細胞週期之生命機制

細胞要維持正常大小與數目，保持保持增值與凋亡間的動態平衡，需 要有精確的細胞週期(cell cycle)的調控，細胞週期可分為 G0 / G1、S、G2 / M 等時期，當細胞週期失去調控時則有可能發展成為腫瘤細胞。

圖四、細胞週期 ⁵²

對於抑制腫瘤細胞的生長，可經由細胞週期的停頓、誘導細胞進行凋亡 (apoptosis) 或 細 胞 分 化 (differentiation) 而 達 到 抑 制 其 增 殖 (proliferation)作用，這也是目前用來篩選有效抗癌藥物的重要

指標。本論文即針對三種血癌細胞株 HL60 (acute promyelocytic leukemia)、U937（human histiocytic lymphoma）及 K562（chronic myeloid leukemia）以所合成之 carbazole 衍生物處理後，觀察 其細胞形狀、細胞週期的變化及增殖之影響等情形。

第七節 研究動機與目的

本研究室於 1995 年合成了 1-benzyl-3-(5-hydroxymethyl-2-furfuryl) indazole (YC-1) ⁵³，並發現其抗血小板之作用機轉特異 ^54-55，係 soluble guanyl cyclase (sGC) 新型的活化劑，同時具有抗炎及抗癌活性，其類緣 化合物A、B 也具有類似的生理活性。

本研究是選擇結構與YC-1、A、B 相近的 9-benzylcarbazole-3- carbinol (C)，作為先導化合物 (lead compound)，從事結構修飾合成一系列

carbazole 衍生物，並探討其抗血小板、抗炎、抗過敏及抗癌活性等各種 生物活性，期望能獲得新型生物活性物質。

N

CH₂OH N

N

O CH₂OH

CH2

N N

N N

CH₂

CH₂ CH₂

CH₂OH

CH₂OH

YC-1 A

B C

第二章 結果與討論

第一節 化合物之合成

標的化合物 2a-d,3a-d,4a-d 及 5-10 之合成如 Scheme 11 所示，首先將 起始原料1，與各種有不同取代基之 benzyl chloride 進行 benzylation，即 可得到相對應之 substituted benzylcarbazole 2a-d。化合物 2a-d 繼續以 POCl3 / DMF 進行 Vilsmeler-Haack reaction，即可得到相對應之 aldehydes 3a-d，這些 aldehydes 以 NaBH4進行 reduction，即可得到相對應之 carbinols 化合物4a-d。

另一方面2a 在 Ac2O (acetic anhydride)中，以 AlCl3催化, 即可得到化 合物 5（m.p：341-342 ℃）及 6（m.p：132-134 ℃）兩個產物，從兩者 之 MS 及元素分析的結果，得知產物 5 之分子式為 C23H11NO2 可能是 diacetyl compound，而產物 6 之分子式為 C21H17NO 可能是 monoacetyl compound ， 進 而 由 NMR spectra 證 明 前 者 為 3,6-diacetyl-9- benzylcarbazole，而後者為 6-acetyl-9-benzylcarbazole，其產率分別為 45 % 及 38 %。

化合物 3a 與 hydroxylamine 進行 Schiff-base condensation 即可形成 oxime 7，另外 3a 若進行 oxidation 即可變成 carboxylic acid 8，繼續進行

esterification 即可形成 ester 10。另外，4a 在 DMF (N,N'-dimethylformamide) 中 先 以 NaH 處 理 後 ， 再 用 iodomethane 進 行 methylation 即 可 得 到 methoxymethyl derivative 9。

Ar-CH₂Cl

9-Alkylcarbazole 之合成如 Scheme 12 所示，以 1 為起始物，進行烷 化反應即可得到相對應之 alkylcarbazoles 11-15。化合物 11 繼續以 POCl3 / DMF 進行 Vilsmeler-Haack reaction，即可得到相對應之 aldehyde 16，化 合物16 與 hydroxylamine 進行 Schiff-base condensation 即可形成 oxime 17。

RX

如 Scheme 13 所示，化合物 16 與 malonic acid，在 piperidine 存在下，

進行縮合反應，即可得到化合物18。將 16 與 semicarbazide 作用則得到化 合物19。

C

COOH H COOH

H

piperidine CH₃COOH

16

+

18

16

19

+

H

₂

NNHCONH

2

HCl

^NaOAc

EtOH

N CH₃

CH=CHCOOH

N CH₃

CHN=NCONH2

Scheme 13

如 Scheme 14 所示，化合物 3a 與 malonic acid, 在 piperidine 存在下，

進行縮合反應，即可得到化合物20，同樣條件下與 diethyl malonate 或 ethyl cyanoacetate 反應，則得到相對應化合物 21 和 22。在 NaOH 存在下，將 3a 與 acetone 反應，則得到化合物 23；最後，將化合物 20 之酸基繼續酯 化則得到化合物24。

CH₃COOH

第二節 抑制血小板凝集之活性

上述所合成的 carbazole 衍生物 (2a-d、3a-d、4a-d 及 5-9 )之抗血小

板活性如表一，化合物11-17 之抗血小板活性如表二所示，其中先導化合

物 4a 對 AA、collagen 及 PAF 引發之血小板凝集，具有明顯的抑制活 性，對 AA 引發之血小板凝集之抑制活性與 YC-1 相當。若將 4a 之 benzyl group 以

o-chlorobenzyl group 取代形成 4b 時其活性增強，特別是對 AA

及 collagen 引發之血小板凝集之抑制活性，有大幅增強的現象，IC50分別 為 12.5 及 59.9μΜ，前者相當於 YC-1 之 4.5 倍，而後者與 YC-1 相當。

進而將4a 之 9-benzyl group 以 m-chlorobenzyl group 取代形成 4c 時，其對 AA 引發之血小板凝集略遜於 4a，不過對 collagen 及 PAF 引發之血小板 凝集者則比4a 強。另外將 4a 之 benzyl group 用 p-chlorbenzyl group 取代 形成4d 時，則 collagen 引發血小板凝集之抑制活性增強。

另一方面將4a 之-CH2OH 以-CHO 取代形成 3a 時，對 AA-及 collagen-引發之血小板凝集維持顯著之抑制活性，而對 thrombin 及 PAF 引發之血 小板凝集則呈現 IC50大於 300μΜ之低活性現象。繼續將 3a 之 benzyl group 以

o-chlorobenzyl group 取代形成 3b 時，則對 AA 引發之血小板凝

集增強。當 3a 之 benzyl group 以 m-chlorobenzyl group 形成 3c 時及

p-chlorobenzyl group 取代形成 4d 時，結果都呈現活性下降的現象。

當4a 之-CH2OH 分別以 COCH3 (6)、COOH (8)或 CH2OCH3 (9)取代 時,則活性都明顯的下降，然而 3a 之第 3 位有 CH=NOH (7)時，則對 AA、

collagen 及 PAF 引發之血小板凝集之血小板凝集均有增強抑制的現象。

有一比較特殊的現象就是當 9-benzylcarbazole 之 3、6 位都有 acetyl group 取代時 (5)在 50μg/ml 濃度下，就會引起血小板的凝集。最後著者 檢視 3、6 位均無取代基之化合物 2a-d，則發現這些化合物都沒有明顯的 抗血小板活性。總而言之，這一類 9-benzylcarbazole 化合物之 3 位 CHO 及 CH2OH 是展現活性的重要因素。

第 9 位用烷基取代時，化合物 11-15 對 AA、collagen 及 PAF 引發之 血小板凝集幾乎不具有明顯的抑制活性，甚至會引起血小板凝集。但若在 3 位上有取代時，如 9-methylcarbazole 第 3 位以-CHO 取代形成化合物 16 時，對 AA、collagen 及 PAF 引發血小板凝集有增強抑制效果。繼續將 16 之-CHO group 以 CH=NOH 取代形成化合物 17 時，則對 AA 引發之血小 板凝集抑制作用有增強的作用，對 collagen 引起之血小板凝集也有抑制作 用，其它化合物之抗血小板活性尚在評估中。

表一

.

化合物 2a-d、3a-d、4a-d 及 5-9 對血小板凝集之抑制活性

Compdconc

μg/ml R R' R'' Thrombin AA Collagen PAF

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

YC-1 IC50 173.0 μM 54.3 μM 53.8 μM 87.3 μM

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

2a 100 C6H5 H H 71.6±2.4(3)^c 57.2±2.4(3)^c 6.1±5.0(3)^c 67.7±1.0(3)^c

50 80.1±1.1(3)^c 7.7±3.5(3)^c

20 87.2±1.0(3)^c 81.5±4.3(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

2b 100 o-Cl-C6H₄ H H 72.2±1.9(3)^c 61.3±2.5(3)^c 59.7±4.3(3)^c 79.3±0.8(3)^c

50 84.9±1.7(3)^c 74.6±1.5(3) ^c

20 85.1±1.8(3)^c 85.6±1.0(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

2c 100 m-Cl-C6H₄ H H 70.6±1.7(3) 53.1±2.9(3)^c 59.4±2.0(3)^c 69.9±2.1(3)^c

50 79.4±1.0(3)^c 80.6±3.1(3)^c

20 83.3±2.2(3)^c 87.9±0.8(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

2d 100 p-Cl-C6H₄ H H 80.4±1.1(3)^c 63.1±3.4(3)^c 51.4±0.6(3) ^c 74.6±3.3(3)^c

50 81.1±0.4(3)^c 75.0±1.4(3)

20 84.0±2.4(3)^c 84.8±1.4(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

3a 100 C₆H₅ CHO H 53.8±5.4(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c 43.5±5.6(3)^c

續表一

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

3b 100 o-Cl-C6H4 CHO H 60.4±2.8(3)^c 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(4)^c 60.4±6.7(4)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

3c 100 m-Cl-C6H₄ CHO H 70.1±1.4(3)^c 64.6±3.2(3)^c 63.8±1.1(3) ^c * 69.0±1.0(3)^c

50 77.0±1.9(3) ^c 81.6±1.0(3) ^c

20 83.5±0.8(3)^c 86.5±1.4(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

3d 100 p-Cl-C6H4 CHO H 73.5±2.0(3)^c 62.1±4.1(3)^c 61.1±3.6(3)^c 80.1±4.7(3)^a

50 75.3±2.2(3)^c 79.9±2.9(3)^c

20 81.9±1.8(3)^c 83.2±3.0(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

4a 100 C6H5 CH2OH H 74.6±1.5(3) ^c 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

4b 100 o-Cl-C6H4 CH2OH H 57.4±5.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

4c 100 m-Cl-C6H4 CH2OH H 65.9±4.8(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c

50 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c

20 87.2±0.3(3) 86.1±0.8(3)^c 84.9±2.7(3)

續表一

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

4d 100 p-Cl-C6H₄ CH2OH H 60.9±7.5(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3) ^c

50 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3) ^c 66.7±11.1(3)^c

20 84.4±0.6(3) 87.0±2.5(3) 88.2±0.9(3)

IC50 ＞300 μM 84.1 μM 84.7 μM 167.6 μM

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

5 50 C6H5 COCH3 COCH3 本身促進血小板凝集

20 88.3±0.6 (3) ^c 84.2±0.7 (3) ^c 85.2±0.3 (3) ^c 86.0±1.8 (3)a

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

6 100 C₆H₅ COCH₃ H 71.7±1.3(3)^c 53.1±7.5(4)^c 39.1±6.3(3)^c 66.3±0.5(3)^c

50 71.9±3.0(4)^c 64.3±2.4(3)^c 81.0±0.7(3)^c

20 81.9±1.2(4)^c 85.6±0.9(3)^c

IC₅₀ 365.2 μM 263.9 μM 563.5 μM

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

7 100 C6H5 CH=NON H 26.4±4.5(4)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(4)^c 13.6±0.7(3)^c

50 79.9±0.9(4)^c 0.0±0.0(3) ^c 0.0±0.0(4)^c 66.6±1.7(3)^c

20 67.7±2.6(3)^c 45.0±11.4(4)^b 84.8±1.6(3)^c

10 81.4±1.6(3)^c 77.7±3.4(3)^b

IC50 83.4 μM 71.7 μM 198.0 μM

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

8 50 C6H5 COOH H 89.6±0.6 51.4±0.6(3)^c 30.9±11.6(4)^c 89.2±0.5(3)*

20 83.5±1.1(3)^b 84.6±2.0(4)

IC50 ＞300 μM 175.4 μM 121.3 μM ＞300 μM

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

9 100 C₆H₅ CH₂OCH₃ H 61.6±0.3(3)^c 53.5±4.9(3)^c 8.7±1.0(4)^c 58.6±0.6(3)^c

50 82.5±1.2(3) ^c 65.0±1.4(3)^c 19.6±1.2(4)^c 81.4±1.2(3)^c

20 70.4±0.9(3)^c 77.0±4.7(4)^a

10 79.9±2.9(3)^c

IC₅₀ ＞300 μM 317.9 μM 135.9 μM ＞300 μM

Platelets were incubated with test sample at 37 ℃ for 1 min before thrombin (0.1 unit/ml), AA (100μM), collagen (10 μg/mL) or PAF (2 ng/ml) was added to trigger aggregation.Values are presented as mean ± S.E.

and the concentration (μM) causing 50% inhibition of platelet aggregation (IC50). ^a : P＜0.05, ^b : P＜0.01, ^c : P

＜0.001

R'

表二

.

化合物 11-17 對血小板凝集之抑制活性

Compd conc

μg/ml R R' Thrombin AA Collagen PAF

Control 92.5±0.4(3) 87.8±0.6(6) 87.8±1.3(4) 90.2±0.5(4)

11 100 CH3 H 81.6±3.9(3)^a 39.4±4.4(4)^c 37.2±1.43)^c 42.1±4.5(4)^c

Control 92.5±0.4(3) 87.8±0.6(6) 87.8±1.3(4) 90.2±0.5(4)

12 100 C2H5 H 33.3±3.6(3)^c 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(4)^c

50 本身促進血小板凝集 56.6±8.3(6)

20 31.4±17.2(5)^b 85.6±8.3(3)^c

10 83.3±4.5(4)

Control 92.5±0.4(3) 87.8±0.6(6) 87.8±1.3(4) 90.2±0.5(4)

13 100 C₃H₇ H 41.2±7.0(3)^c 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(3)^c 1.1±0.9(4)^c

50 本身促進血小板凝集 37.9±11.8(3)

20 29.5±16.2(4)^a 87.9±0.8(3)^c

10 70.5±8.6(4)^a

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)

14 100 iso-C3H₇ H 71.1±6.8(3)^a 48.9±9.0(4)^c 26.8±1.0(3)^c 38.4±5.9(3)^c

Control 90.4±0.5(4) 89.3±0.9(4) 88.3±0.3(4) 90.7±0.4(4)^c

15 100 C4H9 H 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c 43.5±5.6(3)^c

Control 89.3±0.9(4) 88.4±0.3(4) 90.4±0.5(4) 90.7±0.4(4)^c

16 100 CH₃ CHO 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c

續表二

5 70.7±1.1(3) 79.1±1.3(3)^c

2 81.5±0.7(3)^c

IC50 215μM 112μM 112μM 180μM

Control 89.3±0.9(4) 88.4±0.3(4) 90.4±0.5(4) 90.7±0.4(4)^c

17 100 CH3 CH=NOH 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(4)^c 0.0±0.0(3)^c 0.0±0.0(3)^c

50 82.0±1.0(3)^c 0.0±0.0(4)^c 17.1±2.9(3)^c 55.6±1.1(3)^c

20 0.0±0.0(4) ^c 18.9±0.4(3)^c 83.5±0.8(3)^c

10 24.4±2.9(4)^c 19.4±0.7(3)^c

5 30.7±3.1(4)^c 44.5±1.9(3)^a

2 76.4±1.4(4)^c 83.5±0.2(3)^c

1 86.3±0.6(4)^a

IC50 29.5μM 81.7μM 224.5μM

Platelets were incubated with test sample at 37 ℃ for 1 min before thrombin (0.1 unit/ml), AA (100μM), collagen (10 μg/mL) or PAF (2 ng/ml) was added to trigger aggregation.Values are presented as mean ± S.E. and the concentration (μM) causing 50% inhibition of platelet aggregation (IC50). ^a : P＜0.05, ^b : P＜

0.01, ^c : P＜0.001.

第三節 抑制嗜中性白血球脫顆粒反應之活性

化合物 2a-d、3a-d、4a-d 及 5-9、化合物 11-19、化合物 20-24 對嗜 中性白血球脫顆粒反應之抑制活性如表三、表四及表五所示。很明顯的可 以看出來，當 carbazole 環上 3，6 位沒有取代基團時，所有的化合物 2a-d 都沒有活性。然而當2a 之 3 位導入-CHO 時 3a 則呈現明顯的抑制活性，

其 IC50為 11.2 μΜ，相當於 positive control TFP，進而將 3a 之 9-benzyl group 以

o-chlorobenzyl group 取代形成 3b 時，則活性增強一倍。相反的，

3a 之 benzyl group 被 m-chlorobenzyl (3c)及被 p-chlorobenzyl (3d)取代時，

則活性都大幅的減弱。

另一方面把 3a、3b 及 3c 之-CHO 還原成-CH2OH 分別形成 4a、4b 及 4c 時，其活性並沒有顯著的變化。然而當 9-(p-chlorobenzyl)carbazole -3-carbaldehyde (3d)還原成 9-(p-chlorobenzyl)carbazole-3-carbinol (4d)，則 大幅增強其活性。

在此值得一提的是化合物 4b 及 4d 具有相當強之活性，IC50為 2.0μ Μ，相當於 postive control TFP 之 6-7 倍。當 3a 之-CHO 被氧化成-COOH (8 )時，其活性減弱一半， 不過仍具顯著的活性。同樣的當 3a 之-CHO 改變成-COCH3 (5 及 6 )或-CH=NOH (7)時則活性都大幅下降。

表三. 化合物 2a-d、3a-d、4a-d 及 5-9 對嗜中性白血球脫顆粒反應之抑制

3b 1 CHO H 19.5±2.2** 29.1±5.6 45.2±5.5* 25.9±7.2

30 31.6±1.1 2.9±3.4 36.8±7.0 2.4±9.4 a ;Data are presented as mean ± S.E. ; .b: Inducer: 1μM fMLP + 5μg/ml cytochalasin B. c: *P＜0.005, **P

＜0.001, N=3. d: TFP: trifluoperazine (postive control).

表四. 化合物 11-19 對嗜中性白血球脫顆粒反應之抑制活性

Compd

conc Percent Release

μM R R' β

-Glucuronidase

﹪inhibition Lysozyme % inhibition

Control 14.0±0.9 34.9±3.7

100 17.5±0.9* -33.8±8.0 52.4±2.9* -30.2±8.0 a: Data are presented as mean ± S.E. ; b: Inducer: 1μM fMLP + 5μg/ml cytochalasin B. c: *P＜0.005, **P

＜0.001, N=3. d: TFP: trifluoperazine (postive control).

表五. 化合物 20-24 對嗜中性白血球脫顆粒反應之抑制活性

Compd

conc Percent Release

μM R β-Glucuronidase % inhibition Lysozyme % inhibition

第四章C

ont

rol

37.8±1.8 54.9±2.3

TFP 3 38.7±1.9 -3.4±2.1 69.9±3.0 -27.0±4.1

10 17.9±0.3 38.3±2.7** 39.1±0.3** 27.5±5.8*

30 5.0±0.6 87.1±2.7** 2.6±0.6** 94.3±2.1**

IC50 12.2±0.3 13.2±0.7

N H₂C

R

10 10 COOC2H5 37.4±1.5 -0.3±1.3 55.2±0.6 -0.8±1.5 a: Data are presented as mean ± S.E. ; b: Inducer: 1μM fMLP + 5μg/ml cytochalasin B. c: *P＜0.005, **P

＜0.001, N=3. d: TFP: trifluoperazine (postive control).

第四節 嗜中性白血球過氧化物形成反應之抑制活性

Superoxide anion formation

Control 3.31±0.32

TFP 1 3.12±0.59 2.3±9.0

3 1.89±0.59** 44.2±12.4

續表六

10 0.53±0.06** 82.9±3.3

5.6±0.30

control 3.31±0.32

3a 30 C6H5 CHO H 3.54±0.45 4.6±11.3

100 3.89±0.90 -1.6±18.4

IC50 ＞100μM

control 3.31±0.32

3b 30 o -Cl-C6H4 CHO H 3.43±0.39 7.5±9.8

100 4.15±0.43 -10.7±1.9

IC50 ＞100μM

control 3.31±0.32

3c 30 m -Cl-C6H4 CHO H 3.98±0.28 -6.8±2.3

100 3.93±0.23 -6.1±5.7

IC50 ＞100μM

control 3.31±0.32

3d 30 p-Cl-C6H4 CHO H 3.66±0.47 -5.2±2.7

100 4.06±1.03 -15.1±17.6

IC50 ＞100μM

control 3.31±0.32

4a 30 C6H5 CH2OH H 3.74± 2.3±13.9

100 3.44± 8.6±4.7

IC50 ＞100μM

control 3.31±0.32

4b 10 o -Cl-C6H4 CH2OH H 4.15±0.02 -48.5±9.0

30 4.24±0.05** -51.8±9.2

100 4.36±0.12** -56.2±11.0

IC50 ＞100μM

control 3.31±0.32

4c 30 m -Cl-C6H4 CH2OH H 3.93±0.84* -33.7±14.2

100 4.25±0.50* -29.0±8.9

IC50 ＞100μM

control 3.31±0.32

4d 10 p-Cl-C6H4 CH2OH H 3.07±0.16 -9.3±3.8

30 2.97±0.08 -6.0±5.3

IC50 ＞100μM

control 2.81±0.17

TFP 3 2.13±0.04 23.7±3.5

10 0.56±0.08** 79.2±4.3

30 0.22±0.09** 91.9±4.3

IC50 9.7±1.1 μM

control 2.81±0.17

5 10 C6H5 COCH3 COCH3 2.44±0.13 12.0±9.4

30 3.01±0.12 8.0±9.4

IC50 ＞30μM

control 2.81±0.17

6 10 C6H5 COCH3 H 2.47±0.29 10.7±14.4

30 1.52±0.20** 45.7±7.6

IC50 ＞30μM

續表六

control 2.81±0.17

7 3 C6H5 CH=NOH H 3.35±0.10 -20.0±5.4

10 3.78±0.18* -36.7±11.8

30 5.35±0.11** -93.1±12.4

IC50 ＞30μM

control 2.81±0.17

8 10 C6H5 COOH H 2.80±0.25 0.3±5.6

30 3.07±0.18 9.9±8.4

IC50 ＞30μM

control 2.81±0.17

9 10 C6H5 CH2OCH3 H 3.26±0.52 -11.4±8.5μM

30 2.13±0.31 23.3±13.5

IC50 ＞30μM

control 6.95±0.33

10 10 C6H5 COOC2H5 H 7.36±0.46 -6.5±9.4

30 6.34±0.09 8.3±5.7

IC50 ＞30μM

control 5.85±0.50

TFP 3 6.04±0.19 -4.5±10.0

5 4.60±0.21 20.7±6.5*

IC5 8.3±0.8μM

control 2.81±0.17

16 10 H CHO H 2.12±0.22 22.9±12.1

30 1.72±0.24** 38.3±10.1

IC50 ＞30μM

control 2.81±0.17

17 30 H CH=NOH H 2.08±0.32** 27.2±8.3

100 2.51±0.07 10.2±3.9

IC50 ＞30μM

續表六

control 6.95±0.3

18 10 H CH=CHCOOH H 5.61±0.44 22.8±7.1

control 2.81±0.17

20 10 C6H5 CH=CHCOOH H 3.22±0.18 -16.2±12.6

30 2.64±0.16 5.2±7.7

IC50 ＞30μM

control 6.95±0.33

21 10 C6H5 CHC(COOEt)2 H 6.16±0.48 11.5±3.0

30 6.25±0.16 9.4±6.8

IC50 ＞30μM

control 6.95±0.33

22 10 C6H5 CH=NNHCONH2 H 6.85±0.26 1.1±4.8

30 3.02±0.31 12.9±6.7

IC50 ＞30μM

control 6.95±0.33

23 10 CHC(COOEt)(CN) H 6.52±0.32 6.2±1.5

TFP: trifluoperazine (as positive control).

第五節 肥胖細胞脫顆粒反應之抑制活性

compdsconc Percent release

3d 10 CH2-(p-Cl-C6H4) CHO H 21.6±5.7 32.7±12.4 59.7±1.8 9.4±1.2

control 18.0 ± 0.9 -- 25.0 ± 1.0 --

control 31.5±1.4 54.0±0.5

21 10 CH2-C6H5 CH=C(COOEt) H 27.2±0.9 12.8±2.2 57.3±2.3 -6.0±5.4

30 27.4±1.0 12.9±0.8 57.0±3.5 -5.5±7.6

control 31.5±1.4 54.0±0.5

22 10 CH2-C6H5 CH=NNHCONH2 H 31.7±1.8 -0.5±1.4 65.5±4.1 -22 4±8.2

30 31.9±1.1 -1.5±4.7 66.6±2.7 -23.3±6.1

control 31.5±1.4 54.0±0.5

23 10 CH2-C6H5 CH=CHCOCH3 37.6±3.0 -19.3±7.8 66.0±4.4 -22.2±9.3

30 31.9±1.4 -1.2±1.8 60.7±3.4 -12.4±7.5

control 31.5±1.4 54.0±0.5

24 10 CH2-C6H5 CH=CHCOOC2H5 H 33.5±1.9 -6.0±1.5 61.9±3.1 -14.7±6.6

30 32.9±1.8 -4.3±1.3 61.4±3.3 -13.6±7.0

control 31.5±1.4 54.0±0.5

Mepacrine 10 23.6±0.4 24.6±0.7* 41.8±2.5 22.5±1.8*

30 14.4±0.2 54.0±0.5** 29.4±1.8 45.4±1.2**

100 4.5±0.3 85.4±1.7** 10.9±0.6 79.7±0.5**

25.57±0.6 31.6±1.0

Mast cell were preincubation at 37 ℃ with 0.5 % DMSO or test compounds for 3 min. of cytochalasin Fifteen minutes after the addition of compound 48/80 (10μg/ml),β-glucuronidase and histamine activities in the supernatant were determined. Values are presented as mean±S.E., N=3-4, *P＜0.05 **: P<0.01 .

第四節 對 Microglia cells 產生 NO 及 TNF-α之抑制活 性

化合物2a-d，3a-d，4a-d 及 5-9 對 LPS / TNF-α所引起的 N9 microglia cell 產生 NO 及 TNF-α之抑制活性如表八所示。

在 Nitrile assay 中化合物 3b 比 postive control 1400 W 更佳的抑制 NO 產生之活性，其 IC50為 3.0μΜ，而化合物 3b 之

o-Cl 移到 m 位（3c）

時其活性降低約 1/5。若移到

p 位（3d）時，其活性又大幅下降，若將

Cl 去除（3a）其活性亦相當弱。上述化合物 3b，3c 之 CHO 去除時（2b 及2c），其活性明顯降低。而低活性的化合物3a 及 3d 除去 CHO 時（2a，

2d）活性依然很低。進而將化合物 2a 之 phenyl group 除去時（11）活性

又減弱。另外化合物3b 之-CHO 改變成-CH2OH（4b）時活性略增。而當 化合物 4b 之

o-Cl 改變成 m-Cl（4c）及 4'-Cl（4d）及除去 Cl（4a）其效

價變化傾向與由化合物3b 變成 3c，3d 及 3a 時之變化類似。

在 TNF-αassay，化合物 3b 及 4b 具有強效的抑制 LPS / TNF-α-γ -induced TNF-α產生之活性，IC50分別為 0.6 及 0.5μΜ。

表八. 化合物 2a-d、3a-d、4a-d 對 N9 細胞產生 NO 及 TNF-α之抑制活 性

N

R'

CH₂-R

IC50 (µM)^a

Compd R R'

Nitrite TNF-α

2 H H > 30 ( 6.8 ± 1.0%)^b > 30 (21.7 ± 2.9%)

2a C6H5 H > 30 (32.7 ± 0.4%) > 30 (46.3 ± 1.8%) 2b o-Cl-C6H4 H > 10 (45.9 ± 0.9%) 2.93 ± 0.06 2c m-Cl-C6H4 H > 30 (37.2 ± 1.5%) > 30 (44.7 ± 1.9%) 2d p-Cl-C6H4 H > 10 ( 6.7 ± 2.5%) > 10 (40.9 ± 7.9%) 3a C6H5 CHO > 10 (20.0 ± 5.6%) > 10 (43.9 ± 1.8%) 3b o-Cl-C6H4 CHO 3.0 ± 0.1 0.64 ± 0.23 3c m-Cl-C6H4 CHO 16.4 ± 0.3 6.50 ± 0.13 3d p-Cl-C6H4 CHO > 10 ( 6.2 ± 0.6%) > 10 (38.4 ± 1.8%) 4a C6H5 CH2OH > 10 (45.0 ± 2.0%) 4.90 ± 0.14 4b o-Cl-C6H4 CH2OH 2.3 ± 0.1 0.52 ± 0.16 4c m-Cl-C6H4 CH2OH 9.9 ± 0.3 4.60 ± 0.12 4d p-Cl-C6H4 CH2OH > 10 (12.9 ± 1.6%) > 10 (11.1 ± 3.1%)

1400W^c 6.0 ± 0.1 ND^d

Dexamethasone^c ND 0.10 ± 0.01

a TNF-α was measured by using TNF-α ELISA kit and see ref 65 for NO determination. Values are expressed as the means ± S.E. (n = 3). ^b When 50% inhibition could not be reached at the highest concentration, the percent inhibition is given in the parentheses.Compounds that were unable to evaluation at the concentrations > 10 µM because of the cytotoxicity. ^c 1400W (N-(3- aminomethyl)benzylacetamidine) and dexamethasone are the reference inhibitors for nitrite and TNF-α formation, respectively. ^d ND, not determined.

第八節 Carbazole 衍生物(2-15)對 HL60、U937 及 K562

等癌細胞增殖率的影響

將 HL60、U937 及 K562 三種細胞株分別用化合物 2-15 處理 24 小時 後，再用 PI 螢光染色，經流式細胞儀偵測並分析存活細胞之數量的百分 比值，列記於表九及圖五，從表九及圖五得知這些 carbazole 衍生物，對 HL60、U937 及 K562 等細胞增殖率都有明顯的劑量依存性

(dose-dependent)抑制作用。

為了探討其結構與活性的相關性，著者將表九數據分別推算其 IC50，

列於表十，這些 carbazole 衍生物的結構與活性之關係敘述如下：

當基本骨架 carbazole 第 9 位接上 benzyl group (2a)及

m-chlorobenzyl

group (2c)時，對 HL60 及 U937 細胞株都呈明顯的抑制活性，但是對 K562 則活性甚弱。當接上

o-chlorobenzyl group (2b)時，則只對 U937 細胞株有

活性而已。若接上

p-chlorobenzyl group (2d)時，對三種細胞株都沒有明顯

活性。

進而將化合物2a 之第 3 位導入-CHO (3a)，其活性與化合物 2d 一樣，

都沒有明顯活性。當化合物3a 之 benzyl group 的 ortha 位與 para 位，導 入 Cl 而形成 3b 及 3c 時，對 HL60 及 U937 細胞株之活性甚強，而且對 K562 也呈明顯的活性。當 3b 或 3c 之 Cl 原子移至

para 位 (3d)時，則只

對 U937 細胞株抑制活性很強而已，對其他兩種細胞株活性較弱。

另一方面，當 carbazole 之第 3 位固定為-CH2OH，而第 9 位為 benzyl group (4a)時，對 U937 呈現相當強的活性，而對其他兩種細胞株之活性只

是中等而已。若將化合物4a 之 benzyl group 改變成 o-chlorobenzyl group (4b)和

m-chlorobenzyl group (4c)時，則對 HL60 及 U937 細胞株之抑制活

性都很強，對 K562 則比較弱。再將 4b 或 4c 之 Cl 原子移至

para 位 (4d)

時，則只對 U937 細胞株之抑制活性很強而已。

若將2a 之第 3 位分別導入-COCH3 (6)及-CH=NOH (7)，則只對 U937 細胞株呈現中等活性而已。

進而將 carbazole 第 9 位接上各種 alkaly group 時 (11-15)，都只有對 U937 細胞株呈現活性而已。

綜合以上結構與活性關係之檢討，可以觀察到這些 carbazole 衍生物 對 U937 之抑制活性最為明顯，其次為 HL60，最不明顯的是 K562 細胞 株。

另外也可以觀察到 carbazole 第 3 位之-CHO 或-CH2OH 以及第 9 位 之 chlorobenzyl group 對活性之影響比較大。

表九. Carbazole 衍生物對 HL 60、U937 及 K562 癌細胞之抑制活性

R'

Compds R R' Conc.

Compds R R' Conc.

Compds R R' Conc.

Compds R R' Conc.

Compds R R' Conc.

細胞增值率的影響

(A)

Concentration (µM)

0 2 4 6 8 10 12

Proliferation rate (% of control)

0

Proliferation rate (% of control)

0

Proliferation rate (% of control)

0

U937 及 K562)細胞增殖率之 IC ₅₀

第三章 結論

以 9-benzycarbazole-3-carbinol (4a)為先導化合物，合成一系列的衍生 物，分別測試其抗血小板活性、抗炎活性以及小神經膠質細胞活化之抑制

以 9-benzycarbazole-3-carbinol (4a)為先導化合物，合成一系列的衍生 物，分別測試其抗血小板活性、抗炎活性以及小神經膠質細胞活化之抑制

在文檔中 3,6,9-置換唑衍生物之合成與生理活性; Synthesis and Biological Activity of 3,6,9-Substituted Carbazole Derivatives (頁 26-0)