第二章 研究方法
第一節 研究材料
2.1.1 藥品及材料來源
SDS（Sodium dodecyl sulfate）
NaCl ( Sodium chloride ) MgCl2 ( Magnesium chloride ) BSA ( Bovine serum albumin ) DEPC ( Diethyl pyrocabonate ) Acrylamide
PBS (Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline) (4) 購自聯工化學廠股份有限公司
Na2H2PO4．2H2O ( Sodium phosphate ) Acetic acide
K2HPO4 ( Potassium phosphate,dibasic ) HCl ( Chloric acid )
KH2PO4 ( Potassium phosphate,monobasic )
(5) 購自美國 Roche 公司 Proteinase K
Complete proteinase inhibitor cocktail tables (6) 購自美國 BMA 公司
ProSieve color protein markers LE-Agarose
(7) 購自美國 Amresco 公司 Boric acid
Bis-acrylamide
APS ( Ammonium persulfate )
(8) 購自美國 Pharmacia Biotech 公司 2-Mercaptoethanol
(9) 購自美國 NEN 公司 PVDF membrane
(10) 購自美國 TEDIA 公司 Methanol
(11) 購自美國 Hyclone 公司 FBS ( Fetal Bovine Serum ) (12) 購自美國 Biotecx 公司 Ultraspec RNA reagent
(13) 購自美國 CPG 公司
Tween 20 ( Polyoxyethylenesorbitan monolaurate ) 2.1.2 Antibody
名稱 廠牌
2.1.3 實驗儀器
第二節 研究設計
整個動物實驗的所有實驗步驟均經過台灣省台中市中國醫藥大學動 物中心所認可，同時遵循 NIH 公告的實驗室動物照顧原則。
2.2.1 動物分組
實驗動物條件，重量約 300-350 公克的雄性大鼠(購自台灣的國際科 學動物中心)，飼養環境室溫在 25ºC 且維持 12 小時的日夜循環時間(早晨 設定為上午 7 點)。所有大鼠以標準的實驗室飼料供應餵食(編號 5001; PMI Nutrition International Inc. Brentwood, MO, USA) 及飲水，以隨機 方式分配這 21 隻大鼠到三個不同的組別。對照手術組(3 隻)、出血性休 克組(9 隻)、出血性休克後復甦組(9 隻)。在出血性休克組和復甦組中，
我們在處置後的 0 小時、4 小時及 8 小時各犧牲三隻大鼠。
2.2.2 創傷併發出血性休克模組
重量約 300 到 350 公克的雄性 Sprague Dawley 大鼠，藉由腹腔注射 sodium pentobarbital ( 每公斤 30 毫克)麻醉，於麻醉之後進行氣管插 管以供應 100%氧氣。我們使用由肝素處理過的聚乙烯所製造的導管
(PE50)，對於右側的股動脈及股靜脈來建立管路，而平均動脈壓(MAP)則 藉由右側股動脈的壓力傳導到機器紀錄(Cardiomax-model 85; Columbus
Instruments International Co.,Ohio,U.S.A)。大鼠的創傷則由劍突下 到恥骨間沿腹部中線切開來建立，並立即用聚乙烯縫線縫合。
2.2.3 出血性休克及復甦治療
在休克組及復甦組，藉由 10 分鐘內的抽血過程(每公斤 2.5 毫升)以 維持平均動脈壓 40±5 毫米汞柱。休克時間維持 60 分鐘。在出血組，我們 將原本抽出來的血液，藉由靜脈導管在 10 分鐘內重新輸回大鼠體內以回 復休克前的平均動脈壓。在復甦組，在 10 分鐘內我們除了重新輸回之前 抽出的血液外，另外加入乳酸林格氏液。在自體輸液或復甦治療後，動脈 和靜脈導管移除並縫合，並將每隻大老鼠送回自己原本的飼養籠。
2.2.4 組織淬取
實驗樣本的取得是先將左心室心肌組織浸泡在 PBS(0.14 M NaCl, 3 mM KCl, 1.4 mM KH2PO4, 14 mM K2HPO4)緩衝液(每 100 毫克組織加入 0.5 毫 升的 PBS) 5 分鐘，接著均質液放在冰塊上 10 分鐘後，離心 30 分鐘(每分 鐘 12000 轉)，取上清液冰存於-70°C 的環境以便進一步實驗之用。
2.2.5 Hematoxylin & eosin(H.E.)染色法及 TdT-mediated dUTP
nick-end labeling (TUNEL)染色法
心臟左心室先藉由福馬林沖洗，接著使用酒精脫水，再使用福馬林包
埋後，切成 0.2 微米後的福馬林切片。藉由 xylen 去福馬林及恢復水分。
關於 H.E. 染色，當所有切片都完成 hematoxylin 及 eosin 染色後，接著 用清水沖洗及用酒精脫水，最後再用 xylene 作兩次的沖洗。顯微照相使 用的是 Zeiss Axiophot 顯微鏡。關於 TUNEL，這些切片先用 proteinaseK 處理，接著使用 phophate-buffered saline 沖洗，用 permeabilisation 溶 液 incubation,最後用 PBS 再沖洗兩次。在 37°C 下用凋亡偵測試劑 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) 60 分鐘裡去檢視發 出 450-500 nm 綠色螢光的 TUNEL 陽性的細胞核。 TUNEL 陽性的細胞的平 均數是藉由至少 5-6 個不同的位置，2 個切片，三個範圍(上、中、下)，
每個分組三個的左心室標本所確認。所有的計算至少有兩個互相不影響也 不知結果的個體所完成。
2.2.6 電泳及西方染墨法
心臟組織萃取物中蛋白質的濃度藉由 Bradford 方法(Bio-Rad
Protein Assay, Hercules, CA)去決定。蛋白檢體(每條軌道 50 微克) 藉 由 75 伏特的電流在 10% SDS polyacrylamide 膠體電泳(SDS-PAGE)中分 離。電泳後的蛋白藉由轉移工具(Bio-rad)被轉移到 polyvinylidene difluoride(PVDF) 膜(Millipore, Bedford, MA, 0.45 μm pore size)。
PVDF 膜接著浸泡於含有 5%牛奶的 TBS 緩衝液中。第一抗體包括 fas ligand、fas receptor、fas associated death domain (FADD)、Bad、
Bax, insulin growth factor-I receptor (IGFIR)、phosphoinositide 3-kinase (PI3K),Akt 以及 α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 和 Bcl-2 (BD)。它們皆以 1：5000 的比例稀釋為 抗體緩衝液，在 4°C 下靜置隔夜。這些免疫染色點在 10 分鐘內以 TBS 緩 衝液清洗三次，然後浸置在含有 IgG-HRP、山羊萃取的抗兔子 IgG-HRP 或 驢子的抗山羊 IgG-HRP(Santa Cruz)的二次抗體溶液中一小時後，於 TBS 緩衝液中稀釋 500 倍。這些免疫染色點再用 TBS 緩衝液在 10 分鐘內沖洗 三次。接著使用加強螢光的西方點墨法反應劑(Santa Curz, CA, USA)去 顯現這些免疫螢光染色蛋白，並且用 Fujifim LAS-300 螢光偵測系統去定 量( Tokyo, Japan)。
第三節
統計方法
所有的蛋白質的資料皆使用平均值 ± 標準差的方式呈現。對於對照 組、出血性休克組、以及出血性休克後復甦組的蛋白質濃度、TUNEL 陽性 細胞數量的比較，皆使用 T 檢定。若 p 值小於 0.05 視為有統計學上的顯 著差異。
第三章 研究結果
第一節 描述性統計分析 3.1.1 H.E. stain
為了解在休克及復甦治療之後是否對於心肌細胞有型態上面的影 響，我們使用 H.E.染色法來觀察，我們分別對於對照組、休克組在第 0,4,8 小時取得的左心室心肌檢體作分析。
從對照組可見清晰的細胞核及緊密的心肌細胞排列；而在休克組中隨 著時間的增加，雖然沒有明顯全面細胞核的縮小，但是可見到些許心肌細 胞的細胞質染色上面漸漸淡化，而心肌細胞的排列也漸漸鬆散(Fig.1)；
在復甦組中的心肌細胞相對於休克組，隨著時間的增加也出現有些許鬆散 情形，但是相對於休克組鬆散程度、細胞核質變化都相對休克組輕微(Fig.
2)。
3.1.2 NFκB
在休克或休克加上復甦治療後我們偵測 NFκB 及磷酸化 NFκB(p- NF κB)的蛋白量
。
NFκB 和α actin 的比值在前 8 小時之內有上升的趨勢，特別在休克後八小時的休克組對於同時間的對照組有 23%的顯著上升 (p<0.05)，另外，同時間的復甦組相對於對照組組有 35%的顯著下降
(p<0.05) (Fig.3)。
3.1.3 TNF-α
在設定的三個時間點裡相對休克組和對照組 TNF-α和 β-actin 的比 值都沒有統計學上的差異。復甦組在 0 小時的量相對於休克組有 50%的顯 著下降(p<0.05)(Fig.4)。
3.1.4 Fas/fasL 和 FADD
相對於對照組，休克組中所有時間點的 fasL 和 β-actin 的比值都顯 著的上升，尤其在第 4 小時的時間點上，約有 5 倍的上升( p<0.01)。另 外，休克組中 FADD 和 β-actin 的比值在第四小時相對於對照組有兩倍的 顯著上升(p<0.01)。復甦組的 FasL 和 β-actin 的比值在 4 小時及 8 小時 相對於對照組皆有 50%的顯著下降(p<0.01,p<0.05)。復甦組 FADD 和 β-actin 的比值在復甦治療後第八小時的時間點相對於休克組有 50%的顯 著下降( p<0.01) (Fig.5)。
3.1.5 p-Bad/Bax 和 Bid/truncated Bid (tBid)
休克組中 Bax 和 tBid 對於β-actin 的比值隨著時間有上升的趨勢。
在第 8 小時的時候，休克組的 Bax 和βactin 比值以及 tBid 和βactin 比 值個別有 1.5 倍及 4 倍的顯著上升(p<0.05)。復甦組的 Bax 和 tBid 對於
βactin 的比值相對於休克組於第 4 與第 8 小時個別有 50%顯著的下降 (p<0.05)(Fig.6,7)。
3.1.6 IGF1R 和 磷酸化 Akt
復甦組 IGF1R 和磷酸化 Akt 的比值相對於休克組在第 8 小時間點時有 顯著的下降(Fig.8,9)。
3.1.7 TUNEL stain
在休克及休克加上復甦治療後，我們於不同的時間點取得的心肌細 胞，用 DAPI 染色法以及 TUNEL 染色法去偵測心肌細胞是否產生了凋亡的 現象。可以明顯見到心肌細胞在創傷並未併發休克時，就有出現約 17.83 % 的細胞產生凋亡現象，然而休克組將引起相對於對照組的心肌細胞約三倍 左右(58.39%)數目的心肌細胞凋亡(Fig.10)，而在經過復甦治療組可以部 分抑制凋亡產生的細胞數目(23.4%)。在休克後第四及第八小時的心肌細 胞，休克組皆有約五成左右的心肌細胞凋亡，在接受復甦治療的組別均有 部分抑制的效果(Fig.11,12)。
第二節 推論性統計分析
由 H.E.染色法可以發現心肌細胞的排列隨著休克後時間的增長而有 越來越鬆散的情形，加上細胞質的淡化都意味著休克將會對心肌細胞產生 傷害；同時在復甦組中可以發現在各個時間點都相對於休克組有較輕微的 變化，但是沒有辦法恢復到如同對照組一般，我們推測此現象可證明輸液 治療可以減輕休克所造成的心肌傷害。TUNEL 染色法中也可看到休克後明 顯增加凋亡細胞的數目，而復甦治療可減輕部份休克所造成的傷害。最 後，在心肌細胞受到創傷出血性休克及復甦治療的相關路徑方面，我們可 以推論是經由內外在路徑及心臟保護的路徑作調控。(Fig. 13)
休克組 4小時 對照組
對照組
休克組 0小時
休克組 8小時 對照組
Fig.1 左方對照組的心肌細胞細胞核清晰可見，細胞排列整齊緊密；右方 休克組的心肌細胞，由上而下隨著休克後的時間越來越長，細胞質染色淡 化，更明顯的是細胞的排列漸漸鬆散
休克組 0小時
休克組 4小時
休克組 8小時
復甦組 0小時
復甦組 4小時
復甦組 8小時
Fig.2 左方休克的心肌細胞由上而下隨著休克後的時間越來越長，細胞質 染色淡化，細胞的排列漸漸鬆散；而在右方復甦組中上述情形皆有出現但 在任何相對時間都較休克組輕微
p-NFκB 65 kD
Sham Shock Resuscitation
p-NFκB/β-actin
Fig.3 Nuclear factorκB (NFκB) 和磷酸化 NFκB(p- NFκB) 在對照 組、休克組、休克加上復甦組在休克或復甦治療後第 0、4、8 小時的表現 量
* 相對於對照組 p<0.05 ; # 相對於休克組 p< 0.05
Control
S0 R0 S4 R4 S8 R8
TNF-α 17 kD
Sample
Sham Shock Resuscitation
0 hr
β-actin 46 kD
Sham Shock Resuscitation
0
Sham Shock Resuscitation
FADD
t-Bid
22 kD
Control
S0 R0 S4 R4 S8 R8
β-actin 46 kD
22 kD Bid
Sample
Bid/β-actin
Sham Shock Resuscitation
t-Bid
23 kD Bax
Control
S0 R0 S4 R4 S8 R8
β-actin 46 kD
Bax
p-IGF-I receptor
100 kD
Control S0 R0 S4 R4 S8 R8
β-actin 46 kD
p-IGFIR/β-actin
p-IGFIR
Sample
Sham Shock Resuscitation
0
p-Akt 60 kD
β-actin 46 kD
Control
S0 R0 S4 R4 S8
p-Akt
Sample
p-Akt/β-actin
Sham Shock Resuscitation
0
DAPI TUNEL MERGE
Control 17.83%
Sock 0hr 58.39%
Resuscitation 0 hr 23.4%
Fig.10 對照組、創傷併出血組、休克後復甦組在休克後第 0 小時的心肌 細胞 DAPI、TUNEL 染色的變化以及二者合併圖(圖中百分比為凋亡細胞在 此畫面中的細胞數中所占比例)
DAPI TUNEL MERGE
Sock 4hr 51%
Resuscitation 4hr 35.14%
Fig.11 創傷併出血組、休克後復甦組在休克後第 4 小時的心肌細胞 DAPI、
TUNEL 染色的變化以及二者合併圖(圖中百分比為凋亡細胞在此畫面中的 細胞數中所占比例)
DAPI TUNEL MERGE
Sock 8 hr 53.14%
Resuscitatio 8 hr 23%
Fig.12 創傷併出血組、休克後復甦組在休克後第 8 小時的心肌細胞 DAPI、
TUNEL 染色的變化以及二者合併圖(圖中百分比為凋亡細胞在此畫面中的 細胞數中所占比例)
BCl2 Bax
(Cytosolic) Cytochrome c
Mitochondrial dependent pathway
Fas
Cardiac apoptosis
in trauma/ hemorrhagic shock rats
-Fas dependent pathway
FADD Bid tBid
Caspase cascade
Fig.13 根據實驗結果，我們對於心肌細胞經過創傷併發出血性休克而引 起的凋亡過程(虛線箭頭)，以及復甦治療效果(實線箭頭)提出的細胞內路
Fig.13 根據實驗結果，我們對於心肌細胞經過創傷併發出血性休克而引 起的凋亡過程(虛線箭頭)，以及復甦治療效果(實線箭頭)提出的細胞內路