Carbazole 類化合物之研究概況

本 論 文 主 要 的 內 容是

一

系 列 唑 (carbazole)類衍生物之化學合成以及

其抗血小板、抗炎、抗過敏和抗癌活性的探討，因此，首先將 carbazole 類化合物之研究概況、血小板生理功能以及與炎症、過敏相關的嗜中性白 血球肥胖細胞生理功能，乃至巨噬細胞與小神經膠質細胞的生理功能分述 如下，作為本研究的背景資料。

第一節 Carbazole 類化合物之研究概況

壹、 Carbazole 類化合物之合成方法

Carbazole 類化合物早在 1872 年就從煤油、焦油中被分離出來，運用 於染料工業、高分子聚合物等化學工業上，當時即有 carbazole 類化合物 之合成報告^1-2，1964 年 Chakraborty 等從芸香科植物

Murraya koeniggi 分

離出 girinimbine 後，迄今已有數以百計的 carbazole alkaloid 被發現 ^3-4， 也因此 carbazole 類化合物之合成方法陸續出現於文獻中。在此僅將主要 的合成方法列述如下。

一、 Graebe-Ullmann 合成方法

⁵

如 Scheme 1 所 示 ， 以

o-aminodiphenylamine (I) 為 起 始 物 ， 經

diazotization 後 形 成 benzotriazole 中 間 體 (II) ， 進 而 加 熱 進 行

rearrangement，即形成 carbazole (III)。

Scheme 2 所示，cyclohexanone phenylhydrazone (IV)經 H2SO4處理形 成 tetrahydrocarbazole (V)後，再於 quinoline 中以 CuO 做為催化劑，加熱 即可 dehydrogenation 形成 carbazole (III)。

Scheme 2

進行加壓反應，即可得到 carbazole (III)。

Scheme 3

四、 Fries 合成法

⁸

如 Scheme 4 所示，diphenylamine 之 2,2'-dihalogen derivatives (VII)或 2-amino-2'-hydroxydiphenyl (VIII)在 Zn dust 中加熱蒸餾，即可得到相對應 之 carbazole (IX)。

Scheme 4

200 ⁰

C

H₂SO₄

IV III

N H NH₂ NH₂

dist. with Zn dust

VII IX

VIII N

H CH₃

CH₃ Br Cl H₃C

N

H CH₃

CH₃ H₃C

NH₂ OH CH₃ CH₃ H₃C

五、 Smith-Brown 合成法

⁹

如 Scheme 5 所示，將化合物 IV 在 UV 光照射下加熱，即可得到 carbazole (III)。

Scheme 5

六、 Carruthers 合成法

¹⁰

如 Scheme 6 所示，將 4-methoxy-4'-methyldiphenylamine (XI)利用光 化學合成法，可得到 carbazole 類化合物。

Scheme 6

hv

heat + N₂

IV III

N H N₃

hv

XI XII

n- hexane N

H

CH₃ H₃CO

N H

CH₃ H₃CO

七、

Chakraborty 合成法

¹¹

如 Scheme 7 所 示 ， 此 合 成 與 Borsche 方 法 類 似 ， 先 形 成 tetrahydrocarbazole 衍生物，只是所用原料與試藥不同，此法之產率比 Borsche 方法較高。

Scheme 7

八、 Kureel 及 Chakraborty 等之合成法

^12-13

如 Scheme 8 所示，Kureel、Chakraborty 及 Narasimhan 分別以不同合 成途徑合成 2-hydroxyl-3-methylcarbazole 之生物鹼。

NHNH₂

CH₃O H₃C O

XIII XIV

+ AcOH

H₂SO₄

XVII XVI

chloranil

CH₃

N H₃CO

N

CH₃

N H H₃CO

N H

XV

2-nitrobromobenzene Triethyl phosphite 2-Hydroxycyclohexanone Pd / C HCl / AcOH g:Hung-Minlon Dehydrogenation

O

九、 Chakraborty 合成法

¹⁴

如 Scheme 9 所示，Chakraborty 等仿照生合成途徑，提出 carbazole 合成法。

最近 Mahboobi 等提出利用 intramolecular Michael addition 合成各種不

同取代基之 carbazole 衍生物。

h : DDQ /dioxane or p -chloroanil / mesitylene or

上述文獻記載的 carbazole 之合成方法，主要的重點是在於 carbazole 環的合成及生物鹼的合成，本研究標的化合物之合成，所利用的起始原料

已有市售品，所以未直接利用文獻所記載的方法。將來若要延續本研究成 果，合成 carbazole 環有各種不同取代基的衍生物時，就可以應用上述文 獻方法，合成 carbazole 環上有各種取代基的化合物作為起始原料。

貳. Carbazole 類化合物之生理活性

如第一節所述，已知的 carbazole 生物鹼以及被合成的 carbazole 衍生

物相當多，其生物活性的探討主要是集中於抗癌活性方面^16-23，其中有些

化合物活性甚佳，所以也有一些作用機轉探討之報告^19-21。其它也有關於

carbazole 類化合物具有 anti HIV ²⁴、antioxidant ²⁵、antifungus ²⁶、antibacteria

27以及 antiplatelet ²⁸等活性之相關報導，但是關於抗炎及抗過敏活性之探 討尚未見諸文獻。

第二節 血小板之生理功能

血小板是血球細胞中最小的細胞，由巨核細胞的細胞質分裂而成，不 具有細胞核及大部份蛋白質的生成能力，通常生命週期約十天左右。在止 血生理機能方面，血小板扮演著非常重要的角色，當內皮細胞受損或血管 破 裂 受 傷 時 ， 血 管 先 收 縮 ， 血管內皮細胞下的基質(如 collagen、 von Willebrand factor 、 fibronectin 、 laminin 與 vitronectin) 與 adenosine 5-diphosphate (ADP)會先釋出，促使血小板改變形狀，以便附著於受損部 位，引發血小板的活化與釋出反應 ²⁹。另外組織血栓形成素 (tissue thromboplastin)由受傷的組織形成釋出，再經由凝血活化機轉外在途徑，

轉變成血栓素(thrombin)，血栓素會使纖維蛋白原(fibrinogen)轉變成纖維 蛋白(fibrin)，纖維蛋白再受到 ADP 的活化，與受傷組織的血小板結合，

形成凝血塊(fibrin clot)，再聚集形成堅固的血小板止血栓 (thrombus)，達 到止血效果（圖一）³⁰。

圖一、血小板凝血機轉

血小板的活化劑如 collagen、ADP、thrombin、thromboxane A₂

(TXA2 )、platelet-activiting factor (PAF)、epinephrine 及 serotonin 與血小板 細胞膜上的接受體結合後，經由細胞內訊息傳遞者如 G protein (GTP binding protein)，引發 phospholipase C (PLC)、phospholipid A2 (PLA2)及 cyclooxygenase 等活化與釋出。例如 phospholipid 先受到 PLA2作用轉變成 arachidonic acid (AA)，而 AA 再被 cyclooxygenase 轉變成 prostaglandin

endoperoxides (PGG2, PGH2)，其中 PGH2於血小板中經過 thromboxane A2

synthetase 的作用，產生 TXA2，引發血小板凝集作用。PGH2於血小板中 若經由 prostacyclin I2 synthetase 的作用，產生 prostacyclin I2 (PGI2)，而 PGI2

則具有抑制血小板凝集作用³¹ （圖二）。

圖二、血小板活化機轉

血小板止血栓 (thrombus)能在受損組織產生止血作用，但也很容易體 內造成栓塞 (embolism)，因此在血液凝集末期時，纖維蛋白溶解系統 (fibrinolytic system)會運轉，溶解由血栓脫落下來之小血凝塊，避免阻塞 體內的小血管，同時抑制血小板凝集之物質也會開始增加，阻止血小板繼 續凝集。其中如 plasminogen 受到 tissue plasminosen activator (t-PA)的活化 與 fibrin 結合成 fibrin-t-PA-plasminogen 之錯合物再轉變成 fibrin-plasmin，

進而將 fibrin 分解使血栓溶解(lysis of thrombus ) ³²。

在 正 常 生 理 狀 態 下 為 了 維 持 血 小 板 不 被 活 化 ， 血 管 內 皮 細 胞 (endothelium cell)可釋出 PGI2、endothelium-derived relaxing factor (EDRF) 及 nitric oxide (NO)等物質，能活化血小板的 adenyl cyclase 與 soluble guanylate cyclase (sGC)。EDRF 是一種 cAMP 的促進劑；NO 則能直接刺 激 sGC 活 化 ， sGC 能 催 化 GTP 轉 變 成 cGMP 以 及 抑 制 cGMP；

phosphodiesterase 將 cGMP 裂解成 5'-GMP 之作用，此兩種作用機轉都能 使 cGMP 增加。另外 NO 也會間接活化內皮細胞的 cyclooxygenase 促使 PGI2產生，PGI2能使 cAMP 含量增加。當血小板之 cAMP 及 cGMP 含量 上升時，血小板的凝集作用會被抑制，血小板的止血功能正常就不會引起 血栓或栓塞，而造成多種血管性疾病³³。

本論文之實驗應用上述之原理，分別以 thrombin、collagen 及 PAF 引 發血小板之凝集，測試化合物抑制其凝集的活性。

第三節 嗜中性白血球與肥胖細胞之生理功能

嗜中性白血球 (neutrophils)為一種有高度運動性具吞噬作用之顆粒 性白血球(granulocytes)，血液中之正常濃度為 3-5 ×10 ⁶ / ml。當身體組 織受傷 (tissue damage )或遭感染 (infection)時會急速增加，並由血液移到 受損組織中，經活化作用後，釋出 neutral proteases、acid hydrolases、

phospholipase、myeloperoxidase 及 cationic protein 等物質以分解吞食細菌

34。

嗜中性白血球的活化途徑需由多重訊息傳遞，其中可經由化學誘引 劑(chemoattractants ) 如 ECF-A 及 NCF 這些化學媒介物而活化的嗜中性 白血球，會產生高反應性之過氧自由基 (superoxide anion; O2

-)、羥基自由 基 (hydroxy radical; OH^-)及過氧化氫 (hydrogen peroxide; H2O2)等具有細 胞毒性的 oxygen species，引起如老化 (aging)，缺血性再灌注時引起損傷 (ischemia reperfusion injury)，類風濕性關節炎 (rheumatoid arthritis)，感染 性腸炎 (inflammatory bowel disease)等細胞損傷；同時活化的過程中會釋 出 lysozymal enzyme 造成肺氣腫 (pulmonary emphysem)，類風濕性關節 炎，動脈粥硬化 (arteriosclerosis)，腎小球腎炎 (glomerulonephritis)等，

因組織蛋白分解 (tissue proteolytic disruption)而引起之疾病（圖三）^35.。 另外活化途徑由 fMLP、LTB4 等化學誘引劑誘導嗜中性白血球細胞膜上 的接受體與 G protein 結合會活化抑制性的 Gi protein，降低細胞內 adenyl

cyclase 量 ³⁶。

肥胖細胞（mast cell）在即時型過敏（anaphylaxis）反應中扮演著重 要角色，當肥胖細胞受到物理或化學性刺激時，被活化而引發釋放反 應，多種媒介物（mediator）即被釋放出來，如 vasoactive mediators

（histamine、kininogenase、PAF）、spasmogens（PGD2, LTC4, LTD4）及 化學誘引劑（ECF-A, NCF）等，這些物質會導致血管擴張、通透性增 加或引發支氣管平滑肌、粘膜水腫及分泌增加，造成過敏及氣喘發生

37-38

。因此藥物若能抑制肥胖細胞的活化，對過敏及氣喘症狀的預防與 治療將會有改善作用。

本 論 文 抗 發 炎 實 驗 是 以 fMLP (N-formylmethionyl-leucyl-

phenylalanine)引起嗜中性白血球釋放β-glucuronidase 及 lysozyme 後，

篩選出具有抑制作用之化合物，另外也測試化合物對因 fMLP 及 PMA

（phorbol 12-myristate 13-acetate）引起嗜中性白血球釋放過氧自由基形 成之抑制作用。篩選抗過敏化合物之實驗，以 compound 48/80（a polymer of N-(p-methoxyphenylethyl) methylamine with formaldehyde）誘發肥胖細 胞釋放β-glucuronidase 及 histamine 反應之抑制活性。

圖三、嗜中性白血球與肥胖細胞之活化與作用

第四節 巨噬細胞與小神經膠質細胞之生理功能

巨噬細胞 (Macrophages )是免疫細胞之一種，參與身體之免疫作用。

當免疫系統被病原菌 (microbial pathogen)引發後，巨噬細胞會受到細菌性 內毒素 (lipopolysaccharides; LPS)活化，產生一氧化氮 (nitric oxide，

NO) ， 腫 瘤 壞 死 因 子 (tumor necrosis factors ， TNF) 及 前 列 腺 素 ( prostglandins，PGs)等發炎物質³⁹。

NO 能 引 發 身 體 內 巨 噬 細 胞 誘 導 毒 性 (macrophage-induced cytotoxicity)，過量時會引起敗血性休克 (septic shock)，而 TNF 與致死性 休克 (lethal shock)、組織損傷，急性慢性發炎及惡病質 (cachexia)等病症 有關。PGE2 和血管擴張、紅腫等發炎現象有關 ^40-41。

小神經膠質細胞 (microglia cell)則是腦中的巨噬細胞，具有保護腦細 胞之功能，和大多數的發炎、感染及中樞神經系統之退化性疾病皆有關

42-43

。 當腦中神經元產生局部缺血及退化性疾病時，小神經膠質細胞快速 活化，進行吞噬作用及促使 NO、細胞激素（cytokines）、前列腺素自由 基 (free radical)等發炎媒介物釋出^44-46。這些物質若過量產生則對細胞有 害，如引起多發性硬化 (multiple sclerosis)病變 ⁴⁷，愛滋病感染 (HIV infection ) ⁴⁸和中樞神經系統退化性疾病^49-51，如阿茲海默症(Alzheimer's disease)等病變。若能有效的抑制小神經膠質細胞活性，則對上述各種中

樞神經系統疾病將會有效的改善。

本論文對由 LPS 誘發 RAW 264.7 (mourse macrophage-like)及 N9 (murine microphage)細胞株之 TNF-α形成及 NO 蓄積作用，以合成的化 合物進行抑制活性的篩選。

第五節 細胞週期之生命機制

細胞要維持正常大小與數目，保持保持增值與凋亡間的動態平衡，需 要有精確的細胞週期(cell cycle)的調控，細胞週期可分為 G0 / G1、S、G2 / M 等時期，當細胞週期失去調控時則有可能發展成為腫瘤細胞。

圖四、細胞週期 ⁵²

對於抑制腫瘤細胞的生長，可經由細胞週期的停頓、誘導細胞進行凋亡 (apoptosis) 或 細 胞 分 化 (differentiation) 而 達 到 抑 制 其 增 殖 (proliferation)作用，這也是目前用來篩選有效抗癌藥物的重要

指標。本論文即針對三種血癌細胞株 HL60 (acute promyelocytic leukemia)、U937（human histiocytic lymphoma）及 K562（chronic myeloid leukemia）以所合成之 carbazole 衍生物處理後，觀察 其細胞形狀、細胞週期的變化及增殖之影響等情形。

第七節 研究動機與目的

本研究室於 1995 年合成了 1-benzyl-3-(5-hydroxymethyl-2-furfuryl) indazole (YC-1) ⁵³，並發現其抗血小板之作用機轉特異 ^54-55，係 soluble guanyl cyclase (sGC) 新型的活化劑，同時具有抗炎及抗癌活性，其類緣 化合物A、B 也具有類似的生理活性。

本研究是選擇結構與YC-1、A、B 相近的 9-benzylcarbazole-3- carbinol (C)，作為先導化合物 (lead compound)，從事結構修飾合成一系列

carbazole 衍生物，並探討其抗血小板、抗炎、抗過敏及抗癌活性等各種 生物活性，期望能獲得新型生物活性物質。

N

CH₂OH N

N

O CH₂OH

CH2

N N

N N

CH₂

CH₂ CH₂

CH₂OH

CH₂OH

YC-1 A

B C

第二章 結果與討論

第一節 化合物之合成

標的化合物 2a-d,3a-d,4a-d 及 5-10 之合成如 Scheme 11 所示，首先將 起始原料1，與各種有不同取代基之 benzyl chloride 進行 benzylation，即 可得到相對應之 substituted benzylcarbazole 2a-d。化合物 2a-d 繼續以 POCl3 / DMF 進行 Vilsmeler-Haack reaction，即可得到相對應之 aldehydes 3a-d，這些 aldehydes 以 NaBH4進行 reduction，即可得到相對應之 carbinols 化合物4a-d。

另一方面2a 在 Ac2O (acetic anhydride)中，以 AlCl3催化, 即可得到化 合物 5（m.p：341-342 ℃）及 6（m.p：132-134 ℃）兩個產物，從兩者 之 MS 及元素分析的結果，得知產物 5 之分子式為 C23H11NO2 可能是 diacetyl compound，而產物 6 之分子式為 C21H17NO 可能是 monoacetyl

另一方面2a 在 Ac2O (acetic anhydride)中，以 AlCl3催化, 即可得到化 合物 5（m.p：341-342 ℃）及 6（m.p：132-134 ℃）兩個產物，從兩者 之 MS 及元素分析的結果，得知產物 5 之分子式為 C23H11NO2 可能是 diacetyl compound，而產物 6 之分子式為 C21H17NO 可能是 monoacetyl

在文檔中 3,6,9-置換唑衍生物之合成與生理活性; Synthesis and Biological Activity of 3,6,9-Substituted Carbazole Derivatives (頁 7-0)