研究動機

人類端粒 DNA 的四股結構具有相當多種結構，這種多樣性使得以四股結構 為標靶藥物的設計更顯困難，專一性作用在特定四股結構的方式可能無法適用在 其他構型，而且四股穩定劑設計的概念大部分以分子與 G-quartet 平面以-

interaction 為主要的 end-stacking 作用和 DNA 帶負電的磷酸根骨架藉由正負電荷 的庫倫作用力結合，因此我們嘗試針對人類端粒 DNA 的四股結構多樣性，設計

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圖 4.5 BMVC 考慮 PEG 效應設計出 BMVC-8C3O 示意圖

- 63 - 在(10-12ppm) 左右，可以發現加入五倍量 BMVC-8C3O 後，HT24 的 imino-proton 有明顯的往右移動，是由於 BMVC-8C3O 結合 HT24 造成 imino-proton 受到遮蔽 效應 (shielding effect)。但隨者時間變化 imino-proton 訊號還是有改變，而是訊 號上消張，經過 12 小時變化與加熱回溫的訊號相同，且與 CD 結果一致。另外 圖 4.6d 的 PAGE 實驗發現五倍的 BMVC-8C3O 與 HT24 作用放置在 25℃

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(overnight)、37℃ (overnight)、與加熱回溫處理 (Annealing)，有不同的 gel band shift；放置在 25℃ (overnight)的跑膠顯示兩個 bands，而 37℃ (overnight)與加熱 回溫處理的跑膠都顯示一個移動較慢的 band，顯示有兩個不同的結構。同樣在 Tan 團隊也觀察到 PEG 中有兩個結構的 band shift ⁹⁶，所以比較先前 CD 與 NMR 的結果，這兩個不同的結構可能由原本 HT24 的非平行四股結構轉換成平行螺旋 型四股結構，實驗結果證明五倍當量的 BMVC-8C3O 似乎具有與 40% (v/v) PEG 一樣的特性。

BMVC-8C3O 與不同端粒四股結構作用

Phan 團隊⁹⁸證明了 PEG 可以將不同的人類端粒四股結構轉換成相同的平行 四股結構。為了測試 BMVC-8C3O 是否具有一樣的能力，我們使用相同於 Phan 所報導的序列：TA-HT21 混和型四股結構、A-HT21 具有兩種以上非平行結構、

CTA22 椅型四股結構、HT21-T 反平行兩層籃型四股結構、與 HT21 非平行四股 結構，圖 4.7 結果顯示此五種 DNA 的 imino-proton NMR 與文獻報導相同⁹⁸，且 CD 光譜都是以 295nm 為主要訊號，在加入五倍當量的 BMVC-8C3O 加熱回溫處 理之後 CD 光譜皆變為 265nm 為主的訊號，imino-proton NMR 也發現 TA-HT21、

A-HT21 及 CTA22 具有類似的訊號峰，與 Phan 發現結果相同，而 HT21-T 與 HT21 有類似的訊號，但與前三個序列不同，推測可能是 HT21-T 與 HT21 在 5'端沒有 格外的鹼基。

雖然 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構的 imino-proton 訊號與 Phan 所報導 的 PEG 轉換的平行四股結構不相同，但由圖 4.7 可知 BMVC-8C3O 能將不同端 粒四股結構轉換成類似的 NMR 訊號，這與 PEG 的結果有相當的一致性。

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(a) (b)

(c) (d)

圖 4.6 (a) 不同當量 BMVC-8C3O 與 HT24 四股結構作用之 CD 光譜在 K⁺ 150mM 條件下 (實線 25℃放置 2h，虛線加熱至 95℃約 10min 後再以 1℃/min 降 回 25℃)，(b) 五倍當量 BMVC-8C3O 與 HT24 作用在 37℃下不同時間 CD 光譜，

(c) 五倍當量 BMVC-8C3O 與 HT24 作用在 37℃下不同時間 NMR 光譜，(d) 五 倍當量 BMVC-8C3O 與 HT24 作用放置在 1. 25℃ (overnight), 2. 37℃ (overnight) 3. Annealing 處理 (加熱至 95℃約 10min 後再以 1℃/min 降回 25℃)的跑膠圖。

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(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

圖 4.7 (左) 不同人類端粒序列在 150mM K⁺溶液中 (黑線)與加入五倍當量 BMVC-8C3O 後加熱回溫 (紅線)的 CD 光譜，(右) 相對應序列 (lower)與加入五 倍當量 BMVC-8C3O 後加熱回溫 (upper)的 imino proton NMR 光譜。

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圖 4.8a 比較 BMVC-8C3O (upper)與 PEG (lower)對 TA-HT21 所轉換的平行 四股結構之 NMR 訊號，確實有明顯差異，可能是 BMVC-8C3O 作用在四股結構 所造成的遮蔽效應。為了驗證此遮蔽效應，我們將等量的 BMVC-8C3O 加入 PEG 已轉換的平行四股結構，根據其 imino-proton NMR 光譜 (middle)，發現訊號位 置與直接用 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構光譜 (upper)類似，雖然光譜波峰 有寬化的現象，但是整體訊號是相當一致的，另外我們比較不同端粒序列的結果，

圖 4.9 顯示結果具有一致性，因此我們相信 BMVC-8C3O 可以將人類端粒序列 由不同的非平行四股結構轉換成相類似的平行四股結構。

PEG 的溶劑效應與 BMVC-8C3O 小分子區域化效應

PEG 溶劑效應是經由 DNA 水合的程度造成影響，已知稀釋 PEG 濃度會使轉

變後的平行結構再變回原本的非平行四股結構⁹⁸，將該溶液稀釋 25 倍，在 37℃

經過 12 小時後，圖 4.8b 的 CD 光譜顯示平行四股結構的 265nm 降低，而非平行 四股結構的 295nm 增強。同樣地我們也用稀釋實驗來測試 BMVC-8C3O，發現 經過 12 小時之後，265nm 為主的 CD 訊號幾乎沒有改變，說明 BMVC-8C3O 所 引起的區域效應 (local effect)沒有受到明顯的影響。考量 40% (v/v) PEG，其濃度 大約是 2M，而相對 DNA 五個當量的 BMVC-8C3O，其濃度約在 10^-4M；由此可 知 PEG 溶劑效應是經由產生整體溶液變化影響到 DNA 結構，而 BMVC-8C3O 區域效應則是經由作用在 DNA 周遭環境，進而影響到 DNA 結構。

BMVC-8C3O 在定溫下可以將非平行四股結構轉換成平行四股結構，圖 4.10 顯示不同的端粒非平行四股結構的 imino-proton NMR，在 37℃隨著時間變化，

經過 12 小時後與 Anneal 的光譜結果一致，所以 BMVC-8C3O 引起的區域效應是 可以將非平行四股結構經由 kinetic-driven process 轉換成平行四股結構。

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(a)

(b)

圖 4.8 (a) Imino-proton NMR 光譜，100

M TA-HT21 在 K

⁺ 150mM 條件下，

40% (w/v) PEG200 條件下 (lower)、加入五倍當量 BMVC-8C3O (middle)、與 100

M TA-HT21 在 K

⁺ 150mM 條件下直接加入五倍當量 BMVC-8C3O 後經加熱回 溫 (upper)。(b) 100

M TA-HT21 在 K

⁺ 150mM 條件下，分加入 40% (v/v) PEG 與五倍當量 BMVC-8C3O 後經加熱回溫，稀釋 25 倍之後成 4

M 在 37℃下的

CD 光譜，PEG (綠)、8C3O (黑)，放置 12h 後 CD 光譜，PEG (藍)、BMVC-8C3O (紅)。

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(a) (a)

(a)

D

圖 4.9 (a) TA-HT21, (b) HT21-T, and (c) 22CTA imino-proton NMR 光譜 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-8C3O 在 37℃下，隨時間變化 (2, 4, 6, 12h) 與加熱回溫處理。

HT21

BMVC-8C3O (anneal)

PEG

PEG +BMVC-8C3O PEG

PEG +BMVC-8C3O BMVC-8C3O (anneal)

A-HT21

HT21-T

PEG

PEG+BMVC-8C3O BMVC-8C3O (anneal)

22CTA

PEG +BMVC-8C3O

PEG

BMVC-8C3O (anneal)

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進一步我們比較結構上的穩定性，圖 4.11a 是示差掃描量熱儀 DSC 的結果 分別是 TA-HT21 非平行四股結構與分別用 PEG、TEG、及 BMVC-8C3O 轉換的 平行四股結構。TA-HT21 的非平行四股結構之解旋溫度(Tm)是 70℃，經過 TEG 或 PEG 加熱回溫轉換的平行四股結構的解旋溫度提升到 96℃，而 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構，不論是經由放置 37℃(overnight)或加熱回溫都大幅的提升 至約 115℃，另外比較利用 CD melting 的方法 (圖 4.11b)，TA-HT21 之非平行四 股結構的解旋溫度是 67℃，而 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構遠大於 95℃，

顯示 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構，其解旋溫度高於 100℃的穩定性，與非 平形四股結構的解旋溫度相差約 45℃，比 PEG 轉換的平行四股結構也高了約 20

℃，可能是由於 BMVC-8C3O 同時保留了四股穩定劑的特性，即π-πstacking 作用及正價陽離子與 DNA 骨架上的負電磷酸鹽的庫倫作用力，更進一步提高了 解旋溫度。

由於低鉀離子濃度情況下 G-四股結構是比較不穩定的，因此我們檢測低濃 度的鉀離子溶液中，BMVC-8C3O 是否還能增加如此高的穩定性，在鉀離子 5mM 溶液中，TA-HT21 非平行四股結構的 Tm 約 45℃，經由 BMVC-8C3O 轉換的平 行四股結構的 Tm 約 97℃，大幅提升了約 52℃(圖 4.11c)，所以 BMVC-8C3O 更 加穩定在低鉀離子濃度的四股結構。我們測試在在鉀離子 150mM 溶液中，不同 端粒四股結構，經過 BMVC-8C3O 轉換之後的穩定性 (圖 4.12)可以發現解旋溫 度大約都在 70℃，經由 BMVC-8C3O 作用後都大幅提升至約 115℃。

所以 BMVC-8C3O 不僅能夠轉換不同的非平行端粒四股結構成為同樣的平 行四股結構，更提升了結構的熱力學穩定性。因此我們成功了應用 PEG 的溶劑 效應到端粒四股穩定劑 BMVC 上，將溶劑效應應用在小分子的區域效應。

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(a)

(b)

(c)

圖 4.11 (a) DSC 結果，TA-HT21 在 K⁺ 150mM 條件下(黑)，加入 40% (v/v) TEG 加熱回溫 (藍)、加入 40% (v/v) PEG 加熱回溫 (淺藍)、加入 BMVC-8C3O 五倍 當量，37℃下放置 12h (紅)、加入五倍當量 BMVC-8C3O 後加熱回溫(綠)。(b) CD 265nm melting 光譜，TA-HT21 在 K⁺ 150mM 條件下(黑)、加入 BMVC-8C3O 五 倍當量，37℃下放置 12h (紅)。(c) DSC 結果，TA-HT21 在 K⁺ 5mM 條件下(黑)，

加入 BMVC-8C3O 五倍當量，37℃下放置 12h (紅)。

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BMVC-8C3O 與較長的人類端粒序列 HT48 作用

由於人類端粒單股部分長度約 50-200base，因此有機會可以形成一個以上的 G-四股結構，我們進而測試 BMVC-8C3O 是否有也可以應用到長的端粒序列上。

圖 4.13 是 BMVC-8C3O 作用 HT48 的結果，HT48 共有 8 個重複 TTAGGG，所 以有機會形成兩個 G 四股結構。圖 4.13a 顯示 HT48 的 CD 光譜是以 295nm 為主 的訊號，說明 HT48 保有非平行四股結構的特性，加入十倍當量 BMVC-8C3O，

在 37℃下隨時間觀測光譜變化，發現 12 小時後與加熱回溫後都變成以 265nm CD 訊號為主的平行四股結構，利用 NMR 光譜來觀察 imino-proton 的變化，雖然 HT48 在 PEG 的結構沒有被解出，但是從圖 4.13b 發現 HT48 在 40% (v/v) PEG 條件下 的 imino-proton 光譜仍然類似 Phan 團隊解出平行螺旋型四股結構的光譜，推測 HT48 在 PEG 條件下也形成平行螺旋型四股結構，同樣的利用 PEG 已轉換的平 行四股結構 imino-proton 光譜將等量的 BMVC-8C3O 加入 (middle)，發現訊號位 置與直接用 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構光譜 (upper)類似，BMVC-8C3O 可以將較長的人類端粒非平行四股結構轉換成平行四股結構。

另外圖 4.13c 用 DSC 測得 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構穩定性，由於 四股結構越長穩定性會下降，是因為亂度的降低，所以 HT48 在鉀離子溶液下約 解旋溫度只有 61℃，低於先前所提到的不同端粒四股結構，但經由 BMVC-8C3O 轉換成平行四股結構的解旋溫度卻也高達 115℃以上。

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(a)

(b)

(c)

圖 4.13 (a) CD 光譜，HT48 在 K⁺ 150mM 條件下(黑)，加入 BMVC-8C3O 十倍 當量經過 2 h (紅)、12 h (綠)、與加熱回溫 (藍)。(b) Imino-proton NMR 光譜，HT48 在K⁺ 150mM 條件下(lower)、加入 40% (v/v) PEG 後加熱回溫 (middle-L)、加入 40% (v/v) PEG 加熱回溫後再加入十倍當量 BMVC-8C3O (middle-U)、加入十倍當 量 BMVC-8C3O (upper)。(c) DSC 結果，HT48 在 K⁺ 150mM 條件下(黑)與加入 BMVC-8C3O 十倍當量，37℃下放置 12h (紅)。

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以不同 BMVC 小分子討論 BMVC-8C3O side-chain TEG 的影響

為了確認 BMVC-8C3O 的功能是由於鍵接 TEG (tetraethylene glycol)的作用， 平行結構相似。同樣的 imino-proton NMR (圖 4.15b)顯示在 37℃下 (overnight)，

結構沒有完全被轉換，仍保留部分加入 BMVC-8C 2 小時後的訊號。另外 PAGE (圖 4.15c)也顯示加入 BMVC-8C，只有部份的四股結構被轉換，但轉換後結構的 位置比較高。進一步利用 Ultracentrifugation (圖 4.15d)來鑑定經由 BMVC-8C 轉 換的四股結構分子量，發現加入 BMVC-8C 後的 TA-HT21 產物有 dimer、trimer、

與 tetramer，且這些 high-order 產物占了 85%以上。由此可知 BMVC-8C 可以將 TA-HT21 的非平行結構轉換成 high-order 的四股結構。

進而比較 BMVC-6C2O，圖 4.16a 的 CD 光譜顯示加入 BMVC-6C2O 的 TA-HT21 在 37℃下 (overnight)與加熱回溫後所產生的訊號相同，且特徵為平行 的四股結構；而 imino-proton NMR (圖 4.16b)顯示在 37℃下 (overnight)與加熱回 溫後所產生的訊號也相同，甚至與 BMVC-8C3O 的訊號幾乎是一樣。PAGE (圖 4.16c )也顯示在 37℃ (overnight)後，可以將原本的 band 轉移至比較高的 band 位置，而經過 Ultracentrifugation (圖 4.16d)來鑑定 BMVC-6C2O 轉換後的產物，

主要是 monomer，所以 BMVC-6C2O 與 BMVC-8C3O 是具有相同的特性。

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N N

I

N I

I

N

N N

I

O

O

N I

I

圖 4.14 BMVC-8C (左圖)，BMVC-6C2O (右圖)

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(a) (b)

(c) (d)

圖 4.15 (a) CD 光譜，TA-HT21 端粒四股結構在 K⁺ 150mM 條件下 (黑線)、加 入 5 當量 BMVC-8C，在 37℃下放置 12hr (紅線)、再經過加熱回溫 (綠線)。(b) Imino proton NMR 光譜，TA-HT21 在 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-8C，

在 37℃下放置 2 h (bottom), 12 h (middle), 和經過加熱回溫 (upper)。(c) PAGE 實 驗， TA-HT21 在 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-8C，25℃ overnight (1) 和 37℃ overnight (2). (d) Ultracentrifugation 實驗，1 M TA-HT21 在 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-8C，經過加熱回溫處理。

- 79 - BMVC-6C2O，在 37℃下放置 2 h (bottom)、12 h (middle)、和經過加熱回溫 (upper)。

(c) PAGE 實驗，TA-HT21 在 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-6C2O，25

℃ overnight (1)和 37℃ overnight (2). (d) Ultracentrifugation 實驗，1 M TA-HT21 在 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-6C2O，經過加熱回溫處理。

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先前提到 BMVC-8C3O 具有將不同的非平行四股結構 imino-proton NMR 訊 號轉換成類似的訊號，所以我們將 BMVC-8C3O、BMVC-6C2O 與 BMVC-8C 將 三個不同結構的非平行四股結構 TA-HT21、CTA22 與 HT21-T 作用，比較它們 訊號上的異同，發現 BMVC-8C3O 與 BMVC-6C2O 具有一樣的訊號，即使是缺 少 5 端 flanking base 的 HT21-T (圖 4.17b)也相同，而 BMVC-8C 皆有很寬的訊號，

且欠缺清楚單一結構的 imino-proton 訊號。另外 BMVC-8C3O 與 BMVC-6C2O

且欠缺清楚單一結構的 imino-proton 訊號。另外 BMVC-8C3O 與 BMVC-6C2O

在文檔中 探討人類端粒四股結構的結構轉換機制 (頁 67-0)