研究設計

整個動物實驗的所有實驗步驟均經過台灣省台中市中國醫藥大學動 物中心所認可，同時遵循 NIH 公告的實驗室動物照顧原則。

2.2.1 動物分組

實驗動物條件，重量約 300-350 公克的雄性大鼠(購自台灣的國際科 學動物中心)，飼養環境室溫在 25ºC 且維持 12 小時的日夜循環時間(早晨 設定為上午 7 點)。所有大鼠以標準的實驗室飼料供應餵食(編號 5001; PMI Nutrition International Inc. Brentwood, MO, USA) 及飲水，以隨機 方式分配這 21 隻大鼠到三個不同的組別。對照手術組(3 隻)、出血性休 克組(9 隻)、出血性休克後復甦組(9 隻)。在出血性休克組和復甦組中，

我們在處置後的 0 小時、4 小時及 8 小時各犧牲三隻大鼠。

2.2.2 創傷併發出血性休克模組

重量約 300 到 350 公克的雄性 Sprague Dawley 大鼠，藉由腹腔注射 sodium pentobarbital ( 每公斤 30 毫克)麻醉，於麻醉之後進行氣管插 管以供應 100%氧氣。我們使用由肝素處理過的聚乙烯所製造的導管

(PE50)，對於右側的股動脈及股靜脈來建立管路，而平均動脈壓(MAP)則 藉由右側股動脈的壓力傳導到機器紀錄(Cardiomax-model 85; Columbus

Instruments International Co.,Ohio,U.S.A)。大鼠的創傷則由劍突下 到恥骨間沿腹部中線切開來建立，並立即用聚乙烯縫線縫合。

2.2.3 出血性休克及復甦治療

在休克組及復甦組，藉由 10 分鐘內的抽血過程(每公斤 2.5 毫升)以 維持平均動脈壓 40±5 毫米汞柱。休克時間維持 60 分鐘。在出血組，我們 將原本抽出來的血液，藉由靜脈導管在 10 分鐘內重新輸回大鼠體內以回 復休克前的平均動脈壓。在復甦組，在 10 分鐘內我們除了重新輸回之前 抽出的血液外，另外加入乳酸林格氏液。在自體輸液或復甦治療後，動脈 和靜脈導管移除並縫合，並將每隻大老鼠送回自己原本的飼養籠。

2.2.4 組織淬取

實驗樣本的取得是先將左心室心肌組織浸泡在 PBS(0.14 M NaCl, 3 mM KCl, 1.4 mM KH2PO4, 14 mM K2HPO4)緩衝液(每 100 毫克組織加入 0.5 毫 升的 PBS) 5 分鐘，接著均質液放在冰塊上 10 分鐘後，離心 30 分鐘(每分 鐘 12000 轉)，取上清液冰存於-70°C 的環境以便進一步實驗之用。

2.2.5 Hematoxylin & eosin(H.E.)染色法及 TdT-mediated dUTP

nick-end labeling (TUNEL)染色法

心臟左心室先藉由福馬林沖洗，接著使用酒精脫水，再使用福馬林包

埋後，切成 0.2 微米後的福馬林切片。藉由 xylen 去福馬林及恢復水分。

關於 H.E. 染色，當所有切片都完成 hematoxylin 及 eosin 染色後，接著 用清水沖洗及用酒精脫水，最後再用 xylene 作兩次的沖洗。顯微照相使 用的是 Zeiss Axiophot 顯微鏡。關於 TUNEL，這些切片先用 proteinaseK 處理，接著使用 phophate-buffered saline 沖洗，用 permeabilisation 溶 液 incubation,最後用 PBS 再沖洗兩次。在 37°C 下用凋亡偵測試劑 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) 60 分鐘裡去檢視發 出 450-500 nm 綠色螢光的 TUNEL 陽性的細胞核。 TUNEL 陽性的細胞的平 均數是藉由至少 5-6 個不同的位置，2 個切片，三個範圍(上、中、下)，

每個分組三個的左心室標本所確認。所有的計算至少有兩個互相不影響也 不知結果的個體所完成。

2.2.6 電泳及西方染墨法

心臟組織萃取物中蛋白質的濃度藉由 Bradford 方法(Bio-Rad

Protein Assay, Hercules, CA)去決定。蛋白檢體(每條軌道 50 微克) 藉 由 75 伏特的電流在 10% SDS polyacrylamide 膠體電泳(SDS-PAGE)中分 離。電泳後的蛋白藉由轉移工具(Bio-rad)被轉移到 polyvinylidene difluoride(PVDF) 膜(Millipore, Bedford, MA, 0.45 μm pore size)。

PVDF 膜接著浸泡於含有 5%牛奶的 TBS 緩衝液中。第一抗體包括 fas ligand、fas receptor、fas associated death domain (FADD)、Bad、

Bax, insulin growth factor-I receptor (IGFIR)、phosphoinositide 3-kinase (PI3K),Akt 以及 α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 和 Bcl-2 (BD)。它們皆以 1：5000 的比例稀釋為 抗體緩衝液，在 4°C 下靜置隔夜。這些免疫染色點在 10 分鐘內以 TBS 緩 衝液清洗三次，然後浸置在含有 IgG-HRP、山羊萃取的抗兔子 IgG-HRP 或 驢子的抗山羊 IgG-HRP(Santa Cruz)的二次抗體溶液中一小時後，於 TBS 緩衝液中稀釋 500 倍。這些免疫染色點再用 TBS 緩衝液在 10 分鐘內沖洗 三次。接著使用加強螢光的西方點墨法反應劑(Santa Curz, CA, USA)去 顯現這些免疫螢光染色蛋白，並且用 Fujifim LAS-300 螢光偵測系統去定 量( Tokyo, Japan)。