結論

我們利用 site-specific

¹⁵N isotope labeling 的方法搭配 NMR 技術，定出了 TA-HT21 在鈉離子條件下結構為第一種混合型四股結構，與在鉀離子條件下結 構相同，進一步鈉、鉀轉換過程主要是離子交換，其中交換機制是因此一步一步 的置換過程，而且是從上層先被換掉，再換掉下層(圖 3.13)，另外由動力學及熱 力學方法，說明了一但加入鉀離子，不論是動力學或熱力學穩定性都鉀離子相同。

結果顯示，在鈉、鉀轉換過程所造成的光譜轉換，不能代表結構結構轉換，而且 CD 光譜 295nm 與 265nm 的訊號是如何對應四股結構的位置或特徵，目前仍不 能完整的解釋，因此不能由 CD 光譜上的改變去說明鈉/鉀轉換的過程。

另外我們利用互補 DNA 的實驗測量解旋的時間，發現不論在鈉或鉀離子 中解旋時間都需要數十分鐘至數百分鐘。即使是從平衡狀態的角度來看，四股結 構在鈉離子條件下，大幅解旋的時間至少需要 20 分鐘，所以鈉/鉀離子在 A-HT21 中的快速轉換過程，應該不會是經由一個大幅解開四股結構的過程，這個結果解 釋了先前我們實驗室所觀察到的現象，即 BMVC 的 induced CD 光譜並沒有在離 子轉換過程中有改變 ⁸¹，另外也呼應了 Fegion 團隊的觀點 ⁷⁹，這項研究指出人 類端粒序列的選取在結構上的影響是相當大的，可，由於人類端粒四股結構是相 當複雜，利用不同序列或變異的序列來推測其他序列的四股結構是需要格外謹慎 的，否則極有可能誤導端粒四股結構在不同環境下的動力學研究。

我們的結果提供了人類端粒四股結構鈉/鉀轉換主要的機制，是由於鈉/鉀離 子逐一的置換過程，未來可以應用四股結構在生物上活性的解釋⁸⁵，另外也可以 進一步在材料上的應用例如人造 ion Channel^24,25。

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(a) (b)

圖 3.10 (a) TA-HT21 端粒四股結構的 imino-proton NMR ( Bruker 800MHz)光譜 25℃，在 Na⁺ 150 mM 條件下(下圖) 、加入 K⁺ 150mM 後 30min、放置 overnight (24hr、加熱後回溫與在 K⁺ 150 mM 條件下(上圖)。(b)TA-HT21 端粒四股結構 H8-H’1 NOE 光譜 25℃，在 Na⁺ 150 mM 條件加入 K⁺ 150mM 後 30min(藍線)、

在 KCl 150 mM 條件下(紅線)。

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(a) (b)

圖 3.11 (a) TA-HT21 端粒四股結構 imino-proton NMR (Bruker 500MHz)光譜，在 Na⁺ 150 mM 條件 25℃下(黑線)，分別加入 K⁺ 2 mM、5 mM、10 mM、15 mM、

20 mM、30 mM、45 mM、60 mM、75 mM 、120mM 與 150 mM 條件下(綠線)。

(b) TA-HT21 端粒四股結構鈉鉀離子共存示意圖

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圖 3.13 TA-HT21 端粒四股結構 鈉、鉀離子交換機制示意圖。

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第四章

利用 PEG 溶劑效應設計新型小分子四股結構轉換劑

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4.1 簡介

分子擁擠效應(molecular crowding effect)在四股結構的研究

研究生化及生物物理的人經常在in vitro的情況下研究生物分子的結構及其 作用。然而在細胞內的環境是比較擁擠的，有多樣的biomolecules，例如: DNA、

RNA、protein、lipid與polysaccharides等大分子，這些大分子含量有50-400g/L，

且至少佔整體體積20~40%(v/v)^86,87，因此提出需要考慮molecular crowding所造成 的影響。M Minton等人利用polyethylene glycol (PEG)、dextran、與Ficoll等低活 性的大分子來模擬生理條件下的環境，研究其生化及生物物理，討論分子擁擠效 應分子擁擠效應(molecular crowding effect)所造成的影響^88,89。Suigmoto等人首先

利用分子擁擠效應模擬生理條件來研究 DNA結構及穩定性⁹⁰，他們發現由

Hoogsteen bond 形成的G-四股結構在PEG 2M(~40%v/v)條件下穩定性上升(圖 4.1) ^91,92，而Watson-click bond形成的雙股螺旋結構在此條件穩定性下降^91,93-95， 同時指出PEG是利用dehydration 效應來影響DNA穩定性⁹²，另外還有發現除了 PEG以外之小分子cosolute ^91,94也可以造成與PEG類似的效應，例如PEG的單體 ethylene glycol、glycerol、ethanol或將其-OH 團隊修改-OCH3(圖 1.13)也有同樣 的作用^91,92,94。

圖 4.1. Suigmoto 團隊利用 PEG 效應及小分子 cosolute 影響四股結構穩定性

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Tan 團隊⁹⁶ 接者分別研究人類端粒四股結構在 PEG 分子擁擠效應下的影響，

發現結構與沒有在 PEG 中有很大的差異，在鉀溶液中隨者 PEG 比例的增加，發 現 CD 光譜 265nm 訊號隨之增加，而 295nm 隨之下降，並且在 PAGE 電泳的實 驗看到 DNA mobility 變慢(圖 4.2)，懷疑在 PEG 分子擁擠效應下可能有不同的 四股結構產生，並且推測可能是 S. Neidle 團隊利用 X-ray 結晶解出來的平行螺 旋型四股結構。

Chaires 團隊用小分子溶劑 Acetonitrile，提出 dehydration 效應扮演四股結構 穩定的角色，呼應先前 Sugimoto 的結論，但他們根據 NMR 的實驗發現醣基扭 轉角度並非都是反側(anti)(圖 1.5)，而平行螺旋型四股結構卻是反側(anti)，所以 並不認為 PEG 或 Acetonitrile 會造成平行螺旋型四股結構的產生，另外，用大量 的 BSA 300 mg/ml 產生分子擁擠效應模擬生理條件發現其 NMR 光譜與沒有加 BSA 的光譜類似，認為分子擁擠效應並不會產生平行螺旋型四股結構⁹⁷。

圖 4.2 Tan 團隊⁹⁶利用 PEG 分子擁擠效應，研究人類端粒四股結構 HT21:d(G3TTAG3TTAG3TTAG3)在鉀離子溶液條件。

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2011 年 A.T. Phan 團隊⁹⁸利用 site-specific isotope labeling ¹⁵N 搭配 NMR 發 現了現有的人類端粒非平行四股結構在 40% (v/v) PEG 條件下皆會轉變成平行的 結構 (圖 4.3)，與先前 S. Neidle 團隊利用 X-ray 結晶解出來的平行螺旋型結構 相似，也指出除了 40% PEG 以外先前所提及的 40%v/v 小分子溶劑 ethanol、

DMSO、 ethylene glycol、Acetonitrile 皆可以將非平行四股結構轉變成平行螺旋 型的結構 他們用 40%v/v ethanol 非平行中的混和型四股結構與平行螺旋型四股 結構計算的結果發現平行的結構在 4Å 的範圍會有 water-depletion 的現象而非平 行中的混和型四股結構在 4Å 的範圍會有 water-uptake 的現象，也提供 dehydration 效應在四股結構上有重要的作用。

這項在分子擁擠效應的結果似乎暗示人體內的端粒四股結構很有可能是與 先前 Neidle 團隊利用 X-ray 結晶解出來的平行螺旋型一致 ⁴⁴，但實際生理情況 下，果真是以平行四股結構存在嗎?

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圖 4.3 Phan 團隊利用 NMR 解出人類端粒四股結構 TAG₃(T₂AG₃)₃ 在 40%PEG 為平行螺旋型結構⁹⁸

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Dőtch 團隊 ⁹⁹進一步模擬生理條件(圖 4.4)，利用大分子 Ficoll 與 Xenopus laevis egg extract 產生分子擁擠效應(molecular crowding effect)，發現其 NMR 光 譜與 PEG 的光譜並不相同，另外利用 In-cell NMR ¹⁰⁰將非平行四股結構 HT21-T 注入 Xenopus laevis oocyte 中，其光譜也與 A.T.Phan 團隊解出 40%(v/v)PEG 的 不相同，結果顯示在實際的生理條件下，人類端粒的四股結構依然存在有多樣性，

進而指出 PEG 具有特定的功能，並不適合用於模擬生理條件。這些研究結果提 供了在研究四股結構重要的資訊，特別是 dehydration 效應在端粒四股結構的穩 定性與專一性扮演關鍵角色，這些 localized 的水分子具有影響端粒四股結構的 能力。

圖 4.4 Dőtch 團隊⁹⁹利用 Ficoll 與 Xenopus laevis egg extract 模擬生理條件，

證明實際情況並非只有平行螺旋型結構。

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4.2 研究動機

人類端粒 DNA 的四股結構具有相當多種結構，這種多樣性使得以四股結構 為標靶藥物的設計更顯困難，專一性作用在特定四股結構的方式可能無法適用在 其他構型，而且四股穩定劑設計的概念大部分以分子與 G-quartet 平面以-

interaction 為主要的 end-stacking 作用和 DNA 帶負電的磷酸根骨架藉由正負電荷 的庫倫作用力結合，因此我們嘗試針對人類端粒 DNA 的四股結構多樣性，設計

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圖 4.5 BMVC 考慮 PEG 效應設計出 BMVC-8C3O 示意圖

- 63 - 在(10-12ppm) 左右，可以發現加入五倍量 BMVC-8C3O 後，HT24 的 imino-proton 有明顯的往右移動，是由於 BMVC-8C3O 結合 HT24 造成 imino-proton 受到遮蔽 效應 (shielding effect)。但隨者時間變化 imino-proton 訊號還是有改變，而是訊 號上消張，經過 12 小時變化與加熱回溫的訊號相同，且與 CD 結果一致。另外 圖 4.6d 的 PAGE 實驗發現五倍的 BMVC-8C3O 與 HT24 作用放置在 25℃

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(overnight)、37℃ (overnight)、與加熱回溫處理 (Annealing)，有不同的 gel band shift；放置在 25℃ (overnight)的跑膠顯示兩個 bands，而 37℃ (overnight)與加熱 回溫處理的跑膠都顯示一個移動較慢的 band，顯示有兩個不同的結構。同樣在 Tan 團隊也觀察到 PEG 中有兩個結構的 band shift ⁹⁶，所以比較先前 CD 與 NMR 的結果，這兩個不同的結構可能由原本 HT24 的非平行四股結構轉換成平行螺旋 型四股結構，實驗結果證明五倍當量的 BMVC-8C3O 似乎具有與 40% (v/v) PEG 一樣的特性。

BMVC-8C3O 與不同端粒四股結構作用

Phan 團隊⁹⁸證明了 PEG 可以將不同的人類端粒四股結構轉換成相同的平行 四股結構。為了測試 BMVC-8C3O 是否具有一樣的能力，我們使用相同於 Phan 所報導的序列：TA-HT21 混和型四股結構、A-HT21 具有兩種以上非平行結構、

CTA22 椅型四股結構、HT21-T 反平行兩層籃型四股結構、與 HT21 非平行四股 結構，圖 4.7 結果顯示此五種 DNA 的 imino-proton NMR 與文獻報導相同⁹⁸，且 CD 光譜都是以 295nm 為主要訊號，在加入五倍當量的 BMVC-8C3O 加熱回溫處 理之後 CD 光譜皆變為 265nm 為主的訊號，imino-proton NMR 也發現 TA-HT21、

A-HT21 及 CTA22 具有類似的訊號峰，與 Phan 發現結果相同，而 HT21-T 與 HT21 有類似的訊號，但與前三個序列不同，推測可能是 HT21-T 與 HT21 在 5'端沒有 格外的鹼基。

雖然 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構的 imino-proton 訊號與 Phan 所報導 的 PEG 轉換的平行四股結構不相同，但由圖 4.7 可知 BMVC-8C3O 能將不同端 粒四股結構轉換成類似的 NMR 訊號，這與 PEG 的結果有相當的一致性。

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(a) (b)

(c) (d)

圖 4.6 (a) 不同當量 BMVC-8C3O 與 HT24 四股結構作用之 CD 光譜在 K⁺ 150mM 條件下 (實線 25℃放置 2h，虛線加熱至 95℃約 10min 後再以 1℃/min 降 回 25℃)，(b) 五倍當量 BMVC-8C3O 與 HT24 作用在 37℃下不同時間 CD 光譜，

(c) 五倍當量 BMVC-8C3O 與 HT24 作用在 37℃下不同時間 NMR 光譜，(d) 五 倍當量 BMVC-8C3O 與 HT24 作用放置在 1. 25℃ (overnight), 2. 37℃ (overnight) 3. Annealing 處理 (加熱至 95℃約 10min 後再以 1℃/min 降回 25℃)的跑膠圖。

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(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

圖 4.7 (左) 不同人類端粒序列在 150mM K⁺溶液中 (黑線)與加入五倍當量 BMVC-8C3O 後加熱回溫 (紅線)的 CD 光譜，(右) 相對應序列 (lower)與加入五 倍當量 BMVC-8C3O 後加熱回溫 (upper)的 imino proton NMR 光譜。

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圖 4.8a 比較 BMVC-8C3O (upper)與 PEG (lower)對 TA-HT21 所轉換的平行 四股結構之 NMR 訊號，確實有明顯差異，可能是 BMVC-8C3O 作用在四股結構 所造成的遮蔽效應。為了驗證此遮蔽效應，我們將等量的 BMVC-8C3O 加入 PEG 已轉換的平行四股結構，根據其 imino-proton NMR 光譜 (middle)，發現訊號位 置與直接用 BMVC-8C3O 轉換的平行四股結構光譜 (upper)類似，雖然光譜波峰 有寬化的現象，但是整體訊號是相當一致的，另外我們比較不同端粒序列的結果，

圖 4.9 顯示結果具有一致性，因此我們相信 BMVC-8C3O 可以將人類端粒序列 由不同的非平行四股結構轉換成相類似的平行四股結構。

PEG 的溶劑效應與 BMVC-8C3O 小分子區域化效應

PEG 溶劑效應是經由 DNA 水合的程度造成影響，已知稀釋 PEG 濃度會使轉

變後的平行結構再變回原本的非平行四股結構⁹⁸，將該溶液稀釋 25 倍，在 37℃

經過 12 小時後，圖 4.8b 的 CD 光譜顯示平行四股結構的 265nm 降低，而非平行 四股結構的 295nm 增強。同樣地我們也用稀釋實驗來測試 BMVC-8C3O，發現 經過 12 小時之後，265nm 為主的 CD 訊號幾乎沒有改變，說明 BMVC-8C3O 所

經過 12 小時後，圖 4.8b 的 CD 光譜顯示平行四股結構的 265nm 降低，而非平行 四股結構的 295nm 增強。同樣地我們也用稀釋實驗來測試 BMVC-8C3O，發現 經過 12 小時之後，265nm 為主的 CD 訊號幾乎沒有改變，說明 BMVC-8C3O 所

在文檔中 探討人類端粒四股結構的結構轉換機制 (頁 56-0)