尋找評估慢性C型肝炎經由長效型干擾素及類核苷酸治療成效之預測因子; Potential biomarkers to predict sustained virological response of peginterferon plus ribavirin therapy in patients with chronic hepatitis C
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(2) 致謝 拿到學位了，第一個要感謝的人就是鄭如茜老師，謝謝老師總是 包容我不成熟的態度，在我失去信心的時候，從來就沒放棄過我，永 遠站在為學生設想的立場，嚴謹與堅持的態度面對研究中的每個細 節，讓我在碩班兩年中得到不少的寶貴經驗。 謝謝曾慶平老師擔任研究進度報告的指導老師及口試委員，謝謝 老師在論文格式及內容上的要求及指導，也謝謝老師在百忙中還特地 幫我修改論文；謝謝邱全芊老師指導我的研究進度報告口試，謝謝老 師提供實驗上的方向及建議，及實驗結果的呈現。 還要謝謝生統中心的吳弘達老師，謝謝老師在短時間內，讓我了 解統計的概念，以及如何使用統計軟體來整理實驗結果，也謝謝懿諄 與保萱，在當我有問題或困難時，總是適時的提供援助。謝謝千凌學 姊在實驗方面的幫忙，提供很多想法來解決我的問題。 當然，最要感謝的是研究室中所有的人，謝謝第一個敎我做實 驗的長青學長，對我很好的维洲學長和菇學姊，喜歡在晚上做實驗的 丞凱學長，從大ㄧ就是室友的鳳儀和惠琳，老是在睡覺的建宇。感謝 美惠學姊不論是在實驗上或報告及論文中所提供的想法及經驗，也謝 謝從大學時期就在同一實驗室的景堂，謝謝羽伶整理的資料，以及花 時間跟我討論統計上的問題，謝謝家帆，你的快樂也總感染我的情.
(3) 緒，嬿如，謝謝你在準備東西的時候，永遠都會想到我，謝謝耀文老 是聽我抱怨，幫我做一些雜七雜八的事情，會幫我養細胞的詠薷跟孟 弘，以及其他的夥伴俊龍、德欣及騰彥的幫助。還有，也謝謝所有在 研究所一起奮鬥的同學。 最後，謝謝我的家人，你們的支持陪我度過這兩年，最後，將 論文獻給我的父母。. II.
(4) 摘要 C 型肝炎病毒是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要致病因子之 一，治療的方式主要是利用干擾素與雷巴威林(ribavirin)的合併治療， 因病毒特性與宿主的不同約有 50-80%的治癒成效，治療成效的檢視 時間點往往在治療後第 3 個月，由於治療過程會對病人產生極大的副 作用，因此期望將檢測的時間點提早在治療後第 1 個月。由於細胞激 素及驅化激素是在宿主細胞感染時重要的防禦機制，因此本研究以細 胞激素為標的，利用蛋白質晶片，大量篩檢在 C 型肝炎治療前與治 療後 1 個月，治療成功及失敗間，細胞激素表現的差異，並以酵素免 疫分析法進行確認，結果顯示在 EGF、ENA-78 及 IL-1α 具有統計上 意義。以 ENA-78 進行預測，有 61%的敏感性，92.9%的特異性，91.6% 的陽性預測率及 65%的陰性預測率。若合併 ENA-78、EGF 及 IL-1α 來預測，有 87.5%的敏感性，83.3%的特異性，87.5%的陽性預測率及 83.3%的陰性預測率。因此，多種細胞激素合併進行預測能提高預測 的正確性。此外，我們利用二維電泳的方式，分析 Huh7 及帶有 C 型 肝炎病毒基因體的 Replicon 細胞之分泌性蛋白質，經由質譜儀分析及 蛋白質資料庫的搜尋，會比對出 3 個在兩者間具差異性的蛋白質，分 別是參與細胞骨架、蛋白質分解與運輸的相關蛋白。本研究顯示，C 型肝炎病毒感染細胞確實會刺激特殊的細胞因子，這些細胞因子分泌 到血液中有機會做為診斷預後的指標，而它們在 C 型肝炎病毒感染 的過程中所扮演的機制仍有待進一步研究。. III.
(5) Abstract Infection of hepatitis C virus leads to chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Combination of pegylated interferon-α (PEG-IFN-α) and ribavirin is currently standard treatment strategy, and results in a sustained virologic response about 50-80% depending on host and viral characteristics. The third month post-treatment is the checkpoint of efficacy. Due to the severe side effects, we hope to ahead of time after therapy. Cytokines and chemokines play important roles during virus infection. The high-throughput technology, protein array, was applied to screen the cytokines in patient plasma before and after one-month of treatment by pegylated interferon-α and ribavirin. The results from array analysis were then confirmed by ELISA. Three cytokines, EGF, ENA-78, and IL-1α show statistically significant differences between the two groups. ENA-78 had the prediction of SVR with sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) of 61%, 92.9%, 91.6%, and 65%, respectively. Combination of the three cytokines had higher accuracy of prediction with sensitivity, specificity, PPV, and NPV of 87.5%, 83.3%, 87.5%, and 83.3%, respectively. Taken together, prediction with combination multiple cytokines will elevate higher accuracy of prediction. Besides, two-dimensional electrophoresis was used to analyze secreted protein from Huh7 and HCV subgenomic replicon cells. Three proteins over-expressed in HCV subgenomic replicon cells were identified, which were related to cell skeleton, ubiqutination, and transporter, respectively. Taken together, Infection of HCV indeed stimulate specific cellular factors, and may secret to circular blood as prediction marker for prognosis. The roles of theses cellular factors in HCV infection is worthy to investigate further.. IV.
(6) 縮寫表 BSA. bovine serum albumin. DMEM. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium. EGF. epidermal growth factor. ELISA. enzyme-linked immunosorbent assay. ENA-78. epithelial neutrophil-activating protein 78. FBS. fetal bovine serum. G418. neomycin. IL-1α. interleukin-1 alpha. NEAA. non-essential amino acids. NPV. negative predictive value. PCR. polymerase chain reaction. PPV. positive predictive value. RANTES. regulated upon activation, normal T-cell expressed, and presumably secreted. RT. reverse-transcription. TMB. 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine. V.
(7) 目錄 標題. 頁碼. 致謝 ………………………………………………………………….. I 中文摘要 …………………………………………………………….. III 英文摘要 …………………………………………………………….. IV 縮寫表 ……………………………………………………………...… V 第一章 序論 1.1 C 型肝炎病毒 ………………………………………………. 5 1.2 C 型肝炎病毒的構造及功能 ………………………………. 7 1.3 C 型肝炎的治療 ……………………………………………. 12 1.4 C 型肝炎治療成效的評估…………………………………... 16 1.5 細胞激素與 C 型肝炎病毒感染…………………………….. 20 1.6 研究動機與策略……………………………………………... 27 第二章 材料與方法 2.1 檢體收集及分離 …………………………………………….. 28 2.2 血漿中細胞激素分析 ……………………………………….. 28 2.3 酵素連結免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ……………………...……………….………….…….. 30 2.4 預測模型 …………………………………………………….. 31 2.5 細胞培養 …………………………………………………….. 33 1.
(8) 2.6 核酸萃取 (RNA extraction) …...……………………………... 34 2.7 反轉錄即時聚合酶連鎖反應 (Reverse-transcription Real-time Polymerase Chain Reaction)…………………...…………….. 35 2.8 二維電泳 (2-Dimensional Gel Electrophoresis)………………35 2.9 硝酸銀染色 (Silver stain)………………………….…..…….. 36 第三章 結果 3.1 利用蛋白質晶片分析病人治療前與治療後一個月細胞激素的 變化 …………………………………………………………... 38 3.2 測試酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA)之穩定性 …………... 39 3.3 以酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA)確認細胞激素在 HCV 治療 的變化 ……………………………………………………….. 40 3.4 使用 SAS 統計軟體建立 ENA-78 及 ENA-78 合併 EGF 及 IL-1α 預測治療結果模型………………………………..…………. 41 3.5 經由所建立的 ENA-78 預測模型進行 Blind test …………. 43 3.6 以定量聚合酶連鎖反應分析 ENA-78 在肝癌相關細胞中的 mRNA 表現 …………………………………………………. 43 3.7 以定量聚合酶連鎖反應分析 ENA-78 在周邊單核球細胞的 mRNA 表現 …………………………………………………. 44 3.8 利用蛋白質二維電泳方法觀察肝癌相關細胞之分泌性蛋白 質 ……………………………………………………………. 45 2.
(9) 第四章 討論 ……………………………………………………….. 46 第五章 結論 ……………………………………………………….. 54 第六章 參考文獻 ………………………………………………….. 55. 3.
(10) 圖表目錄 標題. 頁碼. 圖 1 ………………………………………………………………….. 70 圖 2 ………………………………………………………………….. 71 圖 3 ………………………………………………………………….. 72 圖 4 ………………………………………………………………….. 73 圖 5 ………………………………………………………………….. 74 圖 6 ………………………………………………………………….. 75 圖 7 ………………………………………………………………….. 76 圖 8 ………………………………………………………………….. 77 圖 9 ………………………………………………………………….. 78 圖 10 ………………………………………………………………… 79 圖 11 ………………………………………………………………… 80 附圖一……………………………………………………………….. 81 附圖二……………………………………………………………….. 81. 4.
(11) 第一章 序論 1.1 C 型肝炎病毒 美國的 National Institutes of Health (NIH)在 1970 年發現大部份的 輸血性肝炎並非 A 型或 B 型肝炎病毒所造成，基於這個理由，稱為 non-A，non-B hepatitis。在 1987 年 Qui-Lim Choo 和 George Kuo 利用 molecular cloning 方式分離出病毒，並在 1988 年被證實為 NANBH specimens 。 1989 年 Choo 等 人 將 其 研 究 成 果 發 表 在 科 學 雜 誌 (Science)，正式命名為 C 型肝炎病毒(Hepatitis C virus；HCV) (Choo et al., 1989)。HCV 分類上屬於黃熱病毒科 (Flavivirus)，具套膜及帶有 正股的 RNA，病毒的直徑約為 50 nm，有六種基因型 (重複 30-50% 基 因序列)，及超過 50 種副基因型 (重複 10-30% 基因序列) (Bukh et al., 1995)。主要基因型有 1a、1b、2a、2b、3、4、5 及 6。其中，1a 分 布的區域在美國及北歐，1b、2a 及 2b 屬於全世界都有分佈，2a 及 2b 大約 10-30% 分布在日本和義大利北部，genotype 3 主要在印度， genotype 4 發生在非洲及中東，genotype 5 發生於南非，genotype 6 多 半在香港或東南亞 (Hoofnagle et al., 2002 )。台灣主要的基因型為 1b 及 2a，南台灣約有 48-64.3% 的 1b 基因型，35.7-41.4% 的 2a 基因型 (Chen et al., 1994; Wu et al., 1994; Chan et al., 1995; Kao et al., 1995; Yu et al., 2001)，北台灣存在 58-73% 的 1b 基因型，7.4-26% 的 2a 5.
(12) 基因型 (Chen et al., 1994; Wu et al., 1994; Chan et al., 1995; Kao et al., 1995; Lin et al., 1996)。 HCV 感染六月內稱為急性期，大約有 60-70%的病人是沒有任何 症狀，部份的人會有食慾低落、疲倦、腹痛、黃疸及類似感冒的症狀。 在感染 HCV 1 至 3 星期後可在血液中偵測到 HCV 病毒，3 至 12 星 期可偵測到抗體，可利用 alanine aminotransferase (ALT)及 asparate aminotransferase (AST)來評估肝臟受損情形，約 15-50%病人可在急性 期時痊癒，其餘則會發展成慢性 C 型肝炎 (Di Bisceglie et al.,2000; Seeff et al., 2002)，慢性肝炎中有 20%會發展成肝硬化，其中每年約 3-6%肝臟代償功能減退，長期 HCV 感染每年約 4%發展成肝癌 (Hepatocellular carcinoma；HCC) (Di Bisceglie et al., 2000; National Institutes of Health, 2002)。. 6.
(13) 1.2 C 型肝炎病毒的構造及功能 HCV 基因序列約為 9600 nucleotides，在 5’及 3’端有 untranslated region (UTR)，分別約為 341 及 230 核苷酸，包含一個 open reading frame (ORF) ， 能 轉 譯 出 約 3000 個 胺 基 酸 的 polyprotein ， 經 由 cotranslation 及 posttranslation 會產生至少 10 個蛋白，包括結構性蛋 白 C、 E1、 E2、 p7，及非結構性蛋白 NS2、 NS3、 NS4A、NS4B、 NS5A 和 NS5B (參考附圖一) (Bartenschlager & Lohann, 2000)。 5’-UTR在核苷酸序列40-355號形成4個highly structured domain， 分別為domain I、II、III、IV。domain I在核苷酸序列5-20號形成 stem-loop，在轉譯時並非必須 (Rijnbrand et al., 1995; Honda et al., 1996)，但在RNA複製時卻相當重要 (Boyer et al., 1994)；domain 2-3 上 的 internal ribosomal entry site (IRES) 可 以 直 接 與 宿 主 的 40S ribosome及eIF3結合 (Pestova et al., 1998)，利用cap-independent的方 式在內質網上進行轉譯，domain 4含有stem-loop及轉譯起始點 (start codon)。 3’-UTR包含三個部分，可變區 (variable region)，依據不同基因 型，有27-70核苷酸長度的差異；尿嘧啶形成的poly-U及由98個核苷 酸序列所組成的 X region，X region包含三個 stem-loop，屬於序列高 7.
(14) 度保留區 (highly conserved region)，在 in vivo的實驗證明複製與 poly-U及 X region相關性較高 (Yanagi et al., 1999)。 結構性蛋白經宿主中的胜肽水解酶 (peptidase)切割成核心蛋白 (core protein)及套膜蛋白 (envelope protein)。核心蛋白的分子量為 21 kD，含有 RNA binding site、nuclear localization signal (NLS)。能夠組 成病毒的 nucleocapsid (Yasui et al., 1998)以及與宿主的蛋白反應而影 響細胞內 transcription、lipid metabolism、apoptosis 及 signaling pathway (Tellinghuisen et al., 2002)。目前研究顯示 core protein 會引起脂肪肝 (steatosis)及肝癌發生 (Moriya et al., 1998; Hope et al., 2002; Lerat et al., 2002)。ARF/F (alternative reading frame/frameshift) protein 分子量 為 17 kD (type 1a)或 1.5 kD (type 1b)，由於在轉譯 core protein 時核醣 體 (ribosome)移位 (frameshift)而產生，與病毒的複製有關 (Xu et al., 2001)。 套膜蛋白 (Envelope protein)包含 E1(a.a. 192-383)和 E2 (a.a. 384-746) ， 兩 者 皆 為 第 一 型 的 穿 膜 蛋 白 ， 在 內 質 網 上 進 行 醣 化 (N-linked glycosylation)，C 端具有 transmembrane domain (TMD)，可 促使 E1 及 E2 形成兩種形式的二聚體 (heterodimer)，雙硫鍵形成的 misfolded aggregates 及非共價鍵形成的 heterodimer，作為病毒套膜基. 8.
(15) 本單元。主要功能為與細胞膜上的受體結合，促使與細胞膜融合而感 染宿主 (Bartosch et al., 2003)，另一功能則是在病毒完成複製後，扮 演組裝病毒顆粒的角色。目前對於 E1 的了解甚少，只知道 E1 上帶 有許多厭水性胺基酸，可能的功能為膜融合 (membrane fusion) (Flint et al., 1999)；E2 有兩個高度變異區 (hypervariable region)，HVR1 及 HVR2，皆帶有鹼性胺基酸，少了 HVR1 會降低病毒的感染率 (Forns et al., 2000)，HVR2 對於細胞上的接受器 CD81 或 LDLR (low-density lipoprotein receptor) 有 高 度 親 和 性 ， 能 幫 助 病 毒 接 觸 細 胞 並 感 染 (Scarelli et al., 2002; Roccasecca et al., 2003)。 p7 protein 由 63 個胺基酸所組成的 polypeptide，分子量為 7 kD， 作 為 結 構 蛋 白 及 非 結 構 蛋 白 的 連 接 ， 含 有 兩 個 transmembrane domain，可形成六聚體 (hexamers)行使離子通道的功能 (Griffin et al., 2003; Pavlovic et al., 2003)，幫助病毒顆粒的釋放及成熟 (Carrasco et al., 1995)；此外，p7 可由內質網分泌至細胞質，可能在分泌途徑 (secretory pathway)中扮演具功能性的角色 (Carrere-Kremer et al., 2002)。 非結構性蛋白經由病毒本身的蛋白酶切割成 NS2-NS5B，NS2 屬 於沒有醣化修飾的膜蛋白，分子量為 21 kD，在形成病毒 RNA 複製. 9.
(16) 的複合體時，目前認為不需要 NS2 的參與 (Lohmann et al., 1999; Blight et al., 2000)。已知 NS2 的功能是能自行催化表現蛋白酶，利用 conformation-dependent 的機制切割 NS2-NS3 間連接 (Reed et al., 2000)，由於蛋白酶的活性會受到金屬離子例如 ZnCl2 的刺激，或者 EDTA 的抑制，猜測可能為 zinc-dependent metalloproteinase (Hijikata et al., 1993; Grakoui et al., 1993)。 NS3 由 621 個胺基酸所組成，分子量為 70 kD，其中 N 端 189 個 胺基酸序列為 serine proteinase domain，NS4A 包含 54 個胺基酸，分 子量為 8 kD，可穩定 NS3 結構並活化蛋白酶，切割 4A/4B、4B/5A 及 5A/5B 位置；C 端 442 個胺基酸為 helicase domain，有多種功能， 包括 NTPase 活性、與 RNA 結合及解 RNA 螺旋。Serine proteinase domain 能夠抑制 RIG-1 及 TLR3 的訊息傳遞；而 helicase domain 則與 細胞中 PKA、PKC、p53、H2B 及 H4 結合，但目前的機制尚未清楚 (Tellinghuisen et al., 2002)。 NS4B 由 251 個胺基酸所組成，分子量為 26 kD，屬於高厭水性 膜蛋白，主要的功能為改變膜的形狀，製造出 membrane web，提供 病毒複製或轉譯的場所 (Egger et al., 2002; Gosert et al., 2003)。 NS5A 由 147 個胺基酸所組成，屬於磷酸化蛋白，一般磷酸化蛋 10.
(17) 白約 56 kD，高度磷酸化蛋白約為 58 kD (Reed et al., 1998)。目前對 於 NS5A 在 HCV 複製時之功能仍未清楚，但由 NMR 得知在 N 端 α-helix domain 上具高度保留之極性胺基酸，可能在 HCV 複製時扮演 蛋 白 與 蛋 白 間 交 互 作 用 (Ramboarina et al., 2002) 。 NS5A 上 有 interferon sensitivity determining region (Enomoto et al., 1996)可能會對 抗干擾素的治療，另外，在體外試驗證明，NS5A 能夠抑制由雙股 RNA 活化的 protein kinase (Gale et al., 1998)。 NS5B由591個胺基酸所組成，分子量68 kD，屬於membraneassociated phosphoprotein，在C端的21個胺基酸含有transmembrane domain，屬於tail-anchored蛋白，能夠與內質網或高基氏體的細胞膜 結合 (Schmidt-Mende et al., 2001)，N端由530個胺基酸組成catalytic domain，區分成finger、palm及thumb等subdomain，在palm domain包 含酵素活性區 (enzyme acive site)，而finger domain與thumb domain會 形成球型分子來固定RNA (Biswal et al., 2004)。NS5B的角色為 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)，會與SNARE-like cellular membrane protein 及 human vesicle-associated membrane protein (VAMP)-associated protein of 33 kDa (hVAP-33)結合，被這些蛋白帶領 到ER中進行複製 (Tu et al., 1999)，先複製出一段負股的RNA，再利 用負股的RNA製造出正股的RNA。 11.
(18) 1.3 C 型肝炎的治療 1986 年，non-A，non-B hepatitis 開始在臨床上被治療(Hoofnagle et al., 1986)，而在 1988 年，產生了第一個由干擾素治療成功的病人， 而目前大部分使用長效型干擾素 (pegylated interferon alpha：Pegasys 或 PEG-Intron)合併 ribavirin 來治療慢性 C 型肝炎，依據基因型的不 同，給予 24 週或 48 週的治療，通常基因型 1 治療 48 週，而其它基 因型治療 24 週 (National Institutes of Health, 2002)。 HCV 在 治 療 的 過 程 中 會 出 現 三 種 反 應 ， 持 續 性 病 毒 反 應 (sustained virological response；SVR)，復發 (end-of-treatment response and relapse)，以及沒有反應 (non-response；NR)。其中 SVR 的定義 為在治療結束後，持續六個月不會偵測到血清中的 HCV RNA；而造 成復發的原因現在仍未十分清楚，有可能是治療的時間較短，ribavirin 之劑量不適當，或是與肝纖維化程度有關，大約有 1/3 慢性肝炎對於 治療沒有反應 (National Institutes of Health, 2002)。 病毒的感染會刺激第一型的干擾素的表現，包括有 interferon (IFN)-α、β、ω 及 λ，皆有抗病毒的功能 (Sen, 2001; Bekisz et al., 2004)，但卻很少可以被使用在臨床上 (Robek et al., 2005)，目前僅 IFN-α (α2a、α2b 及 consessus IFN)使用於 HCV 的治療；在生物體外 12.
(19) 經由第一型干擾素的刺激，會產生第二型的干擾素 (IFN-γ)，同樣也 具有抗病毒的功能 (Frese et al., 2002)，但有趣的是，外加的 IFN-γ 對 於人類感染 HCV 病毒的清除卻是無效的 (Soza et al., 2005)。 IFN-α 會刺激 IFN-stimulated genes (ISG)的表現，在細胞中會建立 起非病毒特異性的抗病毒狀態 (Sen et al., 2001; Bekisz et al., 2004)。 一般認為，血液中的 IFN-α 會與細胞表面的接受器結合，形成雙聚體 (dimer)後會活化與接受器相關的激酶，Janus-activated kinase 1 (Jak1) 及 tyrosine kinase 2 (Tyk2) (Gilmour et al., 1995; Gale et al., 2003)，而 活 化 的 激 酶 會 磷 酸 化 下 游 訊 息 傳 遞 蛋 白 ， signal transducer and activator of transcription protein 1 及 2 (STAT1 及 STAT2)，使兩者形成 雙聚體後進入細胞核中，並與 IFN-regulatory factor 9 (IRF-9)形成複合 體，結合 DNA 上 IFN-stimulated response element，大量表現 ISG，進 而影響病毒蛋白的轉譯，像是 protein kinase R (PKR)會磷酸化細胞中 的 eukaryotic initation factor 2 (eIF2)，抑制病毒蛋白的合成，而 2’,5’oligoadenylate synthetase (OAS)會活化 ribonuclease-L (RNase-L)，細胞 中的雙股 RNA 會被活化的 RNase-L 所分解 (Guo et al., 2005)。 在 Replicon 系統中，因為缺少了 IFN 訊息傳遞的路徑，所以 HCV RNA 的複製對於 ISG 的表現影響不大 (Lanford et al., 2003; Sumpter. 13.
(20) et al., 2005)，而外來的 IFN，不論是否活化 HCV 複製，都可以刺激 ISG 的產生並快速降低 HCV RNA (Blight et al., 2000; Guo et al., 2001; Zhu et al., 2003; Abe et al., 2005)。 在 感 染 HCV 的 人 類 周 邊 單 核 球 細 胞 (peripheral blood mononuclear cells)被證實 IFN 的治療會刺激基因的表現 (Ji et al., 2003)。在 liver biopsy 中，利用 microarray 的方式比較治療 PEG-IFN 及 RBV 前後，發現對於藥物治療無效的病人，ISG 會大量的表現， 而治療有效的病人則是與正常人相似 (Chen et al., 2005)，這個發現不 但證明治療無效的病人會刺激大量 ISG 的表現，也說明病毒或宿主會 活化 IFN 的抑制劑，達到抑制內生性或外來的 IFN。 Ribavirin 是鳥嘌呤核苷 (guanosine)的類似物，合成於 1970 年， 主要可以抑制 DNA 及 RNA 病毒的活性，最早用於治療呼吸融合細 胞病毒 (Respiratory syncytial virus；RSV)的感染，1990 年用於 HCV 單獨治療，但發現病毒的數量並未因此而減少，後來發現與干擾素合 併治療，不但能減少病毒量，也可以降低復發的機率 (McHutchison et al., 1999) 而在干擾素或長效型干擾素的治療下，病人會產生許多的副作 用，包括疲倦、頭痛、肌肉疼痛、噁心、嘔吐、發燒、體重減少、骨. 14.
(21) 髓抑制及憂鬱症…等。Ribavirin也會有疲倦、皮膚過敏、咳嗽類似感 冒症狀或者出現貧血等副作用 (National Institutes of Health, 2003)。. 15.
(22) 1.4 C 型肝炎治療成效的評估. 以往，C 型肝炎治療的成功與否要在治療結束後六個月，利用偵 測血漿中病毒 RNA 後才能判斷，但由於 IFN 與 ribavirin 在治療的過 程中會產生許多的副作用，所以越來越多人針對治療初期，發展生物 性因子 (biomarker)，用以預測將來治療成功的機率，目前，血漿中 HCV RNA 的變化及宿主本身之 SNP 是兩個主要的方向。 1.4.1 以 HCV RNA 的變化評估 C 型肝炎治療成效 2002 年，Kraus 等人在 453 個病人中發現，治療 12 週，即 EVR (early virologic response)，HCV RNA 如果有下降大於 2 個 log 值或偵 測不到 HCV RNA，則治療成功的機會約有 65%，反之，治療成功的 機會只有 3% (Kraus et al., 2002)。在同一年，Castro 等人在 66 個慢性 C 型肝炎病人的治療中，將 EVR 的時間提前到治療後第 4 週及第 8 週，即 RVR (Rapid virologic response)，在第 4 週下降大於 1 個 log 值、 第 8 週下降大於 2 個 log 值及第 12 週下降 3 個 log 值的陽性預測率， PPV (positive preditive value)，分別為 76%、78%及 89%，而陰性預測 率，NPV (negative preditive value)，均為 100%，得到在治療後第 12 週 HCV RNA 下降 3 個 log 值是預測治療成功較好的因子 (Castro et al., 2002)。而 2006 年，Yu 等人在 IFN/RBV 高劑量下治療 24 週，觀 16.
(23) 察治療第 2 週及第 4 週的病毒量變化，發現在治療後第 2 週，病毒量 下降大於 2 個 log 值，在 genotype 2 的病人 PPV 大於 93%，但 NPV 只有 30% 左右；而在治療後第 4 週，病毒量下降大於 2 個 log 值， 在 genotype 2 的病人中之 PPV 約有 92%，NPV 達到 100%，在 genotype 1 的病人中之 PPV 也有 49%，NPV 則為 100%，認為在高劑量 IFN/RBV 的治療下，能把病毒量的變化提前至治療後第 4 週 (Yu et al., 2006)。 1.4.2 以 Single nucleotide polymorphism (SNP)評估 C 型肝炎治療成效 除了病毒的 RNA 能評估治療成效外，在治療的過程中會因病毒 感染、干擾素的治療刺激宿主的基因表現，SNP 指基因組內 DNA 中 某一特定核苷酸位置上存在轉換(transition)、顛換(transversion)等變 化，這樣的變化有可能影響轉譯出蛋白質的穩定度，進而影響抗病毒 的結果，以下介紹與 HCV 感染或治療有關的 SNP。 研 究 顯 示 Interferon 的 治 療 HCV 的 病 人 會 產 生 myxovirus resistance protein A (MxA)蛋白，MxA 屬於 interferon-induced protein， 其 promoter 區域具有 SNP (G/T，nt-88)，同時治療成功的患者出現高 比例的 MxA T positive，同時具高 MxA mRNA 或 MxA 蛋白質的表現 量，推測 MxA T positive 在 IFN 治療的時候表現較多的蛋白質 (Hijikata et al., 2000；Suzuki et al., 2004)。 有 些 基 因 的 SNP 可用於預測 C 型 肝 炎 病 毒 的 治 療 ， 例 如 17.
(24) Osteopontin (OPN)。OPN 屬於 extracellular matrix protein，帶有一段 RGD motif，表現在活化的 kupffer cells 和 Stellate cells，作用是使 macrophages 移動到組織破壞的區域 (Kawashima et al., 1999)，可經由 免疫作用來對抗 HCV 的感染。2004 年在 OPN 上找到 4 種 SNPs，其 中-443 與其他 SNP 不同，與 HCV 病毒的活性有相關 (Mochida et al., 2004)，在 2005 年，Naito 等人研究 SVR 及 NR 與 OPN 的關係，發現 SVR 在 OPN -155 (G/G) (G/-)、-616 (T/T) (T/G)及-1748 (G/G) (G/A)占 84.6%，而在-443 (T/T)占 86.4%，所以，OPN promoter 區域之 SNP 能預測 HCV 治療成效 (Naito et al., 2005)。 在 2006 年，Hwang 等人在 317 位台灣地區慢性 C 型肝炎病人中， 研究與 HCV 相關的 SNP，主要有 7 個基因，分為三類來源：第一類 基因是經由 IFN-α 刺激而產生，為 adenosine deaminase, RNA-specific (ADAR)、interferon consensus sequence binding protein 1 (ICSBP1)及 interferon-induced protein 44 (IFI44)；第二類基因產生於宿主免疫反 應，分別為 transporter 2 (TAP2)及 transforming growth factor, β receptor association protein 1 (TGFBRAP1)；第三類基因會促使細胞凋亡或增 生，有 caspase 5 (CASP5)及 fibroblast growth factor 1 (FGF1)。其中， TGFBRAP1 具有高的 PPV (80%)，但在 317 個病人中卻只佔 7.9%， IFI44 在病人中佔有較高的比率 (35.3%)，但 PPV 僅有 75%，將所有. 18.
(25) 的 基 因 合 併 病 毒 基 因 型 來 分 析 ， 病 人 的 PPV 由 73.48% 上 升 至 80.21%，NPV 則由 84.62%下降至 68.42% (Hwang et al., 2006)。. 19.
(26) 1.5 細胞激素與 C 型肝炎病毒感染. 細胞激素最重要的角色為活化白血球，使白血球與上皮細胞作 用，穿過內皮層，進入組織中執行功能 (Mackay et al., 1996; Adams et al., 1997; Luster et al., 1998)。細胞激素會活化白血球上的β1及β2 integrins，使白血球停止轉動並且貼附在血管壁上 (Tanaka et al., 1993; Camapbell et al., 1996; Carr et al., 1996)。因為細胞激素的作用，使白 血球可穿透過內皮層及細胞外的基質 (extracellular matrix)，直接到達 正在發炎的位置 (Baggiolini et al., 1998)，細胞激素與proteoglycan結 合，所以能停留在內皮的glycocalyx及細胞外基質，扮演吸引白血球 至發炎處的角色 (Tanaka et al., 1993; Tanaka et al., 1998)。 在 HCV 感染過程中，在急性期時，細胞激素與其接受體的作用， 將會吸引大量的 T 細胞進入肝小葉中，辨認已感染 HCV 細胞中病毒 之抗原，引起免疫反應，達到病毒的清除，假如免疫反應的效果不好 或產生 T 細胞的速度下降，病毒便會持續的感染，造成慢性肝炎的發 生，在組織不斷的被破壞下，未來會產生肝臟纖維化或者是肝硬化 (Seeff et al., 1997)。現在對於 HCV 如何逃過免疫反應，造成持續性的 感染仍未清楚 (Semmo et al., 2007)，當 HCV 感染肝細胞，病毒進行 複製時會刺激 IFN-α 及 IFN-β 的表現，並活化下游基因及 IFN-γ，大. 20.
(27) 量產生影響病毒複製及轉譯的蛋白 (Meurs et al., 2007)。而當 C 型肝 炎病毒轉譯出結構性及非結構性蛋白質像 core 和 NS3 時，也會刺激 巨噬細胞 (Kupffer)產生 IL-10 與 TNF-α (Chang et al., 2007)。同時， NS5A 會 刺 激 具 有 anti-interferon 功 能 的 IL-8 產 生 ， 藉 由 抑 制 transducers and activators of transcription 1 (STAT1) 的 serine 與 tyrosine 及 STAT2 的 tyrosine 磷酸化，達到抑制干擾素的產生 (Wertheimer et al., 2007)。接下來，將會介紹各類的細胞激素與 HCV 的關係。 細 胞 激 素 可 分 為 四 大 類 ， 第 一 類 為 chemokine ， 第 二 類 為 interleukin，第三類為growth factor，第四類歸類為其他。 第一類的細胞激素為chemokine，大小約為8-10 kD，在成熟的蛋 白中依據 cystein的位置可以分為四類，分別為C、CC、CXC及CX3C， 與HCV相關的主要有CXC家族及CC家族。 在CXC家族中通常還區分成N端是否具有ELR motif (glutamic acid-leucine-arginine)。interleukin-8 (IL-8)具有ELR motif，能夠吸引嗜 中性球(Larsen et al., 1989)。感染HCV病人的IL-8與正常人並沒有差 異，而患有酒精性肝炎的病人(alcoholic liver disease；ALD)之IL-8則 會降低(Neuman et al., 2001)。不具ELR motif的CXC家族包括有 21.
(28) interferon-inducible protein (IP-10) 及 monokine induced by IFN-γ (Mig)，主要的功能是吸引淋巴球(Farber et al., 1993; Liao et al., 1995; Taub et al., 1996)。在感染HCV後，IP-10在肝組織中的mRNA及血清 中 的 蛋 白 均 會 高 於 正 常 人 ， 但 兩 者 並 沒 有 正 相 關 (Mihm et al., 2003)，血清中的IP-10在治療24或48週(治療結束時)會下降，在治療 前、治療結束及治療結束後6個月，治療成功的蛋白量均會小於治療 失敗 (Apolinario et al., 2004)。 CC家族的主要功能是吸引T細胞，包括有macrophage chemotactic protein (MCP-1) 、 macrophage inflammatory protein (MIP-1α) 及 RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed, and presumably secreted)。MCP-1是由單核球或活化的hepatic stellate cells (HSC)細胞分泌，主要的功能為吸引淋巴球及單核球進入肝臟，清除. 組織受損的區域。在感染慢性C型肝炎時會被刺激產生，感染HCV在 肝組織內的MCP-1 mRNA的表現較正常人高 (Leroy et al., 2004)，而 在血清蛋白中，治療前，C型肝炎病人與正常人並無差異，但在治療 16週後，C型肝炎病患的MCP-1會高於正常人，且治療失敗的病人較 為顯著(Panasiuk et al., 2004)。將HCV clone至Huh7及HepG2中，會促 使RANTES及MCP-1的產生 (Soo et al., 2002)，感染HCV病人肝臟中 的RNATES mRNA會高於正常人7.2倍 (Nischalke et al., 2004)。 22.
(29) 第二類的細胞激素為介白素 (Interleukin)，區分為Th1及Th2兩 類，Th1包括interleukin-2 (IL-2)、Tumor necrosis factor α (TNFα)及 interferon gamma (IFNγ)，能夠產生毒殺T細胞 (cytotoxic T cell)及活化 殺手細胞 (nature killer cell；NK cell)等抗病毒的免疫反應。感染HCV 病 人 與 正 常 人 比 較 ， TNFα 在 血 清 中 濃 度 會 上 升 (335±10vs.77±3 pg/ml)，不論使用IFNα或與Ribavirin合併治療，治療前、治療結束 (48 週)及結束後六個月，血清中的TNFα均會持續下降。但在IFNα與RBV 合併治療中，治療失敗大於治療成功具有統計上的意義 (p<0.05) (Neuman et al., 2001)。Th2有IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12及IL-13， 能促使抗體的產生，而Th1及Th2彼此會互相拮抗 (Davis et al., 1999； Lechmann et al., 1999)。IL-6在治療前HCV病人會大於正常人，但無 法與有酒精性肝炎的病人區分 (Neuman et al., 2001)，不論在治療前 或治療後16週，治療失敗均會高於治療成功 (Panasiuk et al., 2004)， 而在治療結束 (48週)及結束後六個月，治療失敗會繼續上升，治療 成功會繼續下降 (Neuman et al., 2001)。IL-10則是在治療前，治療成 功的會高於失敗，而治療後，治療失敗的IL-10會上升，在治療16週 後觀察無法區分治療成功或失敗間的差異 (Panasiuk et al., 2004)。 IL-12在HCV的濃度會高於正常人，但是無法與酒精性肝炎區分 (Neuman et al., 2001)。. 23.
(30) 第三類的細胞激素為growth factor，包括有TGF-β1、VEGF、 bFGF、HGF、EGF、TPO及IGF-1，分別介紹如下：transforming growth factor-β1 (TGF-β1)，慢性肝炎在肝細胞中TGF-β1 mRNA表現量會大 於正常人 (Castilla et al., 1991；Roulot et al., 1995)，而TGF-β1在血清 中的表現量，患有慢性C型肝炎病人與正常人的表現並無差異 (Zhang et al., 2003)，但在2005年Fisiak等人及2006年Janczewska-kazek等人的 結果顯示患有慢性C型肝炎病人表現量高於正常人，並且在治療過程 中 會 逐 漸 下 降 ， 尤 其 是 治 療 成 功 的 病 人 (Marek et al., 2005 ； Janczewska-kazek et al., 2006)，而治療失敗的人在治療前及治療結束 後，血清中TGF-β1的表現沒有差異 (Marek et al., 2005)或者是下降 (Janczewska-kazek et al., 2006)。Vascular endothelial growth factor (VEGF)在正常人與HCV病人並無顯著差異 (Janczewska-kazek et al., 2006)，在治療後，治療成功的病人會上升 (由 112.8±10.2 pg/ml至 315.03±29.3 pg/ml，p= 0.043)，治療失敗的病人變化不具意義 (由 172.36 pg/ml至245.83 pg/ml)。Basic fibroblast growth factor (bFGF) 在 正常人與感染HCV病人 (3.3±0.39 pg/ml與4.35±0.58 pg/ml)並無顯著 差異 (Janczewska-kazek et al., 2006)，治療成功的病人會上升 (由 2.51±0.29 pg/ml至15.79±1.8 pg/ml，p= 0.04)，治療失敗的病人變化不 具意義 (由5.94 pg/ml至4.35 pg/ml)，在治療結束後，治療成功在治療. 24.
(31) 結束的值遠大於治療失敗 (p= 0.04)。Hepatocyte growth factor (HGF) 在HCV病人與正常人並無差異，而治療成功與治療失敗在治療前中後 均看不出差異性 (Anatol et al., 2005）。Epidermal growth factor (EGF) 在治療之前，HCV病人的表現量高於正常人，但治療16週後與正常人 相似，以治療結束後24週與治療前比較，治療成功的並沒有變化，而 治療失敗的則會下降，而治療成功與治療失敗在治療前中後均看不出 差異性 (Anatol et al., 2005）。Thrombopoietin (TPO)在治療前，治療 成功的與正常人蛋白濃度相似，治療失敗的高於正常人及治療成功 者，以治療結束後24週與治療前比較，治療成功的會上升，而治療失 敗的則會下降，而治療成功與治療失敗在治療結束後看不出差異性 (Anatol et al., 2005）。Platelet-derived growth factor (PDGF)，感染HCV 病人會降低血清中蛋白，而治療前，治療成功的會高於失敗的，以治 療結束後24週與治療前比較，治療成功的會下降，而治療失敗的則會 下降，而治療成功與治療失敗治療結束後看不出差異性 (Anatol et al., 2005）。大部分血清中insulin-like growth factor-1 (IGF-1)及insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3)來自於肝細胞的合成，而肝 臟的疾病會造成IGF-1及IGFBP-3蛋白的減少 (Wu et al., 2004)，相對 於正常人，患有慢性C型肝炎血清中的IGF-1及IGFBP-3蛋白的表現量 較低 (Elsammak et al., 2006)。. 25.
(32) 第四類的細胞激素為leptin、matrix metalloproteinases (MMPs)及 調控MMP的tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)。Leptin與脂肪 代謝有關，會刺激脂肪新生及所需酵素acetyl CoA carboxylase的基因 表現，在感染HCV病人的血清中，leptin的濃度會上升 (Piche et al., 2002；Liu et al., 2005)。Eguchi等人認為leptin在血清中濃度小於8 ng/ml對於HCV的治療成功的機率較高 (89.29%)，反之，治療成功的 機率僅12.5% (Eguchi et al., 2006)。MMPs具有分解膠原蛋白(collagen) 的功能，在細胞中扮演的角色為組織的重建 (tissue remodeling)。Leory 等人利用ELISA觀察血清中的MMP-1、2及9，僅有MMP-9在慢性肝 炎 會 低 於 正 常 人 ， MMP-1 及 MMP-2 無 法 區 分 慢 性 肝 炎 與 正 常 人 (Leory et al., 2004)， HCV病患血清中 MMP-1表現量低於正常人 (Fisiak et al., 2005)。TIMP能夠調控MMP功能，Benyon等人在1996年 以 in situ hybridization 的 方 式 發 現 肝 臟 星 狀 細 胞 (hepatic stellate cells；HSC)中有TIMP-1及TIMP-2的存在。2001年發現肝硬化的肝臟 中TIMP-1及TIMP-2 mRNA的表現量高於正常人 (Lichtinghagen et al., 2001)，HCV患者PBMC中的TIMP-1 mRNA表現量高於正常人 (Zhang et al., 2003)，而以ELISA方式血清中的TIMP-1及TIMP-2，具有慢性C 型肝炎血清中的TIMP-1(Zhang et al., 2003；Leory et al., 2004；Fisiak et al., 2005)及TIMP-2 (Zhang et al., 2003；Leory et al., 2004)高於正常人。. 26.
(33) 1.6 研究動機與策略 由於在病毒清除過程扮演重要角色，而有關細胞激素在 HCV 治 療過程中的機制尚不清楚，因此，我們希望可以經由兩個方面瞭解細 胞激素或細胞因子調控 HCV 感染的可能機制，首先，在臨床檢體方 面，利用蛋白質晶片的方式，大量篩選在 HCV 治療成功或治療失敗 在治療前及治療 1 個月後的細胞激素變化，用 ELISA 的方式來確認 蛋白質晶片的結果；其次，在細胞層次上，藉由二維電泳方法，以蛋 白質等電點及分子量的不同，區分在肝癌細胞 (Huh7)及帶有 HCV subgenome 之 replicon 細胞所分泌蛋白質的差異。. 27.
(34) 第二章 材料與方法 2.1 檢體收集及分離. 檢體的來源為中國醫藥大學附設醫院，患有慢性C型肝炎的病 人，參與健保長效型的干擾素 (PEG-interferon) 與Ribavirin的合併治 療計畫。在病人治療前至治療結束後六個月，以EDTA管收集病人血 液的剩餘檢體，經過1500 rpm的離心15分鐘，保存於-80℃。 2.2 血漿中細胞激素分析 2.2.1 細胞激素套組選擇. 為了篩選在HCV病人治療前後細胞激素的變化，使用Human Cytokine Array作初步篩選，Human Cytokine Array由 20 X 30 mm nitrocellulose所組成，包含有 11 X 8 個點，其中包括79個與細胞激 素相關的抗體，6個positive control抗體，3個negative control抗體，其 中有2個為牛血清白蛋白 (bovine serum albumin; BSA)，另1個點為緩 衝溶液 (sample buffer)所組成。 2.2.2 選擇病人. 在治療結束後六個月偵測血漿中的HCV病毒RNA，若病毒量小. 28.
(35) 於detection limitation為治療成功，反之則為治療失敗。我們挑選兩組 治療成功與治療失敗的病人，觀察兩者在治療前及治療ㄧ個月的細胞 激素變化。. 第一組，治療失敗的病人年紀為58歲，男性，屬於1b病毒基因型， 治療前的病毒量為1.1 x 107 copies/ml，治療3個月、6個月及結束後6 個月的病毒量分別為1270、639及9050 copies/ml；治療成功的病人年 紀 為 52 歲 ， 男 性 ， 屬 於 1b 基 因 型 ， 治 療 前 的 病 毒 量 為 6.2 x 106 copies/ml，治療結束後6個月病毒量小於1000 copies/ml。. 第二組，治療失敗的病人年紀為49歲，男性，屬於1b病毒基因型， 治療前的病毒量為7.01 x 105 copies/ml，治療3個月、6個月及結束後6 個月的病毒量分別為<86、<86及3.41 x 105 copies/ml；治療成功的病 人年紀為57歲，男性，屬於1b基因型，治療前的病毒量為6.57 x 105 copies/ml，治療結束後6個月病毒量小於86 copies/ml。 2.2.3 操作步驟 將 membrane 放 置 在 eight-well tray 中 ， 加 入 2 ml 1X blocking buffer，在室溫下培養30分鐘，血漿則利用blocking buffer稀釋5倍，在 blocking結束後加入1 ml稀釋後的血漿，在4℃環境中培養16小時，利 用2 ml washing buffer I及II在室溫下分別清洗2及3次，每次時間為5分 29.
(36) 鐘，加入biotinylated antibody，繼續在4℃中培養16小時，經過同樣的 清洗步驟，加入HRP-conjugated streptavidin，在室溫培養60分鐘，清 洗並加入detection buffer，去除多餘的detection buffer後壓片，結束後 將membrane保存在 -80℃。 2.3 酵素連結免疫吸附試驗 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 2.3.1 ELISA 試劑組選擇. 經由蛋白質晶片的結果，決定挑選以下的ELISA試劑來確認晶片 的結果，ELISA試劑組分為兩種，第一種來自R&D System，使用的 細胞激素為EGF，第二種來自RayBiotech Inc.，有4種細胞激素使用此 ELISA kit來確認，分別為ENA-78、IL-1α、RANTES、EGF。 2.3.2 操作步驟 (R&D System) Capture Antibody 以 PBS 配製成 4 μg/ml 之濃度，每個 well 中各 加入 100 μl，在室溫中放置 12 小時，甩乾後使用 400 μl wash buffer (PBS + 0.05% Tween 20)清洗三次，加入 300 μl Reagent Diluent (PBS + 1% BSA)，在室溫中 blocking 1 小時，甩乾後以 400 μl wash buffer 清 洗三次，加入 100 μl 的 standard 或是檢體，在室溫中培養 2 小時，甩 乾後以 400 μl wash buffer 清洗三次，加入 100 μl 50 ng/ml 的 detection. 30.
(37) antibody，在室溫中培養 2 小時，甩乾後以 400 μl wash buffer 清洗三 次，加入 100 μl 稀釋 200 倍的 streptavidin-HRP，在室溫中培養 20 分 鐘，甩乾後以 400 μl wash buffer 清洗三次，加入 100 μl 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)，室溫中培養 20 分鐘，加入 50 μl 2N H2SO4， 以 450 nm 測吸光值。 2.3.3 操作步驟 (RayBiotech Inc.) 利用Assay Dilunet A (RayBiotech Inc., United States)配置standard 及稀釋檢體，每個well中加入100 μl的standard或是檢體，在室溫中培 養2.5小時，以200 μl washing buffer清洗4次，甩乾後加入100 μl biotinylated antibody，在室溫中培養1小時，以200 μl washing buffer 清 洗4次，甩乾後加入100 μl HRP- streptavidin solution，室溫下培養45 分鐘，以200 μl washing buffer清洗5次，甩乾後避光操作，加入100 μl TMB One-Step Substrate Reagent，室溫下30分鐘後加入50 μl stop solution，以450 nm測吸光值。 2.4 預測模型 利用統計軟體SAS 9.1來進行分析，所有的結果均為雙尾，在p< 0.05為統計上具有意義。. 31.
(38) 將ELISA的結果分為失敗治療前、失敗治療後、成功治療前、成 功治療後、失敗治療前/治療後、成功治療前/治療後、失敗治療前－ 治療後及成功治療前/治療後。. 計算出算術平均數及四分位數，由一維散佈圖及Boxplot觀察治 療失敗與成功在0M及1M的細胞激素分佈型態，我們的樣本數因未超 過30個，因此使用無母數分析 (Wilconxon rank-sum test)來確認成功 與失敗在治療前、治療1個月、治療後與治療前的比率及差值是否具 統計上意義，以配對T檢定及Wilconxon rank-sum test比較治療成功與 治療失敗在治療前後是否具有統計上的意義。 利用logistic regression的方式能清楚的比較出每個變數影響的程 度，假設治療失敗為0，治療成功為1，變數為治療前 (0M)、治療後 (1M)、治療後/治療前 (1M/0M) 及治療後-治療前 (1M-0M)，單一變 數及多變數同時分析，並畫出diagnostic graphs，觀察曲線形狀來確認 是否為合理的預測模型。 利用ROC curve決定擁有最適合的敏感性 (sensitive) 與特異性 (specific) 之預測模型，計算出成功的機率、陽性檢出率 (positive predictive value；PPV)及陰性檢出率 (negative predictive value；NPV)。. 32.
(39) 2.5 細胞培養 2.5.1 Huh7 (Human hepatoma cell line) Huh7為來自57歲的日本男性之肝臟細胞，屬於分化良好的肝癌 細 胞 (Hidekazu et al., 1982) ， 培 養 於 添 加10% 胎 牛 血 清 (FBS) (HycloneTM)的DMEM (Hyclone)，100 Units/ml 青黴素 (Penicillin) 及 100 μg/ml 鏈黴素 (Streptomycin) (GIBCO, USA)中。 2.5.2 Replicon 由 Huh7 細胞轉殖基因型 1b 中與 HCV 複製相關的基因，包括 5’-UTR、3’UTR 及 NS3-NS5B 部分，在 NS5A 基因上有 adaptive mutation，在轉譯出的胺基酸 1179 的位置，由原本的絲胺酸置換成白 胺酸，另外，還包括可以分解 Neomycin 的 neor 基因方便用於篩選 (Blight et al., 2000) (附圖二)，培養於添加 10% FBS 的 DMEM (HycloneTM) ， 100 Units/ml Penicillin ， 100 μg/ml Streptomycin (GIBCOTM)及 800 μg/ml G418 (Geneticin®)。 在加藥實驗中，先以 3.5 cm dish 培養 5X105 Replicon 細胞，8 小 時後以 PBS 清洗細胞兩次，分別加入 DMSO 1 μl/ml 及 PEG-interferon 20 ng/ml，培養 48 小時後收細胞 RNA。. 33.
(40) 2.5.3 Con1 細胞 Replicon 細胞能夠在細胞中複製，卻無法產生病毒顆粒，Con1 細胞由德國慢性肝炎病人所分離出來，屬於 1b 基因型，增加 3 個 adaptive mutation 來提高複製的效率，分別為 E1202G、T1280T 及 K1846T (Pietschmann et al., 2002)。 Con1 細胞就是利用 Huh7 細胞轉殖一段 Full-length Con1 DNA， 培養於添加 10% FBS 的 DMEM，100 Units/ml Penicillin，100 μg/ml Streptomycin、800 μg/ml G418 及 100 μM NEAA (GIBCOTM)。 2.5.4 Huh7.5 Replicon 細胞 (NS5A 不具 adaptive mutation) 經由 IFN-α 治療， 利用 RT-PCR 的方式確認細胞中沒有 HCV RNA 存在，形成 highly permissive cell line (Blight et al., 2002)。Huh7.5 培養於添加 10% FBS 的 DMEM，100 Units/ml Penicillin，100 μg/ml Streptomycin 及 100 μM NEAA。 2.6 核酸萃取 (RNA extraction) 以 PBS 清洗細胞兩次，加入 0.5 ml REzolTMC&T，靜置 5 分鐘後 移至 1.5 ml eppendorf，加入 0.1 ml chloroform，vortex 數次至均質狀， 34.
(41) 以 13000 rpm 離心 15 分鐘，取上清液，加入等體積的 isopropanol， 放置在-80℃ (30 分鐘以上)，以 13000 rpm 離心 15 分鐘，以 1 ml 70% ethanol 清洗 RNA 兩次，去除 ethanol，以 20 μl ddH2O 溶解 RNA。 2.7 反轉錄即時聚合酶連鎖反應 (Reverse-transcription Real-time Polymerase Chain Reaction) RT-Real-time-PCR 之混合物包含有 100 ng RNA，10 μl power SYBR Green Master Mix (ABI)，125 nM Forward primer，125 nM Reverse primer，0.625 unit/μl Reverse Transcriptase (ABI)，0.00125 unit/μl RNase Inhibitor (ABI)，補 ddH2O 至 20 μl，以 ABI PRISM 7000 進行反應，反應條件分為 3 個 stages，stage 1 進行 reverse transciption， stage 2 及 3 進行 PCR，stage 1：48℃，30 min；stage 2：95℃，10 min； stage 3：95℃，15 sec，60℃，1 min (40 cycles)。本實驗使用的引子 序列如下：ENA-78-F (5’-TTACAGACCACGCAG-3’)，ENA-78-R (5’GCTTCTGGATCAAGACA-3’)，HCV-F (5’-TGCGGAACCGGTGAGT ACA-3’) ， HCV-R (5’-CTTAAGGTTTAGGATTCGTGCTCAT-3’) ， β-actin-F (5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’)，β-actin-R (5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATG-3’) 2.8 二維電泳 (2-Dimensional Gel Electrophoresis). 35.
(42) 在 10 cm 培養皿中，培養 1 x 106 的 Huh7 或 Replicon，經過 24 小時，以 2 次 5 ml PBS 清洗後，加入含有 0.2% FBS、100 Units/ ml Penicillin 及 100 μg/ml Streptomycin 之 DMEM，在 37℃及 5% CO2 培 養 72 小時，收集 supernatant，離心 3000 rpm，15 min，取上清液， 以 5 kD 蛋白質濃縮管濃縮蛋白，濃縮好的蛋白等比例加入 rehydration buffer (8 M urea、2% CHAPS、1% DTT 及 0.5% Bio-lytes)，打超音波 兩次，每次 5 min，中間間隔 5 min，放置在 4℃ 6 小時，測蛋白濃度， 取 300 μg 的蛋白補 rehydration buffer 至 300 μl，加入 5 μl bromophenol blue。 將 sample 加入電極板中，加入撕開的 strip (pH 4-7)，避免氣泡的 產生，靜置 1 小時，加入 2 ml mineral oil，上機 50 V rehydration 12 小時，在兩端電極放入電極墊 (wick)，設定 run program (S1- 250 V， 15 分鐘；S2- 10000 V linear，3 小時；S3- 10000 V，60000 VHrs；S4500 V，12 小時)。 取出 strip 並利用 3M paper 除去 mineral oil，經過 equilibration buffer 平衡膠條後以 12% SDS-PAGE 跑膠 15 mA/Gel 2 小時，20 mA/Gel 8 小時。 2.9 硝酸銀染色 (Silver stain) 36.
(43) 跑膠結束後，利用 solution A (50% methanol and 25% acetic acid) 固定至少兩個小時，接著，加入 solution B (30% methanol)，搖晃 15 分鐘，以二次水清洗三次，每次 5 分鐘，加入 solution C (0.8 mM Na2S2O3‧5H2O)，搖晃 2 分鐘，以二次水清洗三次，每次 30 秒，加入 含銷酸銀的 solution D (0.2% AgNO3)，搖晃 25 分鐘，以二次水清洗 兩 次 ， 每 次 30 秒 ， 加 入 solution E (0.28 M Na2CO3, 0.0185% formaldehyde and 0.016 mM Na2S2O3‧5H2O)使膠呈色，快速的用二次 水清洗後，加入 solution F (0.042 M Na2EDTA‧2H2O)停止反應的進行 約 10 分鐘，最後以二次水取代 solution F 保存膠，將結果掃描成 TIF 檔案格式，並使用 ImageMasterTM 2D Platinum Software (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)進行分析。. 37.
(44) 第三章 結果 3.1 利用蛋白質晶片分析病人治療前後一個月細胞激素的變化. 在兩次蛋白質晶片的實驗中，我們分別分成兩個部分來討論，第 一部份比較治療成功與治療失敗在治療前細胞激素表現量，第二部份 比較治療成功與治療失敗在治療前與治療後 1 個月的變化： 本研究使用的蛋白質晶片具有 79 種細胞激素，在第一組的結果 中，治療前，治療成功有 13 個細胞激素的表現量高於治療失敗，分 別為 ENA-78、IL-1α、MIP-1、RANTES、EGF、IGF-1、Angiogenin、 Oncostain M、VEGF、Leptin、IGFBP-1、IGFBP-2 及 TGF- 2；而治 療成功有 4 個細胞激素的表現量低於治療失敗，有 GRO、BDNF、 IGFBP-3 及 TGF- 3。治療後 1 個月細胞激素與治療前比較，在治療 1 個月後，有 3 個細胞激素在治療成功會下降，且治療失敗不變或上升 的有 IL-1α、RANTES 及 Oncostain M；治療 1 個月後，治療成功不變， 且治療失敗會下降的有 Angiogenin、BDNF、IGFBP-1、IGFBP-2、 NAP-2 及 TIMP-2 (圖 1)。 在第二組蛋白質晶片的結果中，治療前，治療成功有 10 個細胞 激素的表現量高於治療失敗，分別有 ENA-78、GRO、IL-8、RANTES、 EGF、Angiogenin、PDGF-BB、IGFBP-1、IGFBP-2 及 NT-4；而治療 38.
(45) 成功有 2 個細胞激素 GROα 及 IL-1α 的表現量低於治療失敗。而在治 療後 1 個月，治療成功下降，且治療失敗不變或上升的有 MIP-1δ、 RANTES、EGF、BDNF、NT-4、Osteoprotegerin 及 TIMP-1；治療成 功不變，且治療失敗上升的有 IGFBP-2 及 TIMP-2。. 比對兩組蛋白質晶片結果後得到：在治療之前，治療成功細胞激 素表現量高於失敗的有 ENA-78、RANTES、EGF、Angiogenin、 IGFBP-1 及 IGFBP-2；而治療成功細胞激素表現量低於失敗僅有 GRO。治療後 1 個月比上治療前，RANTES 是唯一在兩組結果相同， 均為治療成功下降，而失敗不變 (圖 2)。 3.2 測試酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)之穩定性. 在分析蛋白質晶片的結果後，接下來，我們需要利用酵素連結免 疫吸附試驗的方式來確認蛋白質晶片的結果，為了確定酵素連結免疫 吸附試驗的方式實驗的穩定性及再線性，在不同的時間點操作 EGF ELISA，先將 EGF standard 配製成 125 pg/ml，再以序列稀釋分別配 置出 62.5、31.25、15.63、7.81 及 3.91 pg/ml，以 ELISA 方式操作 15 次，計算其平均值、標準差及變異係數，在這 15 次實驗中，每次操 作均為二重複，二重複的變異係數小於 10%，而實驗與實驗間的變異 係數也在 10%以下 (圖 3)。 39.
(46) 3.3 以酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)確認細胞激素在 HCV 治療的 變化 在蛋白質晶片的結果中，在治療後比治療前，治療成功 RANTES 的表現量會下降，且治療失敗沒有變化。利用 ELISA 來確認一組病 人的蛋白質晶片結果，顯示 ELISA 的結果與蛋白質晶片吻合；但加 入更多病人後，經由配對 T-test 統計分析，RANTES 在治療成功與治 療失敗治療後的表現量不變 (p>0.1) (圖 3)。 EGF 在蛋白質晶片得到的結果為治療前，治療成功的表現量高於 失敗，治療後比上治療前，治療成功下降，治療失敗不變。兩組病人 經 ELISA 確認後，結果與蛋白質晶片吻合；加入更多病人後，在治 療前，在 Wilcoxon 的統計結果中，治療成功與治療失敗沒有統計上 意義 (p=0.3219)，而比較治療後 1 個月與治療前，治療失敗與成功的 EGF 表現量下降，在配對 T-test (p=0.008 及 0.004)有統計上的意義 (圖 4)。 ENA-78 在蛋白質晶片的結果為，治療前，治療成功的表現量高 於失敗，而治療成功與失敗在治療後表現量均會下降。在兩組病人的 ELISA 與蛋白質晶片得到一致的結果；加入更多病人得到，治療前， 在 Wilcoxon 的統計結果中，治療成功與治療失敗沒有統計上意義 40.
(47) (p=0.4825)，而治療後，經由配對 T-test 得到治療成功與失敗的表現 量下降具有統計上意義(p=0.008 及 p=0.004)，將病人的治療後 1 個月 及治療前的 ENA-78 相除，得到治療成功下降的比率會小於治療失 敗，兩者下降的比率經由 Wilcoxon test 統計的結果具統計上意義 (p=0.014) (圖 5)。 IL-1α 在蛋白質晶片中，治療前，治療成功的表現量小於失敗， 治療後比治療前，治療成功下降，失敗不變。在 ELISA 的結果顯示， 第一組病人結果與蛋白質晶片一致，但第二組病人治療失敗可能因為 IL-1α 蛋白的表現量低，所以在治療後沒有明顯變化，但 IL-1α 可能 是調控 ENA-78 的上游分子，並且在文獻中顯示 HCV 會刺激肝小葉 產生 IL-1α (Kasprzak et al., 2004)，因此，希望經由加入更多的病人， 來確認 IL-1α 在治療成功與失敗間的差異，治療成功會上升利用 Wilcoxon 統計在治療前不具統計意義(p=0.389)，治療失敗在治療後 下降，配對 T-test 具有意義(p=0.064) (圖 6)。 3.4 使用 SAS 統計軟體建立 ENA-78 及 ENA-78 合併 EGF 與 IL-1α 預測治療結果模型. 線性迴歸通常是在解釋兩組連續變數的關係，經由解釋變數的值 來預測或估計反應變數的值，而我們的反應變數為二元分類，治療成 41.
(48) 功與治療失敗，在希望利用解釋變數的值來預測或估計二元反應變數 的值，我們使用了羅吉斯迴歸 (logistic regression)的方式。將單一的 解釋變數，例如治療前的數值、治療後 1 個月數值、治療前後相除或 相減，或合併兩種及三種解釋變數帶入羅吉斯迴歸中，選擇較有統計 意義的迴歸方程式，計算出所有病人的成功機率，利用成功的機率與 治療成功及失敗繪出 ROC curve，選擇最靠近 ROC curve 的左上角， 即擁有最佳的敏感性及特異性作為 cut-off value。 我們使用單一種細胞激素來建立模型時，唯一看到 p<0.1 的只有 ENA-78，所預測出的模式為： ln (p/(1-P)) = 1.5291 + 0.00042* ENA-78 (1M) – 2.9611* ENA-78 (1M/0M). P=0.0724 由 ROC curve (圖 7)得到曲線下積分面積為 0.796，cut-off value 為 0.63，敏感性是治療成功被我們預測為治療成功的比率為 61%，特 異性是治療失敗中被我們預測為治療失敗的比率為 92.9%，陽性預測 率為成功機率高於 cut-off value 且為治療成功的比率為 91.6%，陰性 預測率為成功機率低於 cut-off value 且為治療失敗的比率為 65%。 而將 ENA-78、IL-1α 及 EGF 同時丟進預測模型，得到的模型為：. 42.
(49) ln (p/(1-P)) = 3.2432 + 0.00104* ENA-78 (1M) + 7.8938* ENA-78 (1M/0M) – 0.00081* EGF (0M) –0.5919* IL-1α (1M/0M). p=0.0089 由 ROC curve (圖 8)得到曲線下積分面積為 0.875，cut-off value 為 0.6，敏感性有 87.5%，特異性是 83.3%，陽性預測率為 87.5%，陰 性預測率為 83.3%。 3.5 經由所建立的 ENA-78 預測模型進行 Blind test 以 ELISA 偵測 22 個未知治療結果病人的治療前及治療後 1 個月 的血漿中 ENA-78 蛋白表現量，將結果帶入 ENA-78 的預測模型中， 計算出成功的機率後，以成功機率 0.63 為 cut-off value，成功機率小 於 0.63 判定為失敗，成功機率大於 0.63 判定為成功，經過比對後， PPV 為 50%，而 NPV 為 37.5% (圖 9)。 3.6 以定量聚合酶連鎖反應分析 ENA-78 在肝癌相關細胞中 mRNA 的表現 治療慢性 C 型肝炎後 1 個月，血漿中 ENA-78 的蛋白量會下降， 但不清楚在 HCV 的感染下，細胞中 ENA-78 的表現是否也有所改變。 因此我們抽取下列細胞的 RNA，包括 Huh7，含有 HCV 全長及複製 區域之 Con1 及 Replicon 細胞，以及用干擾素處理至無法偵測出 HCV 43.
(50) RNA 的 Huh7.5 等，藉由反轉錄即時聚合酶連鎖反應的方式，觀察 HCV 及 ENA-78 的 RNA 表現量 (圖 10)。 在未處理的 Replicon 與 Con1 細胞中，ENA-78 mRNA 的表現量 高於不具有 HCV 基因的 Huh7 細胞，而 Con1 及 Replicon 細胞經干擾 素處理後，HCV RNA 會下降。另外 Con1 的 ENA-78 mRNA 會上升， 而 Replicon 在 HCV 有下降的情形，ENA-78 mRNA 沒有變化。 3.7 以定量聚合酶連鎖反應分析 ENA-78 在中周邊單核球細胞 mRNA 的表現 經過治療慢性肝炎病人，血漿中的 ENA-78 表現量降低，而我們 利用干擾素處理 Con1 及 Replicon 細胞，卻會得到 ENA-78 mRNA 的 表現量上升。目前，血液中有明確的證據顯示，血液周邊單核球細胞 (peripheral blood mononuclear cell；PBMC)被 HCV 所感染 (Pham et al., 2004)，因此，我們挑選治療成功的病人，抽取在治療前、治療後 1 個月及治療後 6 個月的 PBMC，觀察 ENA-78 mRNA 的表現。除了 33 號病人在治療前後均無改變外，ENA-78 mRNA 在其他病人 PBMC 中的表現為治療後 1 個月會上升，而治療後 6 個月會下降 (圖 10)。. 44.
(51) 3.8 利用蛋白質二維電泳方法觀察肝癌相關細胞之分泌性蛋白質 經由蛋白質晶片及 ELISA 分析細胞激素在臨床上及肝癌相關細 胞中的表現後，本研究想要探討在 HCV 感染細胞之後，是否會促使 細胞分泌蛋白，來影響細胞本身或鄰近的細胞產生細胞激素，吸引像 是嗜中性球或淋巴球等免疫細胞進行病毒的清除，所以將利用蛋白質 二維電泳的方式分析細胞所分泌的蛋白質。 首先，將細胞 Huh7 及 Replicon 培養於含 0.2% FBS 的 DMEM， 72 小時後，利用蛋白質濃縮管收集上清液，以 pH 4-7 進行一維電泳， 再依蛋白質分子量以二維電泳分離，最後以銀染呈現蛋白點。 比對 Huh7 與 Replicon 細胞的蛋白質表現，挑選僅由 Replicon 細胞所分泌而 Huh7 細胞沒有分泌的 5 個候選蛋白質，以 Image MasterTM 2D Platinum, Verision 6.0 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 分析這 5 個候選蛋白質的 pI 值，且確認不是 HCV 的病毒結構或非結 構蛋白質後，將樣本送至長庚大學余兆松老師實驗室以質譜儀分析， 並使用英國 Matrix Science 公司所研發的 Mascot 蛋白質資料庫搜尋系 統來鑑定比對蛋白質，比對的分數 (score)至少要超過 60 分，其中有 三個蛋白，分別為 myosin (heavy chain 3)、ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 及 transthyretin (homodimet of chain A) (圖 11)。. 45.
(52) 第四章 討論 病毒的感染會刺激具備許多功能的細胞激素產生，首先，這些細 胞激素能引起免疫反應，在第一時間吸引白血球進入組織中，清除已 被感染的細胞。再者，利用訊息傳遞的方式刺激干擾素及相關基因的 產生，不但能防止病毒的複製及分解病毒的基因，也能促使鄰近細胞 不容易被感染。最後，這些細胞激素能促進細胞的再生，進行破壞組 織的修復。 過去的文獻大多研究在HCV治療前及治療12週後細胞激素的變 化 (Kraus et al., 2002；Castro et al., 2002)。然而，病人在長效型干擾 素及Ribavirin的治療下，會產生疲倦、噁心、嘔吐、骨髓抑制、憂鬱 症及貧血等副作用 (National Institutes of Health, 2003)。由於希望能提 前得知可能治療成功的機會，進而縮短病人感受副作用的時間，因 此，在我們的研究中，將時間點設定在治療前與治療後1個月，而非 目前用來評估治療成效的時間點---在治療後3個月。 對於細胞激素與HCV間的關係，經常被探討是在感染HCV後與 正常人間的比較(Piche et al., 2002；Mihm et al., 2003；Zhang et al., 2003；Liu et al., 2005；Elsammak et al., 2006)，或是討論某一類的細 胞 激 素 在 治 療 成 功 與 治 療 失 敗 間 的 變 化 (Anatol et al., 2005 ； Janczewska-kazek et al., 2006)。因此，我們希望藉由蛋白質晶片的技. 46.
(53) 術，完整地看到在治療前與治療後1個月所有細胞激素的改變。於是， 我們使用蛋白質晶片的技術並考慮不同個體間的差異分析兩組病人 的結果，並進一步使用ELISA的技術來確認蛋白質晶片的結果。 蛋白質晶片是先將79種蛋白質的抗體固定在membrane上，與檢 體作用一段時間後，加入有結合biotin的79種蛋白質抗體，之後，加 入與biotin具有高親合性的streptavidin-HRP。最後再加入呈色劑並利 用X光底片感光。使用蛋白質晶片具有以下的優點，第一，蛋白質晶 片屬於high-throughput的工具，能夠檢測多種細胞激素的變化，能看 到較整體而非片段的概念。第二，所需的檢體量少。第三，減少垃圾 量。然而，由於個體間具有生物性差異，因此需要以大量病人的結果 當做最後的結論。. 在蛋白質晶片的結果，我們分成三個部份來介紹，第一，蛋白質 晶片無法偵測到慢性C型肝炎病人血清中應該具有的細胞激素；第 二，細胞激素在蛋白質晶片中的結果與過去文獻的結果類似；第三， 細胞激素在蛋白質晶片與過去文獻有差異的結果。 47.
(54) 在第一部份，我們為了減少背景值，利用稀釋5倍血漿來進行蛋 白質晶片的實驗，因此，蛋白質晶片因敏感性不足而無法偵測到在慢 性肝炎中會出現的6種細胞激素，包括MIP-3α、IL-6、IL-10、TGF-β1、 TPO及HGF。MIP-3α在慢性肝炎血清中濃度39±28.9 pg/ml (Yamauchi et al., 2002)，而蛋白質晶片能偵測的最小濃度為100 pg/ml。IL-6在治 療前，治療成功與失敗病人在慢性肝炎血清中濃度分別為0.16±0.37 及0.65±0.61 pg/ml (Pansiuk et al., 2004)，而蛋白質晶片能偵測的最小 濃度為1 pg/ml。IL-10，在治療前，治療成功與失敗病人在慢性肝炎 血清中濃度分別為0.88±0.78及0.45±0.46 pg/ml (Pansiuk et al., 2004)， 而蛋白質晶片能偵測的最小濃度為10 pg/ml；TGF-β1，在治療前，治 療成功與失敗病人在慢性肝炎血清中濃度分別為36.7±1.6及34.6±1.4 pg/ml (Marek et al., 2004)，而蛋白質晶片能偵測的最小濃度為200 pg/ml。TPO，在治療前，治療成功與失敗病人在慢性肝炎血清中濃 度分別為48.4±14及64.2±17.1 pg/ml (Anatol et al., 2004)，而蛋白質晶 片能偵測的最小濃度為100 pg/ml。HGF，在治療前，治療成功與失敗 病人在慢性肝炎血清中濃度分別為873±210及919±257 pg/ml (Anatol et al., 2004)，蛋白質晶片能偵測的最小濃度為200 pg/ml，因此在血漿 稀釋5倍後無法在蛋白質晶片中呈現。 第二部分，蛋白質晶片中的細胞激素與之前文獻類似的有. 48.
(55) TIMP-1及PDGF-BB。之前的研究顯示TIMP-1 (Fisiak et al., 2005)及 PDGF-BB (Anatol et al., 2005)，分別在治療48週及16週之後會下降， 而我們的結果，無論是治療成功或失敗的病人，在治療1個月後血漿 中的TIMP-1及PDGF-BB均會下降。 第三部份，細胞激素的結果與過去有差異的有MCP-1、IP-10、 EGF及VEGF。過去，MCP-1在血清的蛋白表現量，治療成功與失敗 在治療前並沒有差異；經過16星期治療後，MCP-1的蛋白表現量在治 療成功不會改變，而治療失敗會上升 (Panasiuk et al., 2004)。而在蛋 白質晶片中，在治療前，治療成功與失敗血清中MCP-1的蛋白表現量 並沒有差異；而治療4星期後，在治療成功會上升，治療失敗會下降。 血漿中IP-10蛋白表現量，過去在治療前或治療結束及治療結束六個 月後均可得到治療失敗會大於治療成功 (Apolinario et al., 2004； Diago et al., 2006)；治療結束，治療成功與失敗的IP-10均會下降。在 晶片的結果中，治療前，第一組病人沒有變化的，第二組病人在治療 成功表現量大於治療失敗；治療後，第一組病人，血漿中IP-10蛋白 表現量，在治療前及治療後均會下降，第二組在治療失敗會上升，治 療成功會下降。血漿中EGF的表現量，在治療前後，治療成功與治療 失敗沒有差異；而治療16星期後，治療成功沒有變化，治療失敗會下 降 (Anatol et al., 2005)，我們在兩組蛋白質晶片均可看到在治療前，. 49.
(56) 治療成功大於治療失敗；治療後1個月，第一組治療成功與失敗在血 漿中EGF的表現量均下降，第二組在治療失敗上升，治療成功下降。 血漿中的VEGF蛋白在治療前沒有差異；治療成功會在治療後48週上 升 (Janczewska-kazek et al., 2006)。蛋白質晶片在兩組的結果並不相 同，第一組在治療前，治療成功大於治療失敗；治療後，治療失敗不 變，治療成功下降。第一組在治療前，治療成功與治療失敗沒有差異； 治療後，治療失敗上升，治療成功不變。 酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA)是將要測定的蛋白質固定在96 孔盤，在檢體作用後，加入含有biotin的抗體，然後加入streptavidinHRP之後，利用TMB呈色，以硫酸來中止反應，使用450 nm偵測其吸 光值。ELISA最大的優點在於價格比較便宜，操作方式簡單且花費的 時間較短，可以因試劑的不同來調整檢體的稀釋倍率，最後是藉由吸 光值的變化來分析，分析的方式較蛋白質晶片來的容易。因此，這樣 的方式對於臨床上的檢驗占有較大的優勢。. 我們以ELISA來確認蛋白質晶片的結果顯示，在蛋白質晶片中， 50.
(57) EGF及ENA-78為治療成功在治療前大於治療失敗，RANTES與IL-1α 在治療後均為治療失敗不變，成功會下降。用ELISA來確認晶片的兩 組病人，在EGF、ENA-78及RANTES都可得到相同的結果，在IL-1α 的第一組病人也有相同結果，但第二組病人則是在治療失敗沒有改 變，而治療成功會上升。推論有可能是因為治療成功的病人血漿中的 IL-1α蛋白量較少，而出現的誤差。由這樣的結果可以顯示，在ELISA 與蛋白質晶片能得到類似的結果。在確認ELISA與晶片的結果吻合之 後，我們以相同的方式進行更多病人的篩選後發現，RANTES由原本 的治療後失敗不變、成功下降的結果，變成在治療成功與治療失敗的 治療前後均無統計上意義。而EGF在治療前治療成功大於失敗也變得 沒有意義，即治療失敗與成功在治療後都會下降。ENA-78也喪失在 治療前治療成功大於失敗的結果；而多一項在治療後的結論，治療成 功下降比率會大於治療失敗。在IL-1α，由原先在治療後，治療失敗 不變，治療成功下降，最後為治療失敗在治療後下降。每個病人都有 生物性上的變異 (biological variation)，無法單純從少數的病人來決定 我們的結果是否正確，但蛋白質晶片較昂貴，所以我們使用能得到相 同結果的ELISA，並加入較多的病人來排除生物性上的變異。 在預測研究的部份，若以單種細胞激素來做預測，則 ENA-78 是 唯一能得到 p value 小於 0.1 的細胞激素。這樣的預測模式有 61%的. 51.
(58) 敏感性，92.9%的特異性，91.6%的陽性預測率及 65%的陰性預測率， 若是合併 ENA-78、EGF 及 IL-1α 這 3 種細胞激素來預測，有 87.5% 的敏感性，83.3%的特異性，87.5%的陽性預測率及 83.3%的陰性預測 率，這樣的結果顯示，如果能同時加入多種因子來進行預測，可得到 較高的敏感性及預測正確性。利用單一的 ENA-78 進行預測未知治療 結果的 22 位病人，僅得到 50%的陽性預測率及 37.5%的陰性預測率， 會有如此的差異有以下的原因。第一，我們預測的模型，雖然 p value 為 0.0724，但未達到統計上顯著意義。第二，用來預測的人數較少， 我們的人數為 32 人，雖然我們的敏感性有 61%，但根據貝氏定理 (Joseph et al., 1995)來計算 95%信賴區，發現敏感性的範圍是在 43.8-78.2%。在未來，如果要進行相同模式的預測，也許我們可以加 入更多的病人或提供多種細胞激素及病毒因子來進行預測，以提高我 們預測的正確性。 ENA-78屬於CXC家族的驅化激素，在1991年，Walz等人由人類 肺泡上皮細胞 (A549)加入IL-1或TNF-α刺激的培養液中分離。cDNA 會轉譯出114個胺基酸，包含一段訊息胺基酸列 (signal peptide)及分 泌型蛋白。ENA-78的基因存在第4條染色體長臂上 (4q13-q21) (Chang et al., 1994; Corbett et al., 1994)，在體外試驗證明具有吸引及活化嗜中 性球的功能 (Schall et al., 1994)，在人類的血小板中也會表現ENA-78. 52.
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