, Brevibacterium 等。

革蘭氏陰性桿菌以Triple sugar iron agar (TSIA) 分為葡萄糖發酵菌與 葡萄糖非發酵菌，前者 TSIA 有變黃或變黑之現象，以 api^TM 20E 之鑑定 套組鑑定，可檢出的菌種有：Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp., Klebsiella spp., Erwinia spp., Pseudomonas spp., Proteus vulgaris 等。後者 TSIA 維持紅色而無變黃或變黑之現象，以 api^TM 20NE 之鑑定套組鑑定，

可檢出的菌種有：Pseudomonas aerruginosa, P. putisa, Acinetobacter lowffii, Aeromonas hydrophila, Bordetella bronchiseptica 等。

革蘭氏陰性球菌則沒有適合的細菌菌種套件可進行鑑定。

api^TM細菌菌種鑑定套件選擇流程如圖五所示。