組織培養苗之健康管理

文紀鑾¹

摘 要

在健康種苗產業發展中影響成功的因子很多，組織培養能夠成功的管理是 因為所有生產條件能被控制，其中最重要的因素就是能後夠控制微生物污染及 突變。健康種苗的管理應具備：1.健康的母本與培植體。2.生產健康種苗之組織 培養作業管理。3.病毒的檢測及控制。4.組織培養健康種苗的認証。

關鍵詞：組織培養、健康種苗、微生物污染、突變

前 言

組織培養應用在健康種苗生產體系其主要內容應包括去病毒技術與控制變 異種苗繁殖技術。在台灣此類技術應用在花卉種苗繁殖最多，尤其是蘭科植 物，在國際行銷上更顯重要，另外，在果樹類與蔬菜類作物也利用此技術病毒 病害病及細菌性病害，此在香蕉、葡萄、百香果、馬鈴薯與草莓已執行多年，

成效顯著，多數人在談健康種苗重點多放在病毒病，但詳細的解釋無病毒苗 (virus-free seedling )，指的是無特定病毒病之苗，而非無所有病毒之苗。

組培苗微生物污染

組織培養的培植體來自自然界，在大自然中可在植物上發現的微生物，對 植物而言可分為有害(一般病原菌)、有益(菌根菌、溶磷菌等)、或無害無益，但 對廣義的組織培養而言，都視為微生物污染(microbial contamination )，都應去 除，這也是目前大家普遍可接受的定義，但在組培中少數無害也無益，甚至有 益的微生物，如在金線蓮培養中發現一些菌種，反而有助於移植成活率，早期 蘭花的無菌播種，會利用蘭菌共培養，而促進種子發芽，但以目前商業生產的 標準，就必須接受廣義的標準。在組培中微生物污染大致可分為：(一)、真 菌。(二)、細菌。(三)、病毒、類病毒、植物菌質體(Agrios, 1988)。前二者可用 肉眼看到，俗稱發霉，可直接丟棄，後者感染瓶苗必需用檢測的方式才可發現 及作確認，根據 1997 年正式統計在全世界被發現的植物病毒約有 49 科 73 屬

1行政院農委會種苗改良繁殖場

977 種(Milton and Palukaitis, 2000)，每年因病毒損失約 600 億美金，因此組織培

「內生菌」(Resident endophytic bacteria)，直到目前為止，也是組培技術發展中 一直存在無法解決的問題，僅能儘量預防，加藥或其它處理作局部控制，最後 率。2.化學藥劑處理(chemotherapy)：培養基添加殺菌劑或抗病毒藥劑(Howell et

al., 2001),，Luna (2009)氏等人使用不同抗生素，並作不同組合，可以有效抑制

瓶內細菌生長，Virazole可抑制病毒核酸的合成，用來去除梨之Prunus necrotic

ring spot virus (PNRSV) 和 Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) 二 種 病 毒

(Cieślińska, 2007)。3.熱處理(thermotherapy)：親本在組培前高溫預處理(Howell

et al., 2001)， 在切芽前利用高溫(28-36℃)培養4週，減弱病毒活力。4.操作設備

與器械消毒：無菌操作台需注意濾網的有效使用時間及更換率網，使用生菌落 塵測定儀(particle counter)，可檢測濾網有無破洞，初級過濾網使用阻塞會減少 風量，造成內部正壓降低，影響污染，需適時更換，紫外線燈有效性會隨時間 而衰減；鑷子、刀子消毒採用酒精燈(本生燈)滅菌，或採用高溫高壓殺菌鍋滅

菌，使用後者，可利用殺菌指示帶，高溫指示器，作殺菌確效，最常忽略的是 高溫高壓殺菌鍋之殺菌確效，需作定期檢測保養，亦可置放一高溫指示器測 試，藉由顏色的改變可了解殺菌鍋確實有無達到完全殺菌。此影響培養基及器 械的消毒完全與否。5.人員的消毒多利用戴手術用手套配合75﹪酒精殺菌，操 作方法及流程需靠訓鍊及經驗來降低污染率。6.操作及培養環境，需作平時定 時的消毒及配合生菌落塵測定儀檢測作確效，一般大型培養室設計多設有浴塵 室，但需注意率網的更換，若使用無塵室(clean room)設計，需定時更換不同等 級之過率網，培養室的定時消毒及人員物品進出的管制可延長無塵室的正壓及 壽命。另為增加操作室的潔淨，可裝設紫外線燈，作為下班後，無人時的滅菌 用，維持操作室的清淨度。

三、微生物污染判斷時機與檢測方法

在組織培養過程中因細菌或真菌造成的污染，從培殖體植入培養基中開始 算起，培養基出現菌斑，而被肉眼發現及判斷，可因出現天數不一樣而大致可 判斷何種原因造成之污染，其中可分為1.第一天(即培植體移入次日)即看到菌 斑，此多為培養基消毒不完全。2.第3-5天發現菌斑，此多為人為操作、器械、

培殖體消毒不完全，或內生菌所造成。3.若為14-30天才發現則此多為內生菌及 蓋瓶不當造成之污染。4.若為半年以上才發現，則多為培養環境及蓋瓶不當或 破損所造成，少為內生菌所造成，對於繼代多次或多年的瓶苗，可能在某次繼 代不當造成污染。對於病毒所造成的污染，無法用肉眼或菌斑發現，由於培養 基中為富含營養及高生長調節劑的關係，芽體生長旺盛，無法出現嵌紋病毒的 特徵，此需用檢測方法來判斷。一般檢測的方法隨著生物科技的進步不斷創 新，目前一般使用：1.培養基測試法，利用多次繼代培養，不斷淘汰污染瓶。

達到篩選的目的(Knauss ,1976)。2.利用血清(Edwards and Cooper 1985)及抗體檢 測(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。3.核酸探針(polymerase chain reaction, PCR) (Sediva et al., 2006)檢測DNA或RNA。前者用於檢測真菌及細菌，

後二者可用於檢測真菌、細菌及病毒。有關病毒檢測，在使用抗體或核酸檢測 二法中，在成本上使用ELISA較PCR便宜，在敏感度上PCR較準確，因此重點在 使用時機，若檢測瓶苗中的病毒，則以核酸檢測較準確，因瓶內芽體病毒含量 及活力較低，ELISA讀值低可能造成誤差，若將瓶苗移出瓶外隔離種植，成活 後，採取第一片葉片檢測，則可以使用ELISA，敏感度增加，較省成本。

組培苗變異

組織培養是利用已知的培養條件，作人為的操控，達到最終增殖及增產目 的，其中應用的原理之一，就是藉由細胞不斷的分裂增殖(cell proliferation)，經

過分化(differentiation)，而形成器官(organ)或組織(tissue)，在此過程中的第一步 驟，細胞增殖，運用了生長調節劑(growth regulator)，俗稱荷爾蒙的添加，及不 斷的繼代培養，因此培殖體在高生長調節劑且長時間培養在培養基中，細胞的 增殖中，DNA 也隨之快速的複製，因此無形中增加了突變(mutation)的風險，影 響了組培苗追求均一性的品質，當然從育種的角度，也在藉由非兩性結合，創 造出不同DNA 組合的新個體，而創造新品種，這是組培苗變異的唯一好處，但 是組培苗大量生產追求的是性狀一致的品質，因此需要找到快速增殖與性狀一 致的平衡點，也就是荷爾蒙添加的平衡點，荷爾蒙越多，增殖倍率越高，但芽 體變小，有時呈過度叢生狀，成活率變低，變異率增加；荷爾蒙低，則繁殖倍 率減少，不符合組培的經濟效率，失去組培的意義，適當的繁殖率有助於維持 性狀一致性，叢生芽之繁殖倍率一般採用 2-4 倍，視種類而定，組培苗量產中 為減少突變常用的二方法，分別為控制荷爾蒙及定時的更新母瓶，控制變異。

另外荷爾蒙的選擇也很重要，近幾年來多種報告使用 thidiazuron(TDZ)進行增殖 的報告，其具有極強的細胞分裂素活性，然而是否會引起組培苗變異仍有待探 討。在組織培養報告中大多數使用細胞分裂素 BA 及生長素 NAA，培養出的植 株，有的報告認為不影響變異 (Tokuhara. and Mii, 1998)，有的認為會產生變異 (Kane et al., 1987)。此外培養基中添加 2,4-D，可能會造成組織培養苗倍數體的 變異 (Mishiba et al., 2000)，因此組培有效的增殖效率應兼顧移殖成活率及突變 率。

組織培養健康種苗管理

過去組織培養研究重點大部分著重在增殖倍率，隨著商業及國際化腳步開 始發現，病毒會隨著組培苗傳佈，健康種苗開始受到全球的重視，且多種機構 建立檢查制度，包括國際種子檢查協會（International Seed Testing Association，

簡稱ISTA）之國際種子檢查規則（International Rules for Seed Testing）進行檢 查程序，歐洲暨地中海地區植物保護組織（European and Mediterranean Plant Protection Organization，簡稱 EPPO）也針對 28 種無性繁殖作物種苗建立健康 種苗檢查制度，並核發檢疫證明及種子檢查相關證書。 荷蘭種球檢查實驗室，

協助農民栽植健康無病毒的種球及檢查種球病毒感染率，訂定分級標準制度。

該國除了設有球根花卉檢查中心（Dutch Flower Bulb Inspection Service）之外，

另設有園藝作物檢查服務中心（Naktuinbouw），專責其他花卉健康種苗檢查之 工作，約可進行 80 種不同花卉病毒檢查及品質認證，並核發不同等級的證書。

因此組織培養健康種苗的技術開發勢在必行，其執行必需達到下列要求：

一、無病毒的母本園及親本

組培母本保存園，必需具備可防止咀嚼式及刺吸式口器之昆蟲或軟體動物 進入之設施。並有一離地的栽培架。禁菸，人員進入園區溫室(設施)工作前，

需有簡單的消毒處理或戴手套及頭套。使用切芽工具需經高溫滅菌，應準備二 套(或以上)工具，以一株一套使用為原則，避免株間工具交叉使用造成之污 染。親本置入溫室中，需經病毒病檢查合格，使得放入，母本單株，須獨立標 示並放置一區，單株間距加大，枝葉不得有相互接觸之機會，發現疑似病毒感 染徵狀之病株，須立即單獨隔離或移出本園區。

二、組織培養作業管理

具備之操作台為「生產無病毒種苗專用無菌操作台」，不得與其它生產非 無病毒等級種苗之無菌操作台混用，無菌操作台內工具需以高溫或火燄消毒，

不得使用漂白水或藥劑消毒，操作使用相關工具(指切割刀具、鑷子及工作盤面) 需以單株單芽為一批號，更換消毒(指高溫或火燄)再使用之，以單芽為一批號 (單位)，建立初代培養之編碼制度，繼代培養生產階段須記錄世代之間之繼代 次數、批號及瓶數之「生產記錄表」。

三、病毒的檢測及追蹤

確定利用組織培養繁殖健康種苗之親本在繁殖過程中有五個病毒檢測點 (check point)，分別為(一)、母本期：母本需經目視無病毒徵狀，經一步用 ELISA 檢測，確認無病毒始可進入切芽階段。(二)、該芽初代培養及經多次繼 代培養產生之母瓶進入量產前需經 ELISA 及 PCR 檢查通過，才可進入量化生 產。(三)、量化後之增殖芽體，在未來的多次繼代過程，利用 ELISA 及 PCR

確定利用組織培養繁殖健康種苗之親本在繁殖過程中有五個病毒檢測點 (check point)，分別為(一)、母本期：母本需經目視無病毒徵狀，經一步用 ELISA 檢測，確認無病毒始可進入切芽階段。(二)、該芽初代培養及經多次繼 代培養產生之母瓶進入量產前需經 ELISA 及 PCR 檢查通過，才可進入量化生 產。(三)、量化後之增殖芽體，在未來的多次繼代過程，利用 ELISA 及 PCR

在文檔中 (農業試驗所特刊第143號)2009 花卉健康管理研討會專刊 (頁 137-144)