第二章 材料與方法
2.5 細胞培養
2.5.1 Huh7 (Human hepatoma cell line)
Huh7為來自57歲的日本男性之肝臟細胞，屬於分化良好的肝癌
細 胞 (Hidekazu et al., 1982)，培養於添加10% 胎牛血清 (FBS) (HycloneTM)的DMEM (Hyclone)，100 Units/ml 青黴素 (Penicillin) 及 100 μg/ml 鏈黴素 (Streptomycin) (GIBCO, USA)中。
2.5.2 Replicon
由 Huh7 細胞轉殖基因型 1b 中與 HCV 複製相關的基因，包括 5’-UTR、3’UTR 及 NS3-NS5B 部分，在 NS5A 基因上有 adaptive mutation，在轉譯出的胺基酸 1179 的位置，由原本的絲胺酸置換成白
胺酸，另外，還包括可以分解 Neomycin 的 neor 基因方便用於篩選 (Blight et al., 2000) (附圖二)，培養於添加 10% FBS 的 DMEM (HycloneTM) ， 100 Units/ml Penicillin ， 100 μg/ml Streptomycin (GIBCOTM)及 800 μg/ml G418 (Geneticin®)。
在加藥實驗中，先以 3.5 cm dish 培養 5X105 Replicon 細胞，8 小 時後以PBS 清洗細胞兩次，分別加入 DMSO 1 μl/ml 及 PEG-interferon 20 ng/ml，培養 48 小時後收細胞 RNA。
2.5.3 Con1 細胞
Replicon 細胞能夠在細胞中複製，卻無法產生病毒顆粒，Con1
細胞由德國慢性肝炎病人所分離出來，屬於 1b 基因型，增加 3 個 adaptive mutation 來提高複製的效率，分別為 E1202G、T1280T 及 K1846T (Pietschmann et al., 2002)。
Con1 細胞就是利用 Huh7 細胞轉殖一段 Full-length Con1 DNA，
培養於添加10% FBS 的 DMEM，100 Units/ml Penicillin，100 μg/ml Streptomycin、800 μg/ml G418 及 100 μM NEAA (GIBCOTM)。
2.5.4 Huh7.5
Replicon 細胞 (NS5A 不具 adaptive mutation) 經由 IFN-α 治療，
利用 RT-PCR 的方式確認細胞中沒有 HCV RNA 存在，形成 highly permissive cell line (Blight et al., 2002)。Huh7.5 培養於添加 10% FBS
的DMEM，100 Units/ml Penicillin，100 μg/ml Streptomycin 及 100 μM NEAA。
2.6 核酸萃取 (RNA extraction)
以 PBS 清洗細胞兩次，加入 0.5 ml REzolTMC&T，靜置 5 分鐘後 移至1.5 ml eppendorf，加入 0.1 ml chloroform，vortex 數次至均質狀，
以 13000 rpm 離心 15 分鐘，取上清液，加入等體積的 isopropanol，
放置在-80℃ (30 分鐘以上)，以 13000 rpm 離心 15 分鐘，以 1 ml 70%
ethanol 清洗 RNA 兩次，去除 ethanol，以 20 μl ddH2O 溶解 RNA。
2.7 反轉錄即時聚合酶連鎖反應 (Reverse-transcription Real-time Polymerase Chain Reaction)
RT-Real-time-PCR 之混合物包含有 100 ng RNA，10 μl power
SYBR Green Master Mix (ABI)，125 nM Forward primer，125 nM Reverse primer，0.625 unit/μl Reverse Transcriptase (ABI)，0.00125 unit/μl RNase Inhibitor (ABI)，補 ddH2O 至 20 μl，以 ABI PRISM 7000
進行反應，反應條件分為3 個 stages，stage 1 進行 reverse transciption，
stage 2 及 3 進行 PCR，stage 1：48℃，30 min；stage 2：95℃，10 min；
stage 3：95℃，15 sec，60℃，1 min (40 cycles)。本實驗使用的引子 序列如下：ENA-78-F (5’-TTACAGACCACGCAG-3’)，ENA-78-R (5’- GCTTCTGGATCAAGACA-3’)，HCV-F (5’-TGCGGAACCGGTGAGT ACA-3’) ， HCV-R (5’-CTTAAGGTTTAGGATTCGTGCTCAT-3’) ， β-actin-F (5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’)，β-actin-R (5’- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATG-3’)
2.8 二維電泳 (2-Dimensional Gel Electrophoresis)
在10 cm 培養皿中，培養 1 x 106的Huh7 或 Replicon，經過 24 小時，以2 次 5 ml PBS 清洗後，加入含有 0.2% FBS、100 Units/ ml Penicillin 及 100 μg/ml Streptomycin 之 DMEM，在 37℃及 5% CO2培 養72 小時，收集 supernatant，離心 3000 rpm，15 min，取上清液，
以5 kD 蛋白質濃縮管濃縮蛋白，濃縮好的蛋白等比例加入 rehydration buffer (8 M urea、2% CHAPS、1% DTT 及 0.5% Bio-lytes)，打超音波 兩次，每次5 min，中間間隔 5 min，放置在 4 ℃6 小時，測蛋白濃度，
取300 μg 的蛋白補 rehydration buffer 至 300 μl，加入 5 μl bromophenol blue。
將sample 加入電極板中，加入撕開的 strip (pH 4-7)，避免氣泡的 產生，靜置1 小時，加入 2 ml mineral oil，上機 50 V rehydration 12 小時，在兩端電極放入電極墊 (wick)，設定 run program (S1- 250 V，
15 分鐘；S2- 10000 V linear，3 小時；S3- 10000 V，60000 VHrs；S4- 500 V，12 小時)。
取出 strip 並利用 3M paper 除去 mineral oil，經過 equilibration buffer 平衡膠條後以 12% SDS-PAGE 跑膠 15 mA/Gel 2 小時，20 mA/Gel 8 小時。
2.9 硝酸銀染色 (Silver stain)
跑膠結束後，利用 solution A (50% methanol and 25% acetic acid) 固定至少兩個小時，接著，加入solution B (30% methanol)，搖晃 15 分鐘，以二次水清洗三次，每次 5 分鐘，加入 solution C (0.8 mM Na2S2O3‧5H2O)，搖晃 2 分鐘，以二次水清洗三次，每次 30 秒，加入 含銷酸銀的solution D (0.2% AgNO3)，搖晃 25 分鐘，以二次水清洗 兩 次 ， 每 次 30 秒 ， 加 入 solution E (0.28 M Na2CO3, 0.0185%
formaldehyde and 0.016 mM Na2S2O3‧5H2O)使膠呈色，快速的用二次 水清洗後，加入 solution F (0.042 M Na2EDTA‧2H2O)停止反應的進行 約10 分鐘，最後以二次水取代 solution F 保存膠，將結果掃描成 TIF 檔案格式，並使用ImageMasterTM 2D Platinum Software (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)進行分析。
第三章 結果
3.1 利用蛋白質晶片分析病人治療前後一個月細胞激素的變化
在兩次蛋白質晶片的實驗中，我們分別分成兩個部分來討論，第 一部份比較治療成功與治療失敗在治療前細胞激素表現量，第二部份 比較治療成功與治療失敗在治療前與治療後1 個月的變化：
本研究使用的蛋白質晶片具有 79 種細胞激素，在第一組的結果
中，治療前，治療成功有 13 個細胞激素的表現量高於治療失敗，分
別為ENA-78、IL-1α、MIP-1、RANTES、EGF、IGF-1、Angiogenin、
Oncostain M、VEGF、Leptin、IGFBP-1、IGFBP-2 及 TGF- 2；而治
療成功有 4 個細胞激素的表現量低於治療失敗，有 GRO、BDNF、
IGFBP-3 及 TGF- 3。治療後 1 個月細胞激素與治療前比較，在治療 1
個月後，有 3 個細胞激素在治療成功會下降，且治療失敗不變或上升
的有IL-1α、RANTES 及 Oncostain M；治療 1 個月後，治療成功不變，
且治療失敗會下降的有 Angiogenin、BDNF、IGFBP-1、IGFBP-2、
NAP-2 及 TIMP-2 (圖 1)。
在第二組蛋白質晶片的結果中，治療前，治療成功有 10 個細胞 激素的表現量高於治療失敗，分別有ENA-78、GRO、IL-8、RANTES、
EGF、Angiogenin、PDGF-BB、IGFBP-1、IGFBP-2 及 NT-4；而治療
成功有2 個細胞激素 GROα 及 IL-1α 的表現量低於治療失敗。而在治 療後 1 個月，治療成功下降，且治療失敗不變或上升的有 MIP-1δ、
RANTES、EGF、BDNF、NT-4、Osteoprotegerin 及 TIMP-1；治療成 功不變，且治療失敗上升的有IGFBP-2 及 TIMP-2。
比對兩組蛋白質晶片結果後得到：在治療之前，治療成功細胞激
素表現量高於失敗的有 ENA-78、RANTES、EGF、Angiogenin、
IGFBP-1 及 IGFBP-2；而治療成功細胞激素表現量低於失敗僅有 GRO。治療後 1 個月比上治療前，RANTES 是唯一在兩組結果相同，
均為治療成功下降，而失敗不變 (圖 2)。
3.2 測試酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)之穩定性
在分析蛋白質晶片的結果後，接下來，我們需要利用酵素連結免 疫吸附試驗的方式來確認蛋白質晶片的結果，為了確定酵素連結免疫
吸附試驗的方式實驗的穩定性及再線性，在不同的時間點操作 EGF
ELISA，先將 EGF standard 配製成 125 pg/ml，再以序列稀釋分別配 置出62.5、31.25、15.63、7.81 及 3.91 pg/ml，以 ELISA 方式操作 15
次，計算其平均值、標準差及變異係數，在這 15 次實驗中，每次操
作均為二重複，二重複的變異係數小於 10%，而實驗與實驗間的變異
係數也在10%以下 (圖 3)。
3.3 以酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)確認細胞激素在 HCV 治療的 變化
在蛋白質晶片的結果中，在治療後比治療前，治療成功 RANTES
的表現量會下降，且治療失敗沒有變化。利用 ELISA 來確認一組病 人的蛋白質晶片結果，顯示 ELISA 的結果與蛋白質晶片吻合；但加 入更多病人後，經由配對T-test 統計分析，RANTES 在治療成功與治 療失敗治療後的表現量不變 (p>0.1) (圖 3)。
EGF 在蛋白質晶片得到的結果為治療前，治療成功的表現量高於
失敗，治療後比上治療前，治療成功下降，治療失敗不變。兩組病人 經 ELISA 確認後，結果與蛋白質晶片吻合；加入更多病人後，在治 療前，在 Wilcoxon 的統計結果中，治療成功與治療失敗沒有統計上 意義 (p=0.3219)，而比較治療後 1 個月與治療前，治療失敗與成功的 EGF 表現量下降，在配對 T-test (p=0.008 及 0.004)有統計上的意義 (圖 4)。
ENA-78 在蛋白質晶片的結果為，治療前，治療成功的表現量高
於失敗，而治療成功與失敗在治療後表現量均會下降。在兩組病人的 ELISA 與蛋白質晶片得到一致的結果；加入更多病人得到，治療前，
在 Wilcoxon 的統計結果中，治療成功與治療失敗沒有統計上意義
(p=0.4825)，而治療後，經由配對 T-test 得到治療成功與失敗的表現 量下降具有統計上意義(p=0.008 及 p=0.004)，將病人的治療後 1 個月 及治療前的 ENA-78 相除，得到治療成功下降的比率會小於治療失 敗，兩者下降的比率經由 Wilcoxon test 統計的結果具統計上意義 (p=0.014) (圖 5)。
IL-1α 在蛋白質晶片中，治療前，治療成功的表現量小於失敗，
治療後比治療前，治療成功下降，失敗不變。在 ELISA 的結果顯示，
第一組病人結果與蛋白質晶片一致，但第二組病人治療失敗可能因為 IL-1α 蛋白的表現量低，所以在治療後沒有明顯變化，但 IL-1α 可能 是調控 ENA-78 的上游分子，並且在文獻中顯示 HCV 會刺激肝小葉 產生IL-1α (Kasprzak et al., 2004)，因此，希望經由加入更多的病人，
來確認 IL-1α 在治療成功與失敗間的差異，治療成功會上升利用
Wilcoxon 統計在治療前不具統計意義(p=0.389)，治療失敗在治療後 下降，配對T-test 具有意義(p=0.064) (圖 6)。
3.4 使用 SAS 統計軟體建立 ENA-78 及 ENA-78 合併 EGF 與 IL-1α 預測治療結果模型
線性迴歸通常是在解釋兩組連續變數的關係，經由解釋變數的值 來預測或估計反應變數的值，而我們的反應變數為二元分類，治療成
功與治療失敗，在希望利用解釋變數的值來預測或估計二元反應變數 的值，我們使用了羅吉斯迴歸 (logistic regression)的方式。將單一的
解釋變數，例如治療前的數值、治療後1 個月數值、治療前後相除或
相減，或合併兩種及三種解釋變數帶入羅吉斯迴歸中，選擇較有統計 意義的迴歸方程式，計算出所有病人的成功機率，利用成功的機率與 治療成功及失敗繪出ROC curve，選擇最靠近 ROC curve 的左上角，
即擁有最佳的敏感性及特異性作為cut-off value。
我們使用單一種細胞激素來建立模型時，唯一看到 p<0.1 的只有 ENA-78，所預測出的模式為：
ln (p/(1-P)) = 1.5291 + 0.00042* ENA-78 (1M) – 2.9611* ENA-78 (1M/0M)
P=0.0724由 ROC curve (圖 7)得到曲線下積分面積為 0.796，cut-off value
為0.63，敏感性是治療成功被我們預測為治療成功的比率為 61%，特 異性是治療失敗中被我們預測為治療失敗的比率為92.9%，陽性預測 率為成功機率高於cut-off value 且為治療成功的比率為 91.6%，陰性 預測率為成功機率低於cut-off value 且為治療失敗的比率為 65%。
而將 ENA-78、IL-1α 及 EGF 同時丟進預測模型，得到的模型為：
ln (p/(1-P)) = 3.2432 + 0.00104* ENA-78 (1M) + 7.8938* ENA-78 (1M/0M) – 0.00081* EGF (0M) –0.5919* IL-1α (1M/0M)
p=0.0089
由 ROC curve (圖 8)得到曲線下積分面積為 0.875，cut-off value 為0.6，敏感性有 87.5%，特異性是 83.3%，陽性預測率為 87.5%，陰 性預測率為83.3%。
3.5 經由所建立的 ENA-78 預測模型進行 Blind test
以 ELISA 偵測 22 個未知治療結果病人的治療前及治療後 1 個月
的血漿中ENA-78 蛋白表現量，將結果帶入 ENA-78 的預測模型中，
計算出成功的機率後，以成功機率0.63 為 cut-off value，成功機率小 於 0.63 判定為失敗，成功機率大於 0.63 判定為成功，經過比對後，
PPV 為 50%，而 NPV 為 37.5% (圖 9)。
3.6 以定量聚合酶連鎖反應分析 ENA-78 在肝癌相關細胞中 mRNA 的表現
治療慢性 C 型肝炎後 1 個月，血漿中 ENA-78 的蛋白量會下降，
但不清楚在HCV 的感染下，細胞中 ENA-78 的表現是否也有所改變。
因此我們抽取下列細胞的 RNA，包括 Huh7，含有 HCV 全長及複製 區域之Con1 及 Replicon 細胞，以及用干擾素處理至無法偵測出 HCV
RNA 的 Huh7.5 等，藉由反轉錄即時聚合酶連鎖反應的方式，觀察 HCV 及 ENA-78 的 RNA 表現量 (圖 10)。
在未處理的 Replicon 與 Con1 細胞中，ENA-78 mRNA 的表現量 高於不具有HCV 基因的 Huh7 細胞，而 Con1 及 Replicon 細胞經干擾 素處理後，HCV RNA 會下降。另外 Con1 的 ENA-78 mRNA 會上升，
而Replicon 在 HCV 有下降的情形，ENA-78 mRNA 沒有變化。
3.7 以定量聚合酶連鎖反應分析 ENA-78 在中周邊單核球細胞 mRNA
3.7 以定量聚合酶連鎖反應分析 ENA-78 在中周邊單核球細胞 mRNA