過去 AdoMet 與 MAT 活性之檢測方法

methionine，接著偵測剩餘的放射線量，若需要定量則可以 L-[methyl-³H]

methionine 做檢量線定量之。

HPLC 分析法方面，已有不少測定 AdoMet 的方法被建立 [84-92]，都是

用以測定組織細胞中 AdoMet 的含量，由於從組織來的細胞數目夠多，通常

UV 偵測器的感度已經足夠。但是如果要將其應用於酵素活性分析，尤其是細 胞來源有限的culture system cells 之酵素活性分析，或者如血漿中 AdoMet 濃 度低的檢品，這些方法感度都不夠，而且需用到大量檢品，及繁瑣或耗時的 分析程序。其中代表性的方法如1992 年 Jennifer 等人 [84] 及 1997 年 Carolyn 等人 [85] 所發表，螢光法則由 1998 年 Capdevila 等人 [86] 所提出，還有本 所先前的研究使用 BIACORE 檢測 MAT 與小分子親和力的方法 [112]。這些 方法簡述如下：

1. 1992 年 Jennifer 等人之方法：

Solid-phase extraction 前處理

⇓檢品置陽離子交換樹脂 (cation-exchange resin)

⇓以甲醇沖洗

⇓以 0.05 M potassium dihydrogen phosphate buffer (pH 2.0) 沖洗

⇓以 0.05 M disodium hydrogen phosphate buffer (pH 11.0) 洗出 AdoMet

HPLC analysis

Column： C18 reversed-phase analytical column (100 mm × 4.6 mm) Mobile phase： 0.05 M potassium dihydrogen phosphate buffer (pH 5.7)

Flow rate： 1.2 ml/min UV Detector： 254 nm Analysis time： 8 min

此方法用cation-exchange resin 做前處理，目的在先除去大量雜質，然而 UV 檢測器感度不夠，若要應用到酵素分析上，檢品、試劑用量以及反應時間 均需要大幅度增加。 如果酵素來源是培養的細胞，很難供應大量的酵素蛋 白，而且AdoMet 不安定，延長反應以及處理的時間會損失更多的 AdoMet。

2. 1997 年 Carolyn 等人之方法：

⇓於 0.1 M sodium acetate buffer (pH 6.0) 打破細胞

⇓trichloroacetic acid 沉澱蛋白質

⇓離心：25,000g，10 min，5°C

Mobile phase： 50 mM NaH2PO4 (pH 4.38)，10 mM Sodium heptanesulfonate，

20% methanol Flow rate： 0.9 ml/min

UV Detector： 254 nm Analysis time： 20 min

這個方法若應用於MAT 酵素活性分析是有困難的，同樣有感度不夠的問

題，而且酵素反應時添加了許多高濃度物質會干擾AdoMet 的分析，ion pair reagent 在使用上則較不易控制，試劑配製需更加精準，HPLC 平衡時間需較 長，column 溫度影響也較大。

3. 1998 年 Capdevila 等人之方法

檢品先經過HPLC，以 C-8 column 初步分離後，再利用 AdoMet 的 amino group 與 naphthalenedialdehyde 及 cyanide 於 pH 9.0 反應 10 分鐘，形成 isoindole 類螢光化合物 (圖 6)，接著用 HPLC 以 C-18 column 及螢光檢測器進行分析。

這個方法為螢光分析法，感度較高，測得血漿中 AdoMet 的濃度為 102.7 nM，

然而過程繁瑣是其缺點，而且所使用之試劑毒性較大。

CHO

CHO

+ RNH₂ CN

-N CN

R

圖 6. AdoMet 之 isoindole 類螢光化合物形成原理。1998 年 Capdevila 以 naphthalenedialdehyde 及 cyanide 於 pH 9.0 反應 10 分鐘進行衍生。

4. BIACORE - Biomolecular Interaction Analysis

BIACORE 是應用表面薄膜共振技術 (surface plasmon resonance, SPR)，

去分析生物分子間的相互作用，包括結合與解離的情形，雖然並不是真正的 在檢測 MAT 酵素活性，不過卻也是一種 MAT 與受質，或者與抑制劑之結合 親和力的探討方式。本所先前的研究中，也利用此設備與技術，探討了合成 之 hemoregulatory peptide (HP) 系列衍生物對 MAT 酵素之結合作用[112]。表 面薄膜共振技術是一種光學現象，先將分子鍵結到晶片上面，當另一種分子 加入移動溶液，流經過晶片時，會因結合與未結合呈現不同的訊號，因而能 夠很快速的初步了解，兩分子之間是否可能有結合作用力。

在酵素活性的測定方法中，酵素偶合 (enzyme-coupled) 法是在進行酵素 反應時，另外加入一個以上的酵素，將欲檢測酵素之產物轉變成較安定，或 者感度較高，或者較易分離的化合物，再進行分析，是一種間接的分析方法，

亦曾應用於一些酵素的活性分析 [93-102]。

本研究開發了一個新的酵素偶合螢光分析方法，並應用HPLC 作為定性

定量的工具。我們利用catechol-O-methyltransferase (COMT) 以及已知的 COMT 螢光受質 esculetin (ECL) [103-106] 來分析 MAT 活性與動力學常數測 定。反應中 MAT 產生的 AdoMet 會被 COMT 轉移甲基給 ECL，接著經 HPLC 分析被甲基化的螢光物質scopoletin (SPL)，進而評估 AdoMet 的產量及 MAT 的活性 (Scheme 1)。這個方法的評估及其可行性、優缺點將於本文陳述討論。

Scheme 1. Stepwise representation of the COMT-coupled fluorometric assay of MAT activity. The methyl group of AdoMet was transferred to esculetin by coupling with COMT and the formation of scopoletin was measured by HPLC fluorometric analysis.

MGBG was used to prevent AdoMet from decarboxylation.