MAT 活性分析方法

Method I: Traditional Radioactive Method

測定 MAT 酵素活性之放射性同位素檢測法原則上採用先前的研究方法

[114]。簡單來說，酵素反應液中包含了 10 µl 酵素抽取液 (2.5 µg of protein)、

20 µl 的酸鹼緩衝液 (500 mM PIPES, pH 7.0; 750 mM KCl; 25 mM MgCl₂ and 25 mM DTT)、10 µl 的 20 mM ATP、50 µl 的去離子水，以及 10 µl 的 1.2 µΜ L-[methyl-³H]methionine (0.1 mCi/ml) ，最後反應液總體積為 100 µl。空白 試驗則是以不包含 ATP 時之檢測值作為參考值。酵素反應液於 37°C 下反應 30 分鐘，然後移至冰浴中，以 10 µl 之 4 N HClO₄終止酵素反應。經過離心

後 (3,000 g, 1 min)，90 µl 的上清液被吸取出來轉移到 P-81 陽離子交換層析 試紙上 (1×1 inch)。然後 P-81 陽離子交換層析試紙使用 100 ml 之 10 mM KH₂PO₄ 清洗十次，以去除含有放射性的受質 (L-Met)。乾燥後，P-81 試紙置 於 5-ml counting vial，同時以 150 µl 的 2 M KCl 將 ³H-AdoMet 從試紙上沖洗 出來，加入3 ml 的閃爍計數液，利用

β

Method II: COMT-coupled Method

大致上來說，Method II 的酵素反應條件與 Method I 方法相同，不過不使 用放射性物質，而是使用偶合酵素的方式進行。要配製成酵素反應液100 µl，

首先加入10 µl 酵素抽取液 (2.5 µg of protein)，20 µl 的酸鹼緩衝液 (500 mM PIPES, pH 7.0; 750 mM KCl; 25 mM MgCl2 and 25 mM DTT) 以及 20 µl 去離 子水， 並加入 10 µl 的 1 mM Methylglyoxal bis-(guanylhydrazone) (MGBG) 水 溶液，用以防止AdoMet 發生 decarboxylation 反應。接者，為了檢測 AdoMet 之生成，需加入10 µl 的 50 units COMT 酵素溶液 (50 mM Tris-acetate; pH 7.0, and 1.5 mM MgCl2; 使用前保存在-80°C)，以及 10 µl 溶於 isopropanol:water (1:1, v/v) 之 10 mM esculetin。最後，10 µl 的 20 mM ATP 以及 10 µl 的 10 mM

L-Met 加入酵素反應液中。空白試驗則是以不包含 ATP 時之檢測值作為參考 值。酵素反應液經由Vortex mixer 混合並稍微離心後 (300 g for 1 min)，在 37°C 下反應30 min，移至冰浴中，加入 100 µl boric acid 飽和溶液終止酵素反應。

Boric acid 同時也用於和 esculetin 的 catechol 部位反應形成水溶性鹽類。然後 使用300 µl 的 n-hexane:ethyl acetate (7:3, v/v) 萃取所生成之 scopoletin。 接著 混合液經過Vortex 混合 1 min，經過離心 (1,500 g for 2 min) 使之分層，從上 層有機溶媒層取出 40 µl 用於 HPLC 分析，並定量所生成之 scopoletin。

Calibration Curve for Method II

使用 HPLC 進行分析已知量的 scopoletin，用以製作檢量線，酵素反應在 理想條件下所測得 scopoletin 的量，可代表 AdoMet 之生成量。同時所測得的 scopoletin 定量時，以其回收率進行校正。MAT 酵素活性之表示，使用 units/mg protein，其中 1 unit 的蛋白定義為 1 小時內可生成 1 nmol AdoMet。

Kinetic Properties of MAT in HL-60 Cells

MAT 酵素動力學則使用了所建立的 COMT 偶合螢光檢測液相層析法進行 研究。MAT 受質^L-Met 濃度範圍從 1.6 到 1,000 µM，而 ATP 則固定在 2 mM。

所得到的數據以SigmaPlot 軟體之 Enzyme Kinetics Module (SPSS Science Inc.) 進行分析。MAT 動力學之作圖使用 Eadie-Hofstee plots，並且使用 Hill equation 進行回歸，以求得動力學參數。

HPLC System

HPLC 系統使用 HP 1050 Series 之 HPLC Modules，配接 Merck Lichrocart 125-4 Lichrospher Si 60 (5 µm) 分析型管柱，層析結果則以 HP 1046A Programmable Fluorescence Detector (ex 347, em 415) 和 HP 3394A integrator 進 行檢測和記錄。移動相是dichloromethane : methanol : acetic acid (40:1:0.06,

v/v/v) 之混合溶液，流速為 1 ml/min。經過系列分析使用後，HPLC 系統則使 用 ethyl acetate : methanol : acetic acid (40:1:0.06, v/v/v) 清洗 1 小時。

Assay of Protein

利用Bradford 方法 [109]，由 bovine serum albumin (BSA) 做標準蛋白溶 液及Bio-Rad 蛋白質 assay kit 當反應之染料。配置各個已知濃度之標準液，以 分光光度計 (spectrophotometer)，設定波長 595 nm，檢測其吸光度，做成檢量 線，再標定欲測定之酵素製劑。