G-四股結構穩定劑 G- QUADRUPLEX STABILIZER

Zahler 等人 ^36,37提出四股結構可以用來抑制端粒酶之後，Hurley 與 Neidle 等人進一步設計第一個 2,6-diamidoanthraquinone 小分子⁵⁷ (圖 1.11)，以穩定端 粒四股結構為出發點來抑制端粒酶延長，使得人類端粒四股結構可以成功作為一 個癌症的標靶，陸續地一直到最近都許多具有療效的四股穩定劑被設計出，其中 有一些是比較常來被拿來做研究(圖 1.11)，例如以 photodynamic therapy 的藥物 Porphyrin 為主要結構 TMPYP4⁵⁸ 除了可以作用端粒的四股結構，對 c-myc oncogene promoter 的四股結構¹⁰也有很好的作用性質可以抑制其下游表現。第一 個 用 模 擬 預 測 與 四 股 結 構 作 用 的 Perylene 隨 後 設 計 出 的 Perylene 衍 生 物 PIPER(perylene diimide)⁵⁹利用 NMR 證實作用在四股結構 G-quartet 平面上。從鏈 菌類 Streptomyces anulatus 3533-SV4 中分離得到的天然物 Telomestatin⁶⁰，對端粒 四股結構有專一的作用結構可以提升解旋溫度 30℃且具有良好的端粒酶抑制果 效。 Neidle 團隊根據 2,6-diamidoanthraquinone 後續設計出的 Braco-19⁶¹， Braco-19 進一步被 X-ray 解出與端粒四股結構形成 complex⁶²，Braco-19 利用 end-stacking mode 在 G-quartet 平面上，且能使四股結構大幅提升解旋溫度 27.5

℃。 Mergny 團隊設計以 quinacridine dimer 為衍生物的 BOQ3 可以提升四股結 構解旋溫度 28℃⁶³。 Balasubramanian 團隊設計出以 pyridostatin 為 core 的 Tel 1 小分子更可以提升 35℃，且進一步抑制端粒酶活性，影響端粒周邊的 protein Pot1 (protect of telomeres 1 )造成癌細胞產生 DNA damage signal⁶⁴。 我們實驗室是以 小分子 carbazole 為 core 合成出 3,6-bis(1-methyl-4-vinylpyridinium) carbazole diiodide (BMVC)有機小分子⁶⁵，與 DNA 作用後其螢光會增強 100 倍⁶⁶成為重要 的螢光探針分子，而且同時具有穩定 G 四股結構的能力也可以抑制端粒酶的活 性⁶⁷。

除了上述提到的之外，還有很多小分子路續被設計出作為四股結構穩定劑

68,69但大部分主要的作用是與 G-quadruplex 外側的 G-quartet 平面以- interaction

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Telomestatin

Tel1

NH

N N

I I

BMVC

為主要的 end-stacking 作用模式(圖 1.12) ^68,69；同時，兩端的正電荷會和 DNA 帶 負電的磷酸根骨架藉由正負電荷的庫倫作用力，讓分子嵌在 G-quadruplex^68,69。 從早期研究中發現，此類分子大多能增加 G-quadruplex 的熱穩定性³⁷。

圖 1.11 G-四股結構穩定劑 (G-quadruplex stabilizer) ^68,69 2,6-diamidoanthraquinone

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圖 1.12 G-四股結構穩定劑 BSU6039 與四股結構作用 end-stacking 作用之 X-ray 結構^68,69

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- 17 -

第二章

實驗方法

- 18 -

-CCCCCCCC-- 19 -CCCCCCCC--

- 20 -

1:3)。 將 4 a 與 過 量 的 C H₃I 在 DMF 中 一 同 回 流 後 ， 所 得 橘 紅 色 粉 末 即 為 目 標 產 物，即 N-9 位 置 經 取 代 之 BMVC 衍 生 物 BMVC-8C3O，其 產 率 及 NMR 資 料 如 下 ：

BMVC-8C3O:

3,6-Bis(1-methyl-4-vinylpyridium iodide)-9-(1-(1-methyl-piperidinium iodide)-3, 6,9-trioxaundecane) carbazole (Yield: 86%, mp > 300℃),

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.80 (d, J = 6Hz, 4H), 8.68 (s, 2H), 8.23 (d, J = 16Hz, 2H), 8.20 (d, J = 7.2Hz, 4H), 7.90 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8.4Hz, 2H), 7.59 (d, J = 16Hz, 2H), 4.64 (t, 2H), 4.24 (s, 6H), 3.82 (t, 2H), 3.71 (t, 2H), 3.47 (m, 4H), 3.38 (m, 10H), 2.97 (s, 3H), 1.67 (m, 4H), 1.43 (m, 2H).

13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ : 153.32, 145.24, 142.68, 142.28, 127.63, 127.21, 123.37, 123.14, 121.58, 121.04, 111.47, 70.48, 70.05, 69.87, 69.83, 63.87, 61.24, 47.21, 20.88, 19.71

另 一 個 N-9 位 置 經 取 代 之 BMVC 衍 生 物 BMVC-6C2O 和 BMVC -8C 亦 可 使 用 上 述 流 程 得 出 ， 但 其 製 程 中 的 反 應 物 Br-R -Br 中 的 R=-CCOCCOCC-。 BMVC-6C2O 之 產 率 及 NMR 資 料 如 下 ：

BMVC-6C2O:

3,6-Bis(1-methyl-4-vinylpyridium iodide)-9-(1-(1-methyl-piperidinium iodide)-3,

6-dioxaoctane) carbazole (Yield: 83%, mp > 300 ℃ ),

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.81 (d, J = 6Hz, 4H), 8.68 (s, 2H), 8.23 (d, J = 16Hz, 2H), 8.21 (d, J = 7.2Hz, 4H), 7.92 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.76 (d, J = 8.4Hz, 2H), 7.58 (d, J = 16Hz, 2H), 4.68 (t, 2H), 4.33 (s, 6H), 3.85 (t, 2H), 3.68 (t, 2H), 3.51 (m, 2H), 3.42 (m, 6H), 2.99

- 21 -

(s, 3H), 1.67 (m, 4H), 1.43 (m, 2H).

13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ : 153.32, 145.30, 142.45, 142.38, 127.58, 127.21, 123.32, 123.52, 121.68, 122.44, 111.47, 70.38, 70.25, 69.97, 69.88, 63.92, 61.35, 48.20, , 20.71, 19.66

BMVC-8C:

3,6-Bis(1-methyl-4-vinylpyridium iodide)-9-(1-(1-methyl-piperidinium iodide) octyl) carbazole (Yield: 90%, mp > 300℃),

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:

8.82 (d, J = 6.4Hz, 4H), 8.63 (s, 2H), 8.20 (d, J = 6.4Hz, 4H), 8.19 (d, J = 16Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.4Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.4Hz, 2H), 7.55 (d, J = 16Hz, 2H) 4.48 (t, 2H), 4.24 (s, 6H), 3.25 (m, 6H), 2.94 (s, 3H),1.80 (m, 2H), 1.73 (m, 4H), 1.59 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.30 (m, 4H), 1.24 (m, 4H).

13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ : 153.29, 145.26, 142.35, 142.28, 127.53, 127.30, 123.34, 123.07, 121.66, 121.02, 111.12, 60.32, 47.18, 28.98, 28.84, 26.75, 26.16, 21.27, 21.07, 19.66

Br-R-Br 的 合 成

HO-R-OH（ 0.5mol e， R =-CCOC COCC OCC -or-CC OCCOC C -） 在 4℃

冰 浴 慢慢加入 0.5mole PBr3 (in CHCl3 20ml) 1 小時之後 混和物加熱至 50-60 °C 12 小時之後降至室溫加入 CH2Cl2 (40 ml)再慢慢小心加入 NaHCO3 0.1M 10ml 中 和過量的 PBr3 用等量的水與 CH2Cl2萃取 取有機層加入之 後 以 MgSO4 進 行 乾 燥 過 濾 後 將 其 迴 旋 濃 縮 以 快 速 管 柱 silica gel 進 行 層 析 純 化 沖 提 液 其 沖 提 液 為 正 己 烷 濃 縮 得到 10ml 無色液體 yield 80-90%.

3, 6-dioxaoctane-1,8-dibromide ( n = 2),

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.47 (t, 4H), 3.68 (s, 4H), 3.85 (t, 4H).

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DNA sample

實驗所用 DNA sample 由 Bio Basic Inc.訂購。配置 DNA 使用的緩衝溶液為 10 mM Tris-HCl，150 mM KCl（pH 7.5）。寡核苷酸混合緩衝溶液後，於 95℃加 熱五分鐘後緩慢降於室溫，保存在 4℃冰箱隔夜後再使用。DNA 濃度利用吸收 光譜儀測量 260 nm 吸收值（O.D.）定出 DNA 濃度。本實驗所用 DNA 序列如下。

DNA 序列 縮寫

5’-G3TTAG3TTAG3TTAG3 HT21 5’-G₃TTAG₃TTAG₃TTAG₃T HT21-T 5’-AG3TTAG3TTAG3TTAG3 A-HT21 5’-TAG₃TTAG₃TTAG₃TTAG₃ TA-HT21 5’-AG3CTAG3CTAG3CTAG3 CTA22

5’-(TTAGGG)₄ HT24

5’-(TTAGGG)8 HT48

含有¹⁵N isotope labeling 的 DNA 是利用

Dr. Oligo® -96(Azco Biotech, Inc. USA) 採用固相亞磷醯胺三酯法合成(

Solid phase phosphoramidite DNA synthesis)

。亞磷醯 胺三酯法合成(

phosphoramidite DNA synthesis)⁷⁰，

將 DNA

核苷酸

(

nucleoside)

固 定在固相載體 CPG (

controlled pore glass

)上完成 DNA 鏈的合成的，合成的方向是 由待合成引子的 3' 端向 5' 端合成的，相鄰的 DNA 核苷酸

nucleoside

通過 3' → 5' 磷酸二酯鍵(phospordiester)連接，具體反應步驟如圖 2.2。

第一步：Detritylation

將預先連接在固相載體 CPG

(

controlled pore glass

)

上的活性基團被保護的核苷 酸

(

nucleoside) 與三氯乙酸(DMT)反應，脫去其 5'- OH 基團的保護基團三氯乙酸

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(DMT) ，獲得游離的 5'- 羥基。

第二步：Activation and Coupling

亞磷醯胺(phosphite-triester) 保護的核苷酸(nucleoside)單體，與活化劑四氮唑 (tetrazole)混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的 3' 端被活化，與 CPG 載體 上連接鹼基的 5'- OH 基團發生縮合反應。

第三步：Capping

縮合反應中會有少量 5'- OH 基團沒有參加反應，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑封閉 5'- OH 基團，使其不能再繼續發生反應，這種短片段在純化時可以分離去除。

第四步：Oxidation

在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。

經過以上四個步驟，一個去氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙 酸脫去它的 5'- OH 基團上的保護基團三氯乙酸(DMT)，重複以上步驟，直到所 有要求合成的鹼基被接上去，再把去氧核苷酸從固相載體切下。

- 24 -

圖 2.2 固相亞磷醯胺三酯法合成

流 程 圖

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帶有(95%以上)的

¹⁵N isotope labeling G

亞磷醯胺

核苷酸(dG- phosphoramidite)，

與不含¹⁵N isotope G

亞磷醯胺

核苷酸(dG- phosphoramidite)，配置成 6%¹⁵N isotope labeling G

亞磷醯胺

核苷酸(dG- phosphoramidite)，再選擇的 DNA 序列作標定合 成的序列如下: (*代表有 6% ¹⁵N isotope 的 G 鹼基)

DNA 序列 縮寫

5’-TAG*GGTTAGGGTTAGGGTTAGGG TA-HT21-G3 5’-TAGG*GTTAGGGTTAGGGTTAGGG TA-HT21-G4 5’-TAGGG*TTAGGGTTAGGGTTAGGG TA-HT21-G5 5’-TAGGGTTAG*GGTTAGGGTTAGGG TA-HT21-G9 5’-TAGGGTTAGG*GTTAGGGTTAGGG TA-HT21-G10 5’-TAGGGTTAGGG*TTAGGGTTAGGG TA-HT21-G11 5’-TAGGGTTAGGGTTAG*GGTTAGGG TA-HT21-G15 5’-TAGGGTTAGGGTTAGG*GTTAGGG TA-HT21-G16 5’-TAGGGTTAGGGTTAGGG*TTAGGG TA-HT21-G17 5’-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG*GG TA-HT21-G21 5’-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG*G TA-HT21-G22

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吸收、螢光光譜儀.

吸收光譜儀（HELIOSα, Thermo Fisher Scientific, USA）測得吸收光譜，另外 DNA 可藉由 260 nm 吸收定出濃度。螢光光譜儀（LS-55, PerkinElmer, USA）with 2 nm band-pass，室溫下，以一公分石英比色管測得螢光光譜。

CD 光譜儀

旋光光譜儀（Jasco J-815 spectro-polarimeter, Japan），室溫下 bandwith 2nm，

掃瞄速度 50 nm/min，step resolution 為 0.2 nm，設定量測十次取平均，利用旋光 光譜儀可得 CD 光譜（210 ~ 350 nm，for DNA structure），melting temperature

（10 ~ 95℃）。Kinetic experiment 條件在 30-60℃不同溫度 10 或 30min 隨時間 測光譜取 265 nm 及 295 nm intensity 對時間作圖。

聚丙烯醯胺電泳 (PAGE)

凝膠配置成分如下：

丙烯醯胺（Acrylamide）40％ 50mL DDwater 40mL 5xTBE Buffer 10mL TEMED 70μL APS（ammonium persulfate） 700μL

電泳在 4℃下以 250 伏特電壓跑 4~6 小時，跑膠使用的 DNA 濃度 40uM 前染膠

（pre-stained gels）為跑電泳前，將 BMVC-8C3O 和不同濃度的 DNA 混合 over night 後，再進行跑膠，之後以 254 nm UV 燈照射下拍照。

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NMR spectra

1D-¹H NMR的實驗是利用Bruker 800MHz Avian 與600MHz 搭配cryoprobe 設備所測量 1D imino-proton的實驗條件是在25℃或37℃下，溶劑使用H₂O/D₂O (90%/10%) 利用 Watergate techniques (p3-9-19) or a jump and return sequence 脈 衝序列做solvent suppression⁷¹，而¹H-¹⁵N 的1D NMR光譜是用SOFAST-HMQC 脈衝序列⁷²，作H1-N1或H8與N7激發( through bond coupling)，2D- NOESY是利用 jump and return sequence 脈衝序列做solvent suppression⁷¹。DNA的條件1D-¹H NMR光譜是 0.1-1mM之間，2D- NOESY是0.5-1mM，buffer條件在 Tris-HCl 10mM (pH7.5) 、 KCl 150mM ， 內 加 光 譜 標 準 品 濃 度 0.1 mM DSS (Sodium4,4-Dimethyl-4-silapentane-1-sulfonate)。

- 28 -

示差熱掃描熱微量卡計Differential scanning calorimetry (DSC)

DSC 實驗是利用熱微量卡計 Nano-DSC III calorimeter (New Castle, DE)所 測得實驗裝置cell分成reference與sample cell，伴隨溫度升高產生吸收或釋放的熱 量會導致reference cell 與sample cell的熱改變，兩槽的熱差將由即時進行功率偵 測，因此我們可以觀測到樣品槽中熱訊號的變化，扣除reference cell所產生的熱 可以得到biomolecule的所產生的熱⁷³(圖2.2)。實驗所使用的DNA濃度是150-200 μM，在pH 7.5緩衝溶液Tris-HCl 10 mM, KCl 150 mM下，外加相對5當量的小分 子或在40% PEG條件下，

掃描範圍10℃-120℃、外加3大氣壓^73,74 與掃描速率1℃/min進行實驗，data 分析是利用built-in software (NDSC Run version 3.6 and NanoAnalyze version 2.0)，

實驗結果相對扣除buffer對buffer scan 取得Cp 對溫度作圖。△Hcal = ∫Cp(T) dT，

△Scal = ∫Cp(T)/T dT以及△G^ο= △Hcal-T△Scal，推出37℃下的unfolding free energy (△G37

ο)。

圖 2.3 DSC 實驗原理示意圖

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超高速離心 analytical ultracentrifuge

a

nalytical ultracentrifuge簡稱為AUC，它的原理是在外加固定重力埸情況下，

測量樣品分子在溶液中sedimentation (沉降)方式，進而計算分子的native分子量。

一般使用Sedimentation velocity方法，使用的離心力高到足以使均勻溶液中的分 子沉降到石英槽底，在離心過程中會產生明顯的界面，下層是沉降分子形成的均 勻濃度，而上層是去除樣品分子部份，上下層之間有明顯的界面， 測量這個界 面移動的速率，可以計算出分子的沉降係數(sedimentation coefficient)。這個係數 與分子的質量有關，同時與frictional coefficient倒數成正比，且與分子的體積（形 狀）有關。圖2.4表示不同沉降速度時界面移動的情形，所對應之吸收光譜。

)

)

Svedberg equation上式表示該係數以dr/dt表之r為距離，而t為時間。f為摩擦係 數。Mw為分子量， v為partial specificvolume，，ω為radial velocity of the rotor in radians per second ， NA為Avogadro’s number ， 而 溶 液 的 密 度 為 ρ 。 rate of sedimentation與分子量Mw，離心力ω²r，density difference between molecule and the solvent, 有 關 。 ， frictional coefficient. 值 愈 高 ， 沉 降 速 率 愈 低 。 分 子 的 sedimentation coefficient(s) 定義為指定離心重力埸(dr/dt) (1/ ω2r)中的沉降速率，

而s的單位為10^-13 s (Svedberg unit) sedimentation coefficient為分子在重力埸中的 沉降速率，而測量該係數可以得知分子在溶液中的水合動態 (hydrodynamic)特性 及計算出分子量推得分子狀態。

實驗條件DNA sample 1-3 µM之間，體積1000 µL，分別與BMVC-8C3O、

BMVC-6C2O、BMVC-8C五倍當量加熱至95℃到25℃之後，測量sample吸光值約

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0.5-1.5 OD之間。儀器使用Optima XL-A/XL-I 分析級超高速離心機(Beckman, ) ， 利用Sedimentation velocity scan，測量260 nm、轉速60,000 rpm，得到吸收分布圖 譜，利用sedfit program計算出DNA的sedimentation coefficient與分子量^46,75,76。

圖 2.3

Sedimentation velocity scan 實驗所測得之吸收分布圖譜

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第三章

人類端粒四股結構在鈉/鉀離子的結構轉換機制

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3.1 簡介

人類端粒四股結構在鈉、鉀離子中的結構轉換

人類端粒四股結構的多樣性，使得許多研究團隊對不同結構之間的關聯特別 有興趣，由於四股結構對離子有不同的選擇性，所以對於離子交換的過程與結構 之間的變化有更多的可能性，1990 年 Sen 說明了鈉、鉀離子影響端粒四股結構 的轉換，並且推測在生理條件下可能會發生⁷⁷，所以人類端粒四股結構的轉換在 生物活性上或設計四股穩定劑相當具有重要性。先前提到到人類端粒四股結構最 早是在鈉離子溶液下利用 NMR 所解出，為反平行籃型的結構 ⁴³。隨後在 2006 年 Yang、Patel 與 Sugiyama 團隊分別解出了人類端粒四股結構在鉀離子溶液的 NMR 結構 ^46,48-49，由於需要定出完整結構，所以他們分別擷取 5 端與 3 端鹼基 序列或是利用變異的序列來解結構，而他們三個團隊的結果都得到在鉀離子溶液 的 NMR 結構為混和型結構。因此根據 NMR 的結果，人類端粒四股結構在鈉、

鉀離子條件下的結構相當不一樣，又已知鉀離子又比鈉離子對四股結構穩定性較 好，所以 Yang 進一步提出了結構轉換的模型(圖 3.1 a)⁴⁹，說明了在鈉離子的反 平行籃型四股結構在加入鉀離子後會發生結構轉變，對應 CD 光譜與 NMR 光譜 的光譜轉變的結果。由於鈉/鉀離子交換所誘導的光譜轉變相當快，Chaires 團隊 根據先前 Yang 團隊所提出的模型，進一步利用 CD 光譜的 291 nm 訊號與 265 nm 訊號從事動力學的量測，推測開始是離子在數百微秒之間先行交換，接者有結構 的解開，然後才有重新摺疊的過程，根據 fitting CD 訊號的結果提出結構轉換發 生時間約在數十秒至數百秒 (圖 3.1 b) ⁷⁸。

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(a)

(b)

圖 3.1 (a) Yang 團隊利用 A-HT21 鈉鉀離子交換 CD 光譜的實驗結果，

提出的鈉鉀交換所引發的結構轉換過程⁴⁸

(b) Chaires 團隊對 A-HT21 結構轉換過程的動力學研究⁷⁸

在文檔中 探討人類端粒四股結構的結構轉換機制 (頁 19-0)