使用HPLC 以及 UV 檢測器去分析 MAT 酵素活性通常都達不到理想的感 度而無法檢測。此外，AdoMet 相當容易吸潮而且不安定，根據研究，純化過 的 (S,S)-AdoMet 在 37°C、pH 7.5 環境下 4 小時後可能已經衰減 14%。其中分
解 後 可 產 生 adenine 、 S-pentosylmethionine 、 5′-deoxy-5′-(methylthio) adenosine、homoserine lactone 以及無生理活性的 (R,S)-AdoMet stereoisomer [115]。這也代表著，在分析過程中如果歷經太長時間的酵素反應以及檢品處 理，AdoMet 亦將自行衰減並且產生更多干擾分析的產物。因此，AdoMet 要 準確定量並不容易，而且也不適合作為參照標準品 (reference standard)。要克 服這些困難，則可以利用偶合酵素的方式，將 COMT 加入於 MAT 的酵素反 應中，當 AdoMet 產生後，隨即被 COMT 將其甲基轉移至 esculetin，因而克 服 AdoMet 變質分解而影響定量的問題。此外，所生成的 scopoletin 較安定而 且具有高螢光性質，定性定量上都容易許多，故在最佳化的酵素反應條件下，
採用scopoletin 當作定量 AdoMet 之參照標準品是較適當的，在應用上也較簡 便。
Evaluation of the COMT-coupled Reaction
在 COMT 偶合的方法中，由於 esculetin 水溶解度不佳，因此溶於 isopropanol:water (1:1, v/v)。最後酵素反應液裡共含有 5%的 isopropanol，經 過驗證，其對酵素反應沒有抑制作用。參照標準品scopoletin 溶液平時儲存於 -20°C 中，其安定性至少能維持一個月。Scopoletin 溶解在移動相溶液中，其
螢光之激發波長與放射波長分別為347 及 415 nm。標準品之 HPLC 分析，使 用 2 pmol scopoletin 以及 20 pmol 的 esculetin。 Scopoletin 的滯留時間約為 2.95 min，而 esculetin 則滯留於 Si 60 管柱 (圖 7A, inset)至少超過 30 min。為 了避免過量的esculetin 積存於管柱內，加入 100 µl 的 boric acid 飽和溶液，除 了可終止酵素反應外，還具有和 esculetin 反應形成高水溶性鹽類的功能，使 esculetin 在萃取過程中停留於水層。萃取過程中，esculetin 的回收率少於 1% ， 而 scopoletin 則約為 80%。
為了確認Method II 中偶合酵素之機轉，酵素反應分別在 ATP (2 mM)、
esculetin (1 mM) 以及 S-adenosylhomocystein (AdoHcy; 100 µM) 存在與否的 條件下進行分析。AdoHcy 是強效的非專一性 COMT 競爭性抑制劑，能和 AdoMet 競 爭 ( 圖 7A) 。 同 樣 的 實 驗 ， 也 以 10 µl 的 1.2 µM
L-[methyl-3H]methionine (0.1 mCi/ml) 代替 10 µl 的 10 mM 非放射性L-Met 重 複驗證 (圖 7B)，如此則能利用放射性同位素標定甲基的 L-Met，追蹤其甲基
在 COMT 偶合酵素法測定 MAT 酵素活性過程中的流向。
在COMT 偶合方法當中，當使用 L-[methyl-3H]methionine 作為 MAT 受質 時，其步驟如 Method II 所描述。但是當反應結束後，改以 300 µl 的 n-hexane:ethyl acetate (7:3, v/v) 進行萃取，100 µl 的上層有機溶液轉移到 5-ml
的計數瓶，加入 3 ml 的閃爍計數液，混合後進行放射性強度的檢測。Scopoletin 的生成量，以放射性強弱表示。
在 COMT 偶合酵素之螢光分析法中，空白實驗酵素反應液沒有加入額外
的 ATP 時 (圖 7A(1)) 有微量的 scopoletin 被檢測到。這可能來自於細胞抽取 液中微量的AdoMet、ATP 以及部分存在於 esculetin 之雜質。當酵素反應液中 沒有加入esculetin 時，則也沒有任何 scopoletin 被檢測到 (圖 7A(3))。另外，
當 100 µM AdoHcy 加入酵素反應液中，scopoletin 的生成跟控制組比較，明 顯地被阻斷 (圖 7A(4))。這些結果顯示，scopoletin 的生成，完全同時依賴於 MAT 和 COMT 的 活 性 。 同 樣 的 結 果 也 可 在 使 用 radioactive
L-[methyl-3H]methionine 當作 MAT 受質之實驗觀察到 (圖 7B)。因此 COMT 偶合酵素檢測MAT 酵素活性的機轉可以得到進一部的確認。
圖 7. Confirmation of the mechanism of the COMT-coupled reaction in MAT activity determination. The different conditions for each reaction were (1) blank, lacking in ATP, (2) control, MAT activity measured in (A) and (B) was 122 units/mg protein and 0.74 units/mg protein, respectively, (3) lacking in esculetin and (4) in the presence of 100 µM AdoHcy. (A) HPLC chromatograms with fluorometric detection. A 10-µl aliquot of 10 µM L-Met was used as substrate, and the procedure was described in Method II. Inset shows the retention time of 2 pmol of scopoletin was 2.95 min and 20 pmol of esculetin strongly retained in Si 60 column over 30 min. (B) The same experiments were repeated, but a 10-µl aliquot of 1.2 µM
L-[methyl-3H]methionine (0.1 mCi/ml) was used instead. The other conditions were the same as Method II, but after the reaction was terminated and the reaction mixture was extracted with 300 µl of n-hexane:ethyl acetate (7:3, v/v), 100 µl of upper organic layer was used to count radioactive intensity. Other details are described in the text. Values are represented as mean ± S.D. of three experiments. Significant differences were calculated using Student's unpaired t-test. *** P < 0.001 compared to (2).
Effect of MGBG on the Determination of MAT Activity in Method I and Method II 在過去許多研究測定MAT 酵素活性時，使用的傳統分析方法中 ，AdoMet decarboxylase 抑 制 劑 都 沒 有 被 加 入 到 酵 素 反 應 液 裡 。 然 而 AdoMet decarboxylase 勢必存在細胞抽取液當中，而且可能會減少 MAT 活性測定時所 能檢測得到的 AdoMet 之量。所以 MGBG 在這個研究裡，被使用來阻斷 AdoMet decarboxylase 之活性。為了探討 MGBG 對 COMT 偶合酵素法檢測 MAT 酵素活性時之影響，同樣利用 10 µl 的 1.2 µM L-[methyl-3H]methionine (0.1 mCi/ml) 當作 MAT 受質，並分別使用 Method I 以及 Method II 進行分析 比較 (圖 8)。其結果顯示 100 µM 的 MGBG 存在於酵素反應液中時，能有效 阻斷AdoMet decarboxylase 之活性，而使 COMT 偶合酵素的方法達到檢測的 最大值。同樣的反應條件下，Method II 檢測到的值似乎比 Method I 還要高一 些，這表示Method I 在清洗 P-81 試紙過程中，難免有 AdoMet 流失掉，這個 實驗也同時看得出，COMT 偶合酵素能夠有效轉換非常微量的 AdoMet。此 外，兩種方法都顯示，在100 µM 的 MGBG 存在時，所測得之 MAT 酵素活 性，大約是沒有MGBG 時所測得之兩倍。 很明顯地，在過去的研究方法中，
如果使用了沒有純化的酵素溶液，又沒有阻斷 AdoMet 之 decarboxylation，將 造成很大的誤差。因此，從細胞抽取液中測定MAT 酵素活性時，使用 MGBG 是不可或缺的。
圖 8. The effect of MGBG on the results of COMT-coupled method (Method II) and traditional method (Method I). A 10-µl aliquot of 1.2 µM L-[methyl-3H]methionine (0.1 mCi/ml) was used as substrate for both methods, and the radioactivity of 3H-AdoMet or
3H-scopoletin was measured. Values are represented as mean ± S.D. of three experiments.
Effect of COMT Concentration and Time-Course of Scopoletin Formation
這裡針對COMT 使用量以及 scopoletin 生成之 time-course (10-60 min)進 行探討。圖 9 表示 Method II 中使用 50 units 的 COMT 是足量的。Scopoletin 生成之 time-course 顯示 COMT 偶合酵素法中，30-min 的反應時間介於良好 的線性範圍之內 (圖 10)。這些結果顯示，不論是 substrate depletion (L-Met, ATP or esculetin) 或者是 product accumulation (AdoMet or AdoHcy) 在 Method II 條件之分析過程中，都不會造成反應速率的限制與干擾。
圖 9. The effect of the quantity of COMT on scopoletin formation.
圖 10. Time-course of scopoletin formation. (R2 = 0.9933).
Validation of the Conversion Efficiency of COMT-coupled Method
Method II 所描述的檢測條件裡，COMT 偶合酵素轉換 AdoMet 的效能以 及 50 units 之 COMT 在 30-min 內所能轉換 (S,S)-AdoMet 量的限制範圍也被 研究探討。由於只有 (S,S)-AdoMet epimer 具有生理功能而當作甲基轉移酵素 的受質，因此，要進行確效前，必須先對標準品 AdoMet 進行 (S,S)-AdoMet 定量，方法是依據 L.K. Revelle 所描述之方法，使用 NMR 定量 [116]。結果 顯示，50 units 的 COMT 至少能夠依線性地有效轉換 50 到 500 pmol 範圍內 的 (S,S)-AdoMet，其 conversion coefficient 為 101 ± 5.6% (圖 11)。
圖 11. Validation of the conversion efficiency of COMT-coupled method. The conversion efficiency and the quantity limit of (S,S)-AdoMet were investigated with 50 units of COMT in 30 min. The converting ability of 50 units COMT is linear from 50 to at least 500 pmol of (S,S)-AdoMet with the conversion coefficient of 101 ± 5.6%.
Determination of MAT Activity
MAT 活性之測定，是在理想條件下，以檢測到之 scopoletin 的量進行計算。
已知量的 scopoletin 使用 HPLC 分析得到檢量線，其檢測極小值約為 100 fmol，而且 scopoletin 之螢光強度與其濃度呈現良好的線性關係 (圖 12)。
Activity and Kinetic Properties of MAT in HL-60 Cells
依據本研究所設定的COMT 偶合酵素之反應條件，對細胞抽取液中蛋白
質含量以及 MAT 酵素活性測定值之線性關係進行研究，圖 13 顯示， 0.5 到 7.5 µg 的細胞抽取蛋白量和所測得之 MAT 酵素催化速率呈現良好的線性關 係，而本研究使用的蛋白質量介於良好線性範圍之內。
圖 12. Scopoletin 檢量線。
圖 13. Linear correlation between enzyme activity and the amount of MAT.
接者，利用本研究建立的 COMT 偶合酵素螢光分析法，針對 HL-60 之 MAT 活性以及酵素動力學特性進行研究。結果所得之酵素動力學數據使用 Eadie-Hofstee plots 作圖表示，並且使用 Hill equation 進行回歸分析(v = 135.4s0.5/(6.10.5 + s0.5); v: units/mg protein, s: µM of L-Met) (圖 14)。這些結果顯 示，HL-60 細胞內所含之 MAT 酵素呈現了 negative cooperativity，其 Hill coefficient 為 0.5，這個結果和先前的 MAT II isozyme 的動力學研究相類似 [24]。在 200 µM 的L-Met 存在下，MAT 達到反應速率的最大值。計算所得之 Vmax 為 135.4 ± 1.5 units/mg protein，和其他正常組織比較起來，高出了許多 (erythrocytes 約 13.9×10-3 units/mg protein；parietal cortex 約 25.72 units/mg protein) [108, 110]。而計算所得之 Km 為 6.1 ± 0.3 µM ，這個數據則和先前研 究 human leukemia cells (3.5-20 µM) 的數據相似 [27]。綜合以上所述，HL-60 細胞中的MAT，呈現明顯的 negative cooperativity 以及特別高的酵素活性，都 可能表示有異常的 MAT 酵素的表現，或者有其他型式的 MAT 存在於 HL-60 細胞中。
圖 14. Eadie-Hofstee plots of kinetic properties of MAT in HL-60 cells. MAT activity was assayed by COMT-coupled fluorometric method. The concentration of ATP was fixed at 2 mM and L-Met was varied from 1.6 to 1,000 µM. The data were analyzed by SigmaPlot software with Enzyme Kinetics Module. The Eadie-Hofstee plots and Hill equation were used for kinetic analyses.