第二章 材料與方法
第五節 總酚含量測定試驗方法
本總酚含量測定試驗方法應用於本研究中各萃取物、各分配萃取層及 分離後各分層之總酚含量測定抗氧化能力評估。
一. 儀器設備：
1. 天平：Sartorius®, CPA225D
2. 震盪器：HIPOINT®, M02090002 3. 超音波震盪器：ELMA®, D-7700 4. Micropipet：Eppendorf research® 5. 96 孔盤：Nunc®, 269620
6. 酵素免疫分析自動判讀機：BioTek®, 239531 二. 藥品及其配製：
1. 實驗藥品：
(1) 2 N Folin-Ciocalteu reagent (Sigma, USA)
(2) Sodium carbonate, anhydrous (Na2CO3；MW 105.99；和光純藥工業 株式會社)
(3) Gallic acid (MW 170.12; Sigma, USA) 2. 藥品配製方法：
(1) 0.5 Folin-Ciocalteu reagent：取 2 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL，
加入去離子水 1.5 mL 混合均勻。
(2) 20 % Na2CO3：秤取 3 mg Na2CO3 加入去離子水 15 mL，溶解，
混勻。
(3) 1 mg/mL Gallic acid 貯存溶液：秤取 5 mg Gallic acid 加入 5 mL 去 離子水，溶解，混勻。
3. 樣品試驗溶液配製：
分別精秤各樣品各 1 mg，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例 之混合溶液 1 mL 分別溶解，使各樣品濃度皆為 1 mg/mL 作為各樣品 貯存溶液。再由各樣品貯存溶液以去離子水稀釋為 100 μg/mL 樣品 試驗溶液。
三. 總酚含量測定試驗之實驗步驟：
本試驗分為 Gallic acid 對照標準品檢量線溶液及樣品試驗溶液配製：
1. Gallic acid 對照標準品檢量線溶液配製：
檢量線的部分，取 1 mg/mL Gallic acid 貯存溶液 300 μL 於試管中，
並加入去離子水 2700 μL 混勻，配製成 100 μg/mL Gallic acid 溶液。
再經由去離子水配製為 20、40、60、80 與 100 μg/mL Gallic acid 溶液，
以 H2O 作為 0 μg/mL Gallic acid 溶液，共 6 個不同的濃度作為 Gallic acid 對照標準品檢量線。
再分別取50 μL 的 Gallic acid 上述六種不同濃度溶液於 96 孔盤中，
各加入 50 μL 0.5 Folin-Ciocalteu reagent 與 100 μL 20 %Na2CO3混合均 勻，使最終濃度為 0、5、10、15、20 與 25 μg/mL 等六個不同濃度。
2. 樣品試驗溶液配製：
樣品的部分，秤取 1 mg 待測物加入，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例之混合溶液 1 mL 分別溶解，以超音波震盪溶解均勻，使其 濃度為 1 mg/mL，再取此濃度 100 μL 加入 900 μL 去離子水稀釋，使
其濃度為 100 μg/mL ，再取 50 μL 的 100 μg/mL 樣品試驗溶液於 96 孔盤中。樣品試驗溶液中加入 50 μL 0.5 Folin-Ciocalteu reagent 與 100 μL 20 %Na2CO3混合均勻，樣品濃度為 25 μg/mL。將以上試驗重複 3 次。
使用 ELISA reader 讀取波長 750 nm 之吸光值，以標準品 Gallic acid 各濃度所測得之吸光值為 y 軸及標準品之各不同濃度為 x 軸，繪 圖製作 Gallic acid 檢量線，並求得 Gallic acid 檢量線之線性迴歸方程 式 (y= ax+b) 及其相關係數 (R2)，將各試驗樣品所測得吸光值，以內 插法計算，求出各樣品相對於 Gallic acid 當量濃度 (Gallic acid equivalent, GAE)，再以此相對濃度回算每克樣品相當於多少毫克的 Gallic acid 以 mg of GAE/g 表示。
毛茄根、莖、葉及果實四個部位之水及 95 %乙醇萃取物經由 DPPH 自由基清除能力試驗，Trolox 當量抗氧化能力試驗及總酚含量 測定試驗篩選後，篩選出毛茄葉部的 95 %乙醇萃取物具有最佳的抗 氧化能力。因此進行毛茄葉部大量的 95 %乙醇萃取及分離，其萃取 及分離方法於本章第六節所敘述。在每個分離階段利用所建立的 DPPH 自由基清除能力試驗，Trolox 當量抗氧化能力試驗及總酚含量 測定試驗之平台作為篩選，並選擇具有較佳的抗氧化能力之分層進 行更進一步之分離純化，企圖分離出抗氧化活性成分。