人 類 表 皮 基 底 細 胞 表 現 CXCR4 受 體 蛋 白
為了證明是否趨化激素受體影響表皮基底細胞的腫瘤發生， 本 次實驗先以 qPCR 偵測 CCR1−CCR10 與 CXCR1−CXCR6 趨化激素受體在 BCC-1/KMC 細胞株中的表現量。 如圖 1A 顯示，比起其它趨化激素 受體，CXCR4 受體蛋白在 BCC -1/KMC 細胞株中的表現量是 CCR10 受 體蛋白表現量的 72 倍。另外，BCC-1/KMC 細胞則未被偵測到有 CXCL12 的表現 (圖 1A)。我們比較 BCC-1/KMC 細胞與其它皮膚癌細胞株 (melanoma， A2058 與 squamous cell carcinoma， A431)或正常表 皮細胞(角質細胞、黑色素細胞與纖維母細胞) 的 CXCR4 表現量，發 現 BCC-1/KMC 細胞比起其他細胞有較高的 CXCR4 表現量 (~500 倍
~3000 倍)(圖 1B)。 此外，我們也以免疫墨點法試驗偵測 BCC-1/KMC 細胞中 CXCR4 受體蛋白的表現(101 kDa， 圖 1C) (31)。
? 了偵測 CXCR4 受體蛋白是否會在表皮基底腫瘤組織細胞中表現，
我們將表皮基底組織樣品 進行免疫化學法試驗。 以 Anti-CXCR4 單 株抗體結合 DAB 染劑的方式 (呈褐色) 染色表皮基底組織細胞樣品
(7 in 12)，如圖 1D。 以 isotype IgG 所做的對照組則無呈色反應。
同時我們也使用 CXCR4 anti-sense oligonucleotide 探針進行原位 雜交實驗證明表皮基底腫瘤細胞有 CXCR4 mRNA 的表現(圖 1E)。
0 2000 4000 6000
CCR1 CCR2 CCR3 CCR4 CCR5 CCR6 CCR7 CCR8 CCR9 CCR10
CXCR1 CXCR2 CXCR3 CXCR4 CXCR5 CXCR6 CXCL12
Relative expression by BCC
1
Relative CXCR4 expression
B
圖 1。 表皮基底細胞可表現 CXCR4 受體蛋白。 圖 A， 以定量 聚 合 酵 素 反 應分 析 BCC-1/KMC 細 胞 中 趨 化 激 素 受 體 蛋 白 與 CXCL12 趨化激素蛋白的表現量。 圖 B，以定量聚合酵素反應偵測 表皮基底細胞，黑色素細胞 (MM)， 鱗狀細胞瘤 (SCC)，纖維細胞 (FB) 與角質細胞 (KC)中 CXCR4 受體蛋白的相對表現量。圖 C，以 免疫墨點法偵測人類 CXCR4 (hCXCR4)受體蛋白之表現。圖 D，以 antihuman CXCR4DAB 染劑染色人類表皮基底腫瘤組織細胞。圖 E， 以原位雜交法偵測表皮基底細胞內 CXCR4 mRNA 的表現量。
以 逆 轉 錄 病 毒 載 體 轉 染 CXCR4 基 因 至 表 皮 基 底 細 胞 。
為了證明單獨的 CXCR4 受體蛋白可以促進表皮基底細胞的腫瘤 化 ， 我們使用逆轉錄病毒載體， pLNCX2， 將 CXCR4 基因轉染至 BCC-1/KMC 細胞中。之後以含有 FITC-conjugated anti-human CXCR4 單株抗體與 anti-FITC 之磁力珠(Miltenyi Biotec， Auburn， CA) 分離取得同質性高的 CXCR4-BCC 細胞(圖 2A)。經過 CXCR4 基因轉染 後的 CXCR4-BCC 細胞再以 qPCR 偵測後，發現比起野生型 BCC-1/KMC 與 pLNCX2-BCC 細胞有較高的 CXCR4 表現量，如圖 2B。鈣離子灌流 實驗方式可參考文獻 28，此試驗是為了證明 CXCR4-BCC 細胞所產生 之 CXCR4 受體蛋白具有功能性，如圖 2C 所示。
圖 2。 將 CXCR4 基因經由反轉錄病毒轉染至 BCC-1/KMC 表皮基底 細胞株。 圖 A， CXCR4 基因轉染之表皮基底細胞經磁力株篩選後，
再以 FITC 螢光染劑標定的 anti-human CXCR4 (hCXCR4)單株抗體作 染色。 FSC， 前向散射。 圖 B， 以定量聚合酵素反應分析 BCC-1/KMC (表皮基底細胞)， CXCR4-BCC 細胞與 pLNCX2-BCC 細胞內之 CXCR4 相 對表現量。圖 C，鈣離子灌流試驗，以 fura-2-acetoxymethyl ester 標定 CXCR4-BCC 細胞並以含 500ng CXCL12/ml 之鈣緩衝液處理細胞 (45)。
BCC CXCR4-BCC pLNCX2-BCC
Relative CXCR4 expression
0.9
體外實驗證明在低血清濃度下，CXCL12 受體蛋白促 CXCR4-BCC 細胞 增 殖
為了證明 CXCR4 受體蛋白的表現能夠促使表皮基底細胞腫瘤的 生長， 將 pLNCX2-BCC 與 CXCR4-BCC 細胞培養於正常濃度(10% FCS) 或低濃度(0。5% FCS)血清下，觀察 CXCL12 趨化激素的存在與缺乏下 所造成腫瘤細胞的增殖現象。在正常血清濃度下，不論有無 CXCL12 趨化激素的存在，CXCR4-BCC 與 pLNCX2-BCC 細胞都有相同的增殖率。
然而，比起只有 PBS 處理的對照組，以 CXCL12 處理的實驗組有明顯 CXCR4-BCC 細胞增殖的現象 (24 小時 ~1。2 倍， P=0。027; 48 小時，
~2。2 倍， P=0。004) (圖 3)。 以 CXCL12 處理所造成的生長現象 會受到 anti-CXCR4 單株抗體的處理而消減 (300 µg/ml) (圖 3)。 在 低血清濃度下 CXCL12 並不會明顯地促使 pLNCX2-BCC 細胞的增殖 (P=0。4， data not shown)。 因此， 表皮基底腫瘤細胞處於低營 養供給的情況下，可藉 CXCL12 與 CECR4 受體蛋白所產生的交互作用 而促使其生長。
圖 3。 經體外實驗證明在低血清濃度培養下，CXCL12 促使 CXCR4-BCC 細胞的增殖。在 anti-CXCR4 單株抗體或 isotype 單株抗體存在下，
CXCR4-BCC 細胞(3 × 104 細胞/孔;三重複) 培養於 0.5% 小牛血清並
體外實驗證明在 UVB 的照射下， CXCL12/CXCR4 二者的交互作用可以 防 止 CXCR4-BCC 細 胞 進 行 細 胞 凋 亡
為了證明 CXCR4 受體蛋白所引起的訊息傳導可以防止表皮基底 細胞走向程序性死亡，我們將 pLNCX2-BCC 細胞 與 CXCR4-BCC 細胞 暴露於 UVB 的照射以誘發其細胞凋亡。 如圖 4，在有 CXCL12 的前 處理下， 大約有 38%(P=0。04)的 CXCR4-BCC 細胞可免於細胞凋亡，
然而，此現象卻受到 CXCR4-blocking T22 peptide 的阻斷。受 UVB 照射之對照組 pLNCX2-BCC 細胞則不受 CXCL12 趨化激素或 T22 的影響 (圖 4)。 因此，CXCL12/CXCR4 二者的交互作用可以防止表皮基底細 胞走向凋亡。
圖 4。 經 體 外 實 驗 證 明CXCR4/CXCL12趨化性的交互作用可阻斷 CXCR4-BCC細胞的凋亡。 在T22存在或缺乏下，以500 ng/ml CXCL12 處理CXCR4-BCC細胞與pLNCX2-BCC細胞。之後在螢光染劑(AMC)釋放 460 nm波長下以光學密度偵測caspase-3的活性。 CXCR4-BCC細胞: *，
P=0.04; **， P=0。86, versus UVB-irradiated cells without CXCL12 and T22.
CXCR4-表 皮 基 底 細 胞 移 行 與 侵 犯 之 體 外 實 驗
為了證明 CXCR4 蛋白的表現會引起表皮基底細胞的遷移，以二維 遷移試驗偵測 CXCR4-BCC 細胞在有無 CXCL12 趨化激素存在下的移動 現象。 如圖 5， 在 CXCL12 趨化激素存在下，有 88% CXCR4-BCC 細 胞會產生移行(P<0。05)。以 T22 與 CXCL12 共同處理下，產生移行 CXCR4-BCC 細胞減少。 CXCL12 的處理並不會明顯地增加 pLNCX2-BCC 細胞的移行(P=0.7)。另外，在癌細胞侵犯試驗下，並未觀察到受 CXCL12 處理的 CXCR4-表皮基底細胞、pLNCX2-表皮基底細胞與未受 CXCL12 處理的對照組細胞有任何結果上的差異。
圖 5。 經體外實驗證明CXCR4/CXCL12趨化性的交互作用促進表皮基 底細胞的移行。 在有CXCL12的存在或缺乏下，以二維移行試驗觀察 CXCR4-BCC與 pLNCX2-BCC細胞所產生的細胞遷移。並依據實驗組或對 照組來判別是否添加T22。∗ P<0.05, versus PBS-treated cells.
0
Migration distance (mm)
PBS
CXCL1
CXCL12 + T22
∗
體外實驗顯示 CXCL12/CXCR4 路徑可促使 CXCR4-BCC 細胞進行血管新 生
為了證明 CXCR4 的表現能夠促使腫瘤細胞周邊血管新生，將培 養 pLNCX2-BCC 細胞或 CXCR4-BCC 細胞的培養液濃縮並處理人類內皮 細胞。與對照組比較下(沒有 CXCL12 趨化激素的處理) (圖 6A 與 D;
~2。19 倍， P<0。05)，有添加 CXCL12 趨化激素的 CXCR4-BCC 細胞 培養液有明顯地促使 HMEC-1 細胞管狀發生現象(圖 6B 與 D，) ，然 而，T22 peptide 的添加則可以拮抗中斷此現象，如圖 6C 與 D。無 添 加 CXCL12 趨化激素的 pLNCX2-BCC 細 胞培養液則不具有促使 HMEC-1 細胞管狀發生(圖 6D， P=0。086)。因此，CXCR4-BCC 細胞 在 CXCR4/CXCL12 二者交互作用後能夠促使腫瘤細胞產生引發周邊血 管新生的可溶性物質。為了證明 CXCR4/CXCL12 傳導路徑可以促進某 些血管新生因子的表現，我們將受到 CXCL12 前處理的 pLNCX2-BCC 與 CXCR4-BCC 細胞做 VEGF 的 qPCR 分析。 如圖 6E， 24 小時 後，VEGF 的表現量在 CXCR4-BCC 細胞與 pLNCX2-BCC 細胞皆有上升 (CXCR4-BCC 細胞， ~2.5 倍; pLNCX2-BCC 細胞， ~1.64 倍)。然而，CXCL12 的 處理並不能促使其它血管新生因子 (VEGF-B， VEGF-C， VEGF-D 與
COX-2， data not shown)的表現。 此外，VEGF 表現量增加的現象 可在添加 T22 peptide 後而被消除 (圖 6E)，此結果可被認為表皮基 底細胞中 VEGF 的表現對 CXCR4R/CXCL12 所產生的訊息傳導有依賴 性。
0
CXCL12 stimulation enhance the growth of human endothelial cells
PBS
CXCL12
CXCL12 + T22
CXCR4-BCC pLNCX2-BCC
Tubule formation (mm)
A B C
D
∗
∗ ∗
圖 6。 體外實驗證明CXCR4 蛋白的表現促表皮基底細胞血管新生。
HMEC-1 細胞接種於以 Matrigel覆蓋的培養盤上，之後再以培養過 CXCR4-BCC細胞之培養液處理(圖A-C，顯示HMEC-1 細胞的管狀發生) 與 pLNCX2-表皮基底細胞in various conditions。 A， 培養過 CXCR4-BCC細胞之培養液處理HMEC-1 細胞但無添加CXCL12。 B， 培 養過CXCR4-BCC細胞之培養液處理HMEC-1 細胞且以CXCL12做前處理。
C， 培養過CXCR4-BCC細胞之培養液處理HMEC-1 細胞且以CXCL12與 T22做前處理。 D， HMEC-1 細胞在培養8小時候有管狀形成。∗ P < 0.05
CXCL12 stimulation enhance VEGF expression in CXCR4-BCC E
Relative expression
versus HMEC-1 cells incubated with control (PBS only) conditioned medium.
∗∗ P= 0.086 圖 E，細胞在有 CXCL12 的存在或缺乏下，以 RT-PCR 定 量 CXCR4-BCC 與 pLNCX2-BCC 細胞內 VEGF 蛋白的表現量。並依據實 驗組或對照組來判別是否添加 T22。
體內實驗證明表皮基底細胞經 CXCR4 基因轉染後，其表現之 CXCR4 受 體 蛋 白 能 夠 促 表 皮 基 底 細 胞 腫 瘤 化
為了證明是否 CXCR4 的表現可以促使表皮基底細胞腫瘤的發 生，我們將 BCC-1/KMC、 pLNCX2-BCC 與 CXCR4-BCC 細胞皮下注射進 入裸鼠。 在第 31 天觀察期結束後，以 CXCR4-BCC 細胞注射之裸鼠比 注射 pLNXC2-BCC 細胞的裸鼠具有高腫瘤負荷 (~3。6-fold， P< 0。
05)， 如圖 7A。 當注射 CXCR4-BCC 細胞近入裸鼠體內後，發現有不 正常的血管新生 (圖 7B) 與潰瘍的現象 (圖 7C)， 如同人類的表皮 基底細胞腫瘤。 而且， CXCR4-BCC 腫瘤細胞的生長可受到連續 T22 的施打注射而受到抑制(圖 7A)，且透過檢視腫瘤小鼠的內臟器官(肺 臟，肝臟與腸胃道)與淋巴結， 並未發現有任何轉移。這些結果指出 CXCR4 的表現量能夠促使表皮基底腫瘤細胞的生長及其週邊血管的 新生。
圖 7。 體內試驗證明 CXCR4 受體蛋白的表現促使表皮基底細胞的癌
Tumor vol ume (mm
3)
Days after tumor implantation
A B
C