結果與討論

從熱力學的角度來看結構轉換的機制

根據 DSC 結果(圖 5.1a)，得到 TA-HT21 的非平行四股結構之解旋溫度(Tm) 是 69.5℃，經過 PEG 轉換的平行四股結構為 96℃及 BMVC-8C3O 轉換的平行四 股結構為 115℃，根據△Hcal = ∫Cp(T) dT，可以得到△Hcal (unfolding enthalpy)，根 據圖 5.1b TA-HT21 的非平行四股結構的△Hcal約 53.2kcal/mol，在 PEG 條件約 54.5kcal/mol，而由於 BMVC-8C3O 的 DSC 訊號超過偵測範圍，所以我們利用 在低鉀離子濃度 (5mMK⁺) 條件得到△Hcal，進一步利用 △Scal = ∫Cp(T)/T dT 以及

利用 DDSC 測得熱力學數據，△Hcal unfolding enthalpy 彼此間差異不大，而 且△Hcal主要是 G-quartet 氫鍵所貢獻，TA-HT21 四股結構為三層 G-quartet，所 以對於△Hcal貢獻應該類似。然而 Tm 彼此間差異很大，相對於 TA-HT21 的非平 Tm 影響 free energy，小分子與溶劑高出的約 26℃，可能是由於 hydration 的 free energy 所貢獻，進而影響穩定性。

先前研究的結果提到是由於 dehydration effect 造成熱力學穩定性的增加

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89,90,95，而 dehydration effect 影響到 water activity，進而影響△Ghydο

(hydration of free energy) 使四股結構穩定性因而提升，因此水分子如何影響人類端粒四股結 構在溶液中是值得進一步討論。

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圖 5.1 DSC 結果. TA-H21 非平行四股結構在 K⁺ 150mM 條件下(黑線)，加入 BMVC-8C3O anneal 處理(藍線)，或加入 40% PEG anneal 處理(桃紅線) DSC data table，△H_cal、△S_cal與△G₃₇^ο ，根據△H_cal = ∫Cp(T) dT

，△S_cal = ∫Cp(T)/T dT，△G^ο= △H_cal-T△S_cal。

(*BMVC-8C3O 低鉀離子濃度(5mMK⁺) 條件得到△H_cal)

40 60 80 100 120

0 2 4

Cp k ca l/ mol

o

C

Temperature(^oC)

TA-H21 K⁺150mM +BMVC-8C3Ox5 Anneal +40% PEG

- 90 - 的上升的訊號，將訊號對時間作圖(圖 5.2)，經由 exponential fitting，在 37℃下可 以得到 295nm 下降的 decay time 約 350 分鐘，而 265nm 上升 arising time 約 375 5.4)，BMVC-8C3O 的 activation enthalpy，由 CD 295nm 得到約 33.5kcal/mol， CD 265nm 得 到 約 34.8 kcal/mol ， 而 activation entropy 由 CD 295nm 得 到 約 30cal/mol*K，CD 265nm 得到約 34cal/mol*K；CD 265nm 與 CD 295nm 差異不大，

利用△H^┿與△S^┿算出 37℃下的 activation free energy (△G^┿)，由 CD 295nm 與 265nm 都得到 24.2kcal/mol。比較 PEG 得到的 activation enthalpy，由 CD 295nm 得到 38 kcal/mol，CD 265nm 得到約 38 kcal/mol，而 activation entropy，CD 295nm 得到 45 cal/mol*K， CD 265nm 得到約 46 cal/mol*K，37℃下的 activation free energy，由 CD 295nm 與 265nm 得到 24 kcal/mol。由結果可以發現 BMVC-8C3O 與 PEG 將非平行四股結構轉換成平行四股結構兩者跨越的 activation free energy 很接近，但比較其轉換速率，PEG 比 BMVC-8C3O 快約 3 倍，主要可能是 ligand

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與四股結構結合限制了結構的自由度，使 activation entropy 差了 10cal/mol*K，

導致轉換速率上差異。

由 CD 光譜可以得到 PEG 與 BMVC-8C3O 結構轉換的 energy barrier，同時 可以用 two-state 描述這個過程，然而 CD 光譜所對應的 295 nm 與 265 nm 訊號，只能大略區分非平行與平行四股結構，對應的訊號可能代表 G-quartet 氫 鍵的方向性^39-40，抑或是 strand polarity³⁸，對於形成四股結構 12 個 G 鹼基的變 化仍然不能了解，所以無法得知結構轉換過程中是否有出現其他過程，或是提供 結構是如何解開再形成的資訊，因此對討論結構轉換的機制仍有拘限。

若是從 TA-HT21 的四股結構來探討結構轉換的過程 (圖 5.5)，由於非平行 混合型四股結構的 G-quartet 順序與轉換成平行螺旋型四股結構，主要差異是 G15 與 G17 的調換，但 loop 的差異卻很大，混和型四股結構是由一個 double-reverse side loop 與兩個 lateral loop 所組成，而螺旋型四股結構是由三個 double-reverse side loop 所組成。所以在結構轉換過程中，第三條 strand (G15-G16-G17)的調換 位置是結構變化的關鍵；是經由部分結構解開，還是整個結構的解開，其間是否 有中間態(Intermediate)，解開後是瞬間完成，還是逐步完成平行結構，其間反應 機制尚不明確。由於 CD 光譜提供的是整體性資訊，無法提供單一 G 鹼基的變 化，因此我們利用 high-resolution NMR 與 site-specific ¹⁵N isotope labeling 針對每 一個 G 鹼基的 imino-proton 訊號，作進一步結構的轉換過程之確認。

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0 100 200 300 400

5 10

CD 2 9 5 n m (medg )

Time(min)

(a) (b)

(c)

圖 5.2 TA-HT21 端粒四股結構 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-8C3O 的變溫(30℃、37℃、45℃、55℃、60℃) CD time dependent spectra， (a) 265nmCD 訊號，(b) 295nm CD 訊號，(c) lifetime table，利用 y=A ，fit 得到不同溫度下 的 lifetime。

0 100 200 300 400

10 20 30

CD 265 nm (med g)

Time(min)

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0 100 200 300 400

0 5 10

CD 2 9 5 n m (medg )

Time(min)

(a) (b)

(c)

圖 5.3 TA-HT21 端粒四股結構 K⁺ 150mM 條件下，加入 40% PEG 的變溫(30℃、

37℃、45℃、55℃、60℃) CD time dependent spectra，(a) 265nmCD 訊號，(b) 295nm CD 訊號 (c) lifetime table，利用 y=A ，fit 得到不同溫度下的 lifetime。

0 100 200 300 400

10 20 30

CD 265 nm (med g)

Time(min)

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(a) (b)

(c)

圖 5.4 Eyring equation ln(k/T)對(1/T)作圖

^△

^┿

^△

^┿ 。 (R 是理想氣體常數，kB

是Boltzmann 常數，h 是 Planck’s 常數) ，用斜率得到△H^┿/R,截距得到△S^┿。 (a) TA-H21 與 BMVC-8C3O (b)與 40% PEG (c) △H^┿、△S^┿及△G^┿的 energy value table。

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圖 5.5 TA-HT21 非平行混和型四股結構轉換成平行螺旋行四股結構 示意圖及 對應的 G-quartet 順序。

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利用 NMR 討論 TA-HT21 與 BMVC-8C3O 的結構轉換機制

利用 site-specific

¹⁵N isotope labeling 分別得到加入 BMVC-8C3O 的 initial state 與 final state 的每一個 G 鹼基 (圖 5.6)，嘗試定出 initial state 與 final state 訊號的對應關係；目前除了 G17 的 initial state 尚未找到，另外 G15 的 chemical shift 幾乎是在同一位置其他的 G 鹼基都可以找出 initial state 與 final state， 而 G17 對應是第一層 G-quartet，所以 initial state TA-HT21 混合型四股結構一加入 BMVC-8C3O 之後的 initial state 就有受到影響，可能是從第一層 G-quartet 開始 受 到 擾 動 ， 但 其 他 的 G 鹼 基 是 如 何 相 對 應 變 化 ， 接 者 我 們 會 進 一 步 利 件相同，而依這個連接順序可以得知 TA-HT21 與 BMVC-8C3O 作用的 final state 為平行四股結構。

進一步利用鹼基的 H8 與醣基 H’1 的 NOE 光譜來看(圖 5.9)，鹼基連接性與 醣基的空間同向 (Syn)或反向 (Anti) 關係，H8-H’1 NOE 訊號相較 TA-HT21 混 和型四股結構弱，說明了所有的鹼基與醣基沒有順向(Syn)，而且都有出現醣基 H’1 與下一個 G 鹼基 H8 作用 NOE 訊號，說明對應出連接 G 鹼基序列距離近，

因此 final state 的鹼基皆為反向(Anti)的結構。另外 H8-H’1 NOE 光譜左下角部分，

較高 chemical shift 約 8.6ppm 左右有三個較強訊號，此為 A 鹼基的訊號，由於 double-reverse side loop 會有造成 A 鹼基 H6-H’1 有 down-field 現象，所以說明 final state 的結構有三個 double-reverse side loop。

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根據 NMR 的結果與 Phan 團隊⁹⁶所解出 TA-HT21 在 40% PEG 的四股結 構有一致的結果，同一層 G-quartet 的 imino-proton NMR 位置接近、對應的 G 鹼基的方向都是順時針、G 鹼基與醣基皆為反向以及三個 A8、A14、A20 鹼基 的訊號有 down-field 現象⁹⁶，可以證明 TA-HT21 與 BMVC-8C3O 作用的 final state 是平行螺旋槳型四股結構。

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圖 5.6 Imino-proton NMR ( Bruker 800MHz)光譜，TA-HT21 端粒四股結構在 K⁺ 150 mM 條件、30℃下，分別加入 5 當量 BMVC-8C3O ，2h (bottom)，Anneal (upper) ，Site-specific ¹⁵N (6%) isotope labeling(G3-G22) imino-proton NMR，

37℃2hr (middle bottom)，Anneal (middle upper)

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(a) (b)

圖 5.7 Site-specific ¹⁵N (6%) isotope labeling(G3-G22) imino-proton NMR ( Bruker 800MHz)光譜，TA-HT21 端粒四股結構與 BMVC-8C3O 作用的 initial state (左圖) 跟 final state (右圖)。在 K⁺ 150 mM、30℃條件下，加入 5 當量 BMVC-8C3O。(a) 2h，(b) Anneal。

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(a) (b)

(c)

圖 5.8 TA-HT21 端粒四股結構在 K⁺ 150 mM、37℃條件下，加入 5 當量 BMVC-8C3O 之後 Anneal 形成的 final sate。 (a) H1-H1 NOE 光譜( Bruker 800MHz)，。(b) H8-H1 NOE 光譜( Bruker 800MHz)。(c) 根據 NOE 結果，建立 的 G-quartet 連接性。

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圖 5.9 TA-HT21 端粒四股結構在 K⁺ 150 mM、37℃條件下，加入 5 當量 BMVC-8C3O 之後 Anneal 形成的 final sate。 H8-H’1 NOE 光譜( Bruker 800MHz)。

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利用 Time-resolved NMR 研究 TA-HT21 與 BMVC-8C3O 作用結構轉換過程 經由 NMR 定出 TA-HT21 與 BMVC-8C3O 作用的 final state 是平行螺旋槳 型四股結構之後。我們利用 Time-resolved NMR 的方法，觀察 BMVC-8C3O 與 TA-HT21 作 用 從 混 合 型 四 股 結 構 轉 換 成 平 行 螺 旋 槳 型 四 股 結 構 結 構 之 間 inteconversion¹⁰⁶。由觀察結構轉換隨時間改變的 imino-proton NMR，根據 NMR 所得到 initail state 與 final state 的每個 G 鹼基對應的 peak 位置，可以知道 initail 轉換到 final state 不是單純的 two state，可能有 intermediate 的存在，才導致 initail state 的消失與 final state 的生成所需時間的明顯差異。類似的結果也在 G4 的分 析得到。由於在轉換過程中，有一些訊號會彼此重疊，導致分析上的困難，所以 目前僅針對 G21 與 G4 作分析探討。然而根據 site-specific ¹⁵N isotope labeling 單 一鹼基的結果，確實發現除了 initail state 與 final state 之外，有一些 weak 的訊號，

隨者時間出現而消失。 圖 5.11 根據對應 labeling 的結果，可以知道存在者 intermediate，這個結果可以解釋 first state 的消失與 final state 生成不一致，是由 於 intermediate 的存在，而在較高的溫度 intermediate 的生命期縮短，才使得生成 與消失時間接近。

然而由 CD 光譜所測得 265 與 295nm 的時間，卻有一致的現象，比較 NMR 與 CD 兩者間差異，可以了解 NMR 是可以觀察單一個 G 鹼基的動力學，而 CD 光譜是由於整體鹼基的結構所導致 295nm 與 265nm 的訊號，利用 NMR 光譜可 以清楚了解整個轉換過程的動力學。

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(a)

(b)

圖 5.10 TA-HT21 端粒四股結構 K⁺ 150mM 條件下，加入 5 當量 BMVC-8C3O 的變溫 imino-NMR time dependent spectra (Bruker 500MHz)。(a) 偵測 G21 消失與 生成的訊號。(b) 偵測不同溫度(30℃、34℃、37℃、45℃)條件。

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0 500 1000 1500 2000

0.00

圖 5.11 變溫 NMR time dependent spectra，偵測鹼基 initail state 消失與 final state 生成的訊號 。(a)利用 y=A ，fit 得到不同溫度(30℃、34℃、37℃、45℃)下 的消失(藍點) 與生成時間(黑點)。Fitting Residel: decay time (綠線) 與 rising time (黃線)。(b) 得到不同溫度(30℃、34℃、37℃、45℃)下的 decay 與 rising time。

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(a)

(b)

表 5.1 變溫 NMR time dependent spectra，偵測鹼基 initail state 消失與 final state 生成的訊號 。得到不同溫度(30℃、34℃、37℃、45℃)下的 (a) decay time，(b) rising time。

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圖 5.12 TA-HT21 端粒四股結構在 K⁺ 150 mM 條件下、加入 BMVC-8C3O 五倍 當量，30℃下 12h 的 imino-proton NMR 光譜(黑線)(upper)。而 Site-specific ¹⁵N (6%) isotope labeling 對應的 intermeidate state assign 的光譜。(將 NMR time dependent spectra 相加減去 initail state 跟 final state 的訊號) ( Bruker 800MHz)

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利用 NMR 的結果建立結構轉換的動力學能階 (energy diagram)

根據 Time-resolved NMR 在不同溫度的結果，圖 5.13 可以發現 final state 的 G 鹼基 risng 的過程有順序上差異，在 30℃下 G5、G17、G23 相較其他鹼基序列 快，這三個鹼基對應是下層的 G-quartet，所以在生成的順序可能是下層較快，此 外，考量 initial state G17 的位置是最先消失，其對應位置是在上層的 G-quartet，

而 final state G17 位置是在下層的 G-quartet，另外 initial state G15 訊號受到影響 G17 相對小，推測是上層的 G-quartet 先受到擾動，經過 intermediate，再形成 final state。然而，G17 與 G15 的變動與 risng 的過程有順序上差異可以推測解開的過 程 有 可 能 不 是 一 致 的 ， 而 且 不 太 可 能 是 一 個 完 全 解 開 的 結 構 狀 態 (Global unfolding)，而是部分解開的狀態(Local unfolding)。

進一步我們利用 G 鹼基 G21 與 G4 的生成與消失時間在不同溫度(30℃-45℃) 下，利用 eyring plot ln(k/T)對 1/T 作圖(圖 5.14)，得到轉換過程的 energy barrier。

由 Decay 消失訊號得到 activation enthalpy (△H^┿)約 25 kcal/mol， activation entropy (△S^┿)得到約 5 cal/mol*K，由生成訊號得到△H^┿約 38 kcal/mol，△S^┿得 到約 30-45 cal/mol*K 與，由結果知道 △H^┿ 與 △S^┿ 在 initial state 消失的過程 相較 final state 生成的過程變化較小，推測結構解開的過程應該在 final state 生成 的過程，雖然 activation free energy (△G^┿)兩者只相差 1 kcal/mol，但在不同溫度 下的△G^┿， risng 的過程變化很大，而 decay 過程比較不受溫度影響，說明 risng 的過程中有大幅的結構改變。

最後根據得到的 energy barrier，Time-resolved NMR 光譜得到的對應的 initail state 消失、經過 intermediate 與 final state 生成過程，我們提出了從 TA-HT21 非 平行混和型四股結構經由小分子 BMVC-8C3O 轉換成平行螺旋槳型結構的機制 (圖 5.33)，利用此機制了解 intermediate state 參與結構轉換，以及發現 final state G-quartet 形成順序，可以推測結構轉換之間是經由形成 intermediate state，再經 由結構有部分解開形成 final state，而不是經由一次解開的 Two-state 過程，有較

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快的時間先形成 intermediate state 然後有較慢的轉換時間經過結構解開形成 final state，然而由於他們討論模型實際上並沒有發生結構轉換，所以動力學時間預測 快了 2 個數量級，但根據我們利用 NMR 定出 initial state state 與 final state，以及 利用 Time-resolved NMR 清楚的描述他們所提出的結構轉換機制是可能發生

快的時間先形成 intermediate state 然後有較慢的轉換時間經過結構解開形成 final state，然而由於他們討論模型實際上並沒有發生結構轉換，所以動力學時間預測 快了 2 個數量級，但根據我們利用 NMR 定出 initial state state 與 final state，以及 利用 Time-resolved NMR 清楚的描述他們所提出的結構轉換機制是可能發生

在文檔中 探討人類端粒四股結構的結構轉換機制 (頁 93-0)