第四章 研究材料及統計方法
第二節 研究變項及操作型定義
反 轉 聚 合 酵 素 反 應 定 量 試 驗
以 Qiagen 公司之 RNeasy 試劑組萃取表皮基底細胞 BCC-1/KMC 之 RNA，再以此 RNA 為模板，利用反轉聚合酵素製做出 cDNA。 以 ABI 公司出廠之 PRISM 7000 DNA Sequence Detection System 與 SYBR Green 對反轉聚合酵素反應產物進行即時定量偵測。並以人 類 glyceraldehyde 3 -phosphate dehydrogenase (G3PDH)作為內部定量 控制組。使用 Primer Express software( Applied Biosystems)設 計 之 趨 化 激 素受 體 (CCR1-CCR10 、 CXCR1-CXCR6) ， 趨 化 激 素 CXCL12 ， 內 皮 生 長 因 子 (VEGF) ,VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D ， cycloxygenase-2 (COX-2) 與 G3PDH 等的特殊初始子(primer)。
免 疫 組 織 化 學 與 原 位 雜 交 分 析
表皮基底腫瘤組織細胞樣品以 antihuman CXCR4 之單株抗體、
(clone #44716，老鼠的 IgG2B) istotype mouse IgG2B、 生物素標 定 之 antimouse 二 級 抗 體 ， 與 streptavidin-horseradish peroxidase enzyme (後者向 Zymed， South San Francisco， CA 取 得)標定並以 DAB(diaminobenzidine， from DAKO， Carpinteria，
CA)染色、蘇木素復染。原位雜交反應偵測人類 CXCR4 mRNA 的方法 可 參 考 文 獻 27 。 所 使 用 之 生 物 素 標 定 人 類 CXCR4 antisense oligonucleotides 的序列如下:
5’-GTAACCCATGACCAGGATGACCAATCCATT-3’(195-166)，
5’-AGACTGATGAAGGCCAGGATGAGGACACTG-3’(395-366)，
5’-ACTGGAACACAACCACCCACAAGTCATTGG-3’(601-572)，
5’-CCAGGAGGATGAAGGAGTCGATGCTGATCC-3’(802-773)， 與 5’-GCTGGAGTGAAAACTTGAAGACTCAGACTC-3’(1056-1027)。
以 逆 轉 錄 病 毒 載 體 轉 染 CXCR4 基 因
萃取 BCC-1/KMC 細胞中的 RNA 並以反轉錄酵素產生 cDNA，使用 酵素聚合反應與初始子對 (5′- GGAAGATCTATGGAGGGGATCAGTATATA-3′ 與 5′-CCCAAGCTTTTAGCTGGAGTGAAAACTTG -3′， 具有 Bgl II 與 Hind III 限制酵素切位) 產生人類 CXCR4 的 cDNA。 之後 CXCR4 cDNA 以 酵素剪切接入 pLNCX2 retroviral 載體 (Clontech， Palo Alto，
CA)。之後將 pLNCX2-CXCR4 與 不含 CXCR4 基因之 pLNCX2 質體轉殖 進入 BCC-1/KMC 表皮基底細胞癌，而產生 CXCR4 基因之表皮基底細胞 癌 (CXCR4-BCC) 與 不含 CXCR4 基因之表皮基底細胞癌(pLNCX2-BCC) 二種細胞 (28)。 另外，為了能得到 CXCR4 表現量高的 CXCR4-BCC 細胞株，我們選擇使用含有 FITC-conjugated anti-human CXCR4 單 株抗體 (clone 12G5)與 anti-FITC 之磁力珠(Miltenyi Biotec，
Auburn， CA)分離取得同質性高的 CXCR4-BCC 細胞。 此外，培養時 添加 G418 (GIBCO)至培養基內以維持 CXCR4-BCC 細胞中 CXCR4 受體 蛋白的表現量。
細 胞 增 殖 試 驗
細 胞 增 殖 試 驗 方 法 可 參 考 Murakami 等 人 的 文 獻 (9) 。 pLNCX2-BCC細胞株與CXCR4-BCC細胞株在正常血清濃度(10% FCS)或 低濃度血清(0.5% FCS)下，以 3×104 /孔細胞密度種植在96-孔培養盤 中。 依指定之實驗組或對照組分別添加anti-human CXCR4 單株抗體 (clone #44716) 、mouse IgG2B isotype或 PBS後，再添加CXCL12 (500 ng/ml)處理24或48小時(圖 3)，之後以市售WST-1試劑組偵測腫瘤細 胞增殖的程度 (Quick cell 細胞增殖試劑組， BioVision， Mountain View， CA) (29)。
細 胞 凋 亡 試 驗
pLNCX2-BCC 細胞株與 CXCR4-BCC 細胞株以指定的試劑，500 ng/ml CXCL12 或 CXCR4-blocking peptide T22 (1µg/ml)，處理 24 小 時後, 接著經 UVB 照射(25 millijoule/cm2) 以誘導細胞凋亡(圖 4)。
之後細胞凋亡的程度以市售之 BD ApoAlert caspase-3 試驗培養盤 (Clontech) 偵測其 caspase-3 的活性。 簡而言之， BCC 細胞 lysates (2 × 105 細胞) 加入表面已覆蓋 caspase-3 受質 (Asp-Glu-Val-Asp or DEVD)連結螢光物質(7-amino-4-methyl coumarin， AMC)的 96 孔 培養盤，一旦受質經由 caspase-3 水解後，其所釋放的螢光物質 (7-amino-4-methyl coumarin， AMC)可經由 380 nm 波長光源激發後 釋放出 460 nm 波長，再以讀取儀偵測。
細 胞 移 行 與 侵 犯 試 驗
二維遷移試驗方法可參考文獻 13。 簡而言之，將表皮基底細胞 癌種於培養盤中至長滿，之後以刮取器將每個培養孔挖掉約 2mm 寬區 域的細胞後，將原先的培養基置換成有添加 CXCL12 (500 ng/ml)或 T22 (1µg/ml) 的 培 養 液 ( 圖 5) 。 培 養 48 小 時 後 ， 以 CCD (charge-coupled device) camera 與 image analysis software 定 出移行細胞之原始寬度並減去剩餘寬度的值來計算細胞遷移的距離 (PhotoImpact 7。0， Ulead Systems Inc。 Taipei， Taiwan)。 另 外，使用表面覆蓋有細胞基質的 Boyden chamber 來進行細胞侵犯試 驗(Matrigel， from BD Biosciences Discovery Labware， Bedford，
MA)。侵犯程度以細胞穿透細胞基質膜的數量決定(10)。
血 管 新 生 體 外 試 驗
105 pLNCX2-BCC 與 CXCR4-BCC 細胞培養於 6-well 培養盤中， 依 實驗組或控制組選擇是否處理 CXCL12 趨化激素。如圖 6，在某些指 定的實驗組或控制組添加 T22。 培養 24 小時後， 收集各組之培養 液，並使用含有 3，000 kD cut-off 濾膜之 Centricon 離心管做離 心濃縮(~4 倍) (Millipore， Billerica， MA)。 同時， 將 10,000 HMEC-1 細 胞 種 植 於 表 面 受 Matrigel 處 理 的 96- 孔 盤 中 (BD Biosciences Discovery Labware) ， 之 後 再 加 入 濃 縮 後 培 養 過 pLNCX2-BCC 細胞或 CXCR4-BCC 細胞的培養液(250 µl)(圖 6)。 培養 8 小時後， 觀察其管狀形成的長度 (30)。
癌 細 胞 異 種 移 植 試 驗
以胰蛋白水解酵素將 BCC-1/KMC、pLNCX2-BCC 與 CXCR4-BCC 細 胞脫離培養瓶壁後，以 PBS 漂洗。 將其以 5×105 細胞/100 µl PBS 濃度分別皮下注射進入三組裸鼠 (day 0， 三組， n=5)。 另外一組 動物實驗是在裸鼠的 CXCR4-BCC 細胞注射部位，再以每天ㄧ次的方 式，施打 CXCR4-blocking peptide T22 (2 µg/鼠 ? 日劑量; day 0 – day 5)。 腫瘤生長的大小程度以卡尺測量其長、寬與厚度。腫瘤大 小測量公式為長度×寬度×厚度×0。5236(17)。