嘉南藥理科技大學 藥物科技研究所
碩士論文
毛茄葉部之抗氧化成分研究
Studies on the antioxidative constituents from the leaves of Solanum lasiocarpum
指導教授：黃秀琴 博士 研 究 生：林煜書
中華民國一百零一年七月三十一日
嘉南藥理科技大學藥物科技研究所
Department of Institute of Pharmaceutical Science Chia-Nan University of Pharmacy and Science
碩士論文
Thesis for the Degree of Master
毛茄之抗氧化成分研究
Studies on the antioxidative constituents from the leaves of Solanum lasiocarpum
指導教授：黃 秀 琴 博士（Dr. Shiow-Chyn Huang）
研 究 生：林 煜 書（Yu-Shu Lin）
中華民國一百零一年七月三十一日 31, July 2012
中文摘要
毛茄 ( Solanum lasiocarpum Dunal, SL ) 在台灣民間是用來治療咳嗽、
咽喉痛、水腫、跌打損傷及疝氣，其植物組織顯微鑑定，目前尚未曾有文 獻報告，故本研究的目的是究針對毛茄根、鬚根、莖及葉，利用組織切片，
建立其顯微組織鑑定圖譜，並利用 DPPH 自由基清除能力試驗、Trolox 當 量抗氧化能力試驗和總酚含量測定試驗等三個篩選平台，以活性目標分離 方式進行分離毛茄之抗氧化活性成分。在台灣採集毛茄，分為根、莖、葉 和果實四個部分，分別以水及 95 %乙醇進行萃取，得到水及 95 %乙醇共八 個萃取物。將此八個萃取物分別經由 DPPH 自由基清除能力試驗、Trolox 當量抗氧化能力試驗和總酚含量測定試驗，結果顯示，毛茄葉部 95 %乙醇 萃取物的抗氧化能力最佳。因此，再以 95 %乙醇進行毛茄葉部之大量 (540.38 g) 萃取，得到 SLLE 萃取物，將 116.53 g SLLE 以水、二氯甲烷、
乙酸乙酯及正丁醇等溶媒做分配萃取，分別得到二氯甲烷層萃取物
(SLLED)、不溶物萃取物 (SLLEI)、乙酸乙酯層萃取物 (SLLEA)、乳化層萃 取物 (SLLEE)、正丁醇層萃取物 (SLLEB) 及水層萃取物 (SLLEW) 六層萃 取物。將這六層分配萃取物進行抗氧化能力試驗，結果顯示，SLLEA 萃取 層具有最佳抗氧化能力。SLLEA 萃取層再經由矽膠管柱層析及薄層層析分 離及抗氧化能力試驗，結果顯示，SLLEA2-2 及 SLLEA2-3 具有最佳抗氧化 能力。SLLEA2-3 經由層析分離得到 Paprazine 活性成分。SLLEA2-2 活性成
分有待進一步探討。本研究也分離得到一個硫酸鐵及硫酸銅之塩類混合 物。
關鍵字：毛茄、抗氧化活性、成分分離、DPPH 自由基清除能力試驗、Trolox 當量抗氧化能力試驗、總酚含量試驗、Paprazine。
Abstract
Solanum lasiocarpum Dunal (SL, Solanaceae) has been used as a folk
medicine in Taiwan to treat cough, sore throat, edema, bruises, and hernia. There is no report about the microscopic tissues identification and pharmacological activities of the SL. The aim of this study was focused on the roots, stems and leaves to establish the microscopic tissues identification spectrum and isolate the antioxidative constituents from SL according to the activity-guided isolation process. DPPH radical scavenging ability, Trolox equivalent antioxidant capacity and total phenol contents were applied as screening platforms of antioxidation. The SL was collected in Taiwan and divided into four parts, including roots, stems, leaves and fruit. Four parts of SL were respectively extracted with H2O and 95 % EtOH to obtain total eight crude extracts of SL.
Eight crude extracts were evaluated by screening platforms of antioxidation, and the results showed that the most potent antioxidative extract was 95 %EtOH extract of leaves of SL (SLLE). A large amount (1.1 Kg) of leaves of SL was extracted with 95 % EtOH and obtained 116.53 g of SLLE extract. The SLLE was partitioned with H2O, CH2Cl2, EtOAc, and n-BuOH solvents to obtain six extracts, including CH2Cl2 layer extract (SLLED), Insoluble layer extract (SLLEI), EtOAc layer extract (SLLEA), Emulsion layer extract (SLLEE),
n-BuOH layer extract (SLLEB) and H2O layer extract (SLLEW), respectively.
The six layer extracts were evaluated by screening platforms of antioxidation, and the results showed that the most potent antioxidative layer extract was SLLEA. We selected SLLEA to isolate the antioxidative constituents with chromatography and screening platforms of antioxidation methods. SLLEA extract was isolated by silica gel column chromatography and TLC. The results showed that the most potent antioxidative fraction was SLLEA2-2 and SLLEA2-3. Paprazine was identified from SLLEA2-3. The active constituents of SLLEA2-2 will further be isolated and identified their structures. We also obtained a mixture of salt of Iron (II) and Cupric sulfate.
Key words: Solanum lasiocarpum, antioxidative activity, isolation of constitutents, DPPH radicals scavenging activity, Trolox equivalent antioxidant capacity, total phenol content, Paprazine.
謝誌
回首這二年求學的過程，感謝指導教授黃秀琴老師悉心指導與鼓勵，
使學生能順利進行實驗，以及藥物科技研究所的諸位老師平常對學生的關 心及鼓勵，使我了累積許多專業知識及增長了自信。
研究期間，幸得本校林榮貴老師植物組織切片之技術指導，李美貴老 師分析塩類組成，使本論文研究之實驗能夠順利完成，特致謝意。另外在 求學期間，感謝雅萱學姐及耀霖學長於實驗期間，不厭其煩的教導實驗上 的知識與技巧，使我獲益良多，實驗方能順利進行，也要感謝生技中心提 供儀器，讓我能順利完成實驗，還要感謝班上的同學於我求學期間緊要關 頭的熱心幫忙及鼓勵。
同時，感謝口試委員中山醫學大學詹明修老師及本校藥物科技研究所 郭榮華老師，對本論文的指導，讓我能即時的修正錯誤，並提供許多寶貴 的意見與看法，使本論文更臻完善。
最後要感謝我最親愛的家人，特別是我的爸媽給予精神方面的支持與 鼓勵，讓我無後顧之憂的完成學業。謹將此論文獻給我敬愛家人及關心愛 護我的朋友一起分享。
目錄
中文摘要 ... I Abstract ... III 謝誌 ... V 目錄 ... VI 圖目錄 ... VIII 表目錄 ... X
第一章 緒論 ... 1
第一節 自由基 ... 1
第二節 抗氧化防禦系統 (Antioxidant defense system) 與抗氧化物質 .... 3
第三節 毛茄的文獻回顧 ... 8
第四節 研究動機與目的 ... 11
第二章 材料與方法 ... 12
第一節 毛茄 (SL) 根、鬚根、莖及葉部之切片鏡檢 ... 12
第二節 毛茄 (SL) 根、莖、葉及果實四個部位之 H2O 與 95 %乙醇萃取 ... 17
第三節 DPPH 自由基清除能力試驗方法 ... 18
第五節 總酚含量測定試驗方法 ... 24
第六節 毛茄葉部大量萃取及分離 ... 28
第三章 結果與討論 ... 32
第一節 毛茄根、鬚根、莖及葉之切片鏡檢結果 ... 32
第二節 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取百分率之結果 ... 37
第三節 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取之抗氧化能力 試驗結果 ... 37
第四節 毛茄葉部各分配萃取層萃取物之抗氧化能力試驗結果 ... 45
第五節 SLLEA1~5 之五個分層於抗氧化能力試驗結果 ... 51
第六節 SLLEA2-1~SLLEA2-6 之六個分層之抗氧化能力試驗結果 ... 57
第七節 (1) 及 (2) 化合物之構造鑑定 ... 64
第四章 結論 ... 68
第五章 參考文獻 ... 70
圖目錄
圖 1-1 人體內抗氧化物質作用流程 ... 5
圖 1-2 毛茄外觀型態圖... 7
圖 1-3 DPPH 氧化型/還原型之化學結構圖 ... 9
圖 1-4 ABTS 氧化型/還原型之化學結構圖 ... 10
圖 2-1 毛茄葉部 95 %乙醇萃取物之分離及純化流程圖 ... 31
圖 3-1 毛茄根部橫切圖... 33
圖 3-2 毛茄莖部橫切圖... 34
圖 3-3 毛茄葉部橫切圖... 35
圖 3-4 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取物對 DPPH 自由 基清除能力試驗結果圖 ... 38
圖 3-5 Trolox 標準品檢量線曲線圖 ... 41
圖 3-7 Gallic acid 標準品檢量線曲線圖 ... 43
圖 3-8 毛茄葉部各分配萃取物對 DPPH 自由基清除能力試驗結果圖 ... 46
圖 3-9 Trolox 標準品檢量線曲線圖 ... 48
圖 3-10 毛茄葉部各分配萃取物對 Trolox 當量抗氧化能力試驗結果圖 ... 49
圖 3-11 Gallic acid 標準品檢量線曲線圖 ... 50
圖 3-12 SLLEA1~5 之五個分層對 DPPH 自由基清除能力試驗結果圖 ... 52
圖 3-13 Gallic acid 標準品檢量線曲線圖 ... 54
圖 3-14 SLLEA1~5 之五個分層對 Trolox 當量抗氧化能力試驗結果圖 ... 55
圖 3-15 Gallic acid 標準品檢量線曲線圖 ... 56
圖 3-16 SLLEA2-1~SLLEA2-6 之六個分層對 DPPH 自由基清除能力試驗結 果圖 ... 59
圖 3-17 Trolox 標準品檢量線曲線圖 ... 61
圖 3-18 SLLEA2-1~SLLEA2-6 之六個分層對 Trolox 當量抗氧化能力試驗結 果圖 ... 61
圖 3-19 Gallic acid 標準品檢量線曲線圖 ... 63
圖 3-20 (2) 化合物紫外線光譜圖 ... 66
圖 3-21 (2) 化合物 FTIR 光譜圖 ... 66
圖 3-22 (2) 化合物 1H-NMR 光譜圖 ... 67
表目錄
表 1-1 活性氧族群 ... 2
表 2-1 植物標本脫水取代步驟 ... 14
表 2-2 細胞標本溶蠟及染色步驟 ... 16
表 3-1 生藥學術語之英文略字表 ... 36
表 3-2 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取率 ... 37
表 3-3 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水及 95 %乙醇萃取物之 DPPH 自由 基清除能力 IC50比較表 ... 39
表 3-4 毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇萃取物之 TEAC 試驗結果表 ... 42
表 3-5 毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇萃取物之總酚含 量結果表 ... 44
表 3-6 毛茄葉部各分配萃取層萃取物之 DPPH 自由基清除能力 IC50比較表 ... 47
表 3-7 毛茄葉部各分配萃取物之 TEAC 試驗結果表 ... 49
表 3-8 毛茄葉部各分配萃取層萃取物之總酚含量結果表 ... 51
表 3-9 SLLEA1~5 之五個分層之 DPPH 自由基清除能力 IC50比較表 ... 53
表 3-10 SLLEA1~5 之五個分層之 TEAC 試驗結果表 ... 55
表 3-11 SLLEA1~5 之五個分層之總酚含量結果表 ... 57
表 3-12 SLLEA2-1~SLLEA2-6 之六個分層之 DPPH 自由基清除能力 IC50比 較表 ... 59 表 3-13 SLLEA2-1~2-6 之六個分層之 TEAC 試驗結果表 ... 62 表 3-14 SLLEA1~5 之五個分層之總酚含量結果表 ... 63
第一章 緒論 第一節 自由基
近年來科技的發展，健康觀念的轉變以及老齡化社會的到來，除了健 康的飲食，尋求有效的保健食品來預防疾病發生，或尋找更具有療效的藥 物是當今熱門的主題。我們的身體 90 %以上的生理作用都需要氧氣的參與，
而這些反應的過程都會產生一些對人體有害的自由基 (Free radical)(1)。 自由基為一原子或分子的外層軌域擁有一個或多個未共用電子
(Unpaired electrons)，當分子具有一個單獨不配對的電子圍繞在分子最外層 的軌道上時，會呈現不穩定的狀態，具高反應性，因此自由基會急速地與 附近的分子起作用，大部分的自由基的生存時間均極其短暫，為了達到穩 定狀態，而搶奪其他分子上的電子，進而破壞其他分子。而被反應的分子，
則因為自由基的反應而失去電子，就變的不穩定，為了使自己的結構穩定，
會再與其他分子反應形成一連串的自由基鎖鏈式反應 (Free radical chain reaction)，直到兩自由基達一定數量時，彼此結合形成穩定狀態的物質來終 止反應。
自由基的產生，會經由接觸離子輻射、空氣汙染、紫外線照射、抽菸、
生理與心理的壓力及暴露於化學物質等(2)因素刺激，而導致體內自由基的增 加。生物體中主要的自由基種類分為自由基屬與非自由基屬，包含了超氧
陰離子自由基 (superoxide anion, O2‧-)、氫氧自由基 (hydroxyl radicals, OH‧)、
過氧化脂質自由基 (lipid hydroxide, LOO‧)、過氧自由基 (peroxyl radical, ROO‧)、過氧化氫 (hydrogen peroxide, H2O2) 及單重態氧 (single oxygen, 1O2) 等，這類含氧分子且容易產生化學反應的物質，我們稱之為活性氧族群 (reactive oxygen species, ROS)。
表 1-1 活性氧族群
活性氧族群 化學式 說明 超氧陰離子自由基 O2
‧-
在粒線體中或心血管系統中產生 氫氧自由基 OH‧ 從過氧化氫及超氧陰離子的作用或
從其它的電子及原子而來 過氧化脂質自由基 LOO‧
脂肪酸被氧化產生 過氧自由基 ROO‧
脂質、蛋白質、DNA 與醣類氧化形 成
一氧化氮 NO 人體中樞神經系統傳遞訊息的分子 過氧化氫 H2O2 SOD（superoxide dismutase）酵素能
將超氧陰離子轉變成生成過氧化氫 單重態氧 1O2 使未配對電子轉移至更高的電子軌
域，形成超氧陰離子或過氧化氫
人體內每天有各種不同的活性氧產生如表1-1，正常的生理反應都會產 生活性氧分子，如粒線體產生能量過程中會產生超氧陰離子自由基
(superoxide anion, O2‧-)。這些活性氧之所以有害，是因為它活潑的化學特性，
會和體內的組織產生化學反應，使細胞組織失去功能甚至破壞並加速細胞 老化及增加致癌機率。在活性氧不斷的反應之下，會導致DNA損傷、蛋白 質傷害及脂質與自由基反應之代謝物，造成細胞老化、突變甚至死亡(3)。並 非所有自由基都是有害的，例如一氧化氮 (NO)，他是人體自行產生，是一 極小的分子，可以將中樞神經系統傳遞到任何細胞；在免疫系統中，當病 菌外物入侵體內時，巨噬細胞就利用一氧化氮酶 (NOS) 產生並釋放大量 NO去做防禦工作，它可抑制細胞的代謝作用，使細菌無法成長，或與氧分 子起作用而形成氫氧自由基與二氧化氮 (NO2)，把細菌殺掉，但NO如果太 多，亦會對人體造成傷害(4)。
因此要防止這類的活性氧物質所造成的傷害，人體中即必須擁有足量 的抗氧化物質來預防與對抗這類活性氧反應所造成的傷害。
第二節 抗氧化防禦系統 (Antioxidant defense system) 與抗氧化物質 人體本身即擁有抗氧化防禦的系統，可以對抗ROS對於人體健康的破 壞。根據美國食品藥物檢驗局 (FDA) 的定義，「抗氧化劑」為延遲因氧化
所引起的劣變、酸敗和變色的物質。是一種低濃度就能有效抑制氧化速率
的物質(5,6)。其可以延長自氧化之起始期、抑制增殖期，但不能防止氧化作
用的產生(5)。依人體的抗氧化物質，可分為體內自行製造或由食物補充兩大 類，體內自行製造主要的抗氧化物及其作用如下：
(一) 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutases, SOD)(7)：此種重要的酵素同 時存在於細胞內和粒線體中，主要在清除超氧陰離子自由基 (O2‧-)，
轉化為活性較低的過氧化氫，產生的 H2O2 會被過氧化氫酶及麩胱 甘肽過氧化酶代謝為 H2O 如圖 1-1。
(二) 過氧化氫酶 (catalases, CAT)(6)：為存在於細胞膜內過氧化物酶體中 的含鐵酵素，在細胞內會催化H2O2分解成H2O及O2，其反應式為：
2 H2O2 →O2+ 2 H2O。如圖1-1。
(三) 還原型麩胱甘肽 (glutatione, GSH)(8)：GSH為GSPx 酵素的受體，在 與自由基反應的過程中，每兩個GSH從他們的-SH 基提供一個氫原 子出來，於是形成GS．的型態，而隨後兩個GS．則形成雙硫鍵的GSSG。
而如圖1-1。
(四) 麩胱甘肽過氧化酶 (glutathione peroxidases, GSPx)(5)：在體內負責清 除 H2O2，藉催化還原態 glutathione (GSH) 將 H2O2 還原成 H2O 如 圖 1-1。
(五) 麩胱甘肽還原酵素 (glutathione reductase, GRS)(9)：具還原已氧化的
GSH 作用如圖 1-1。
圖 1-1 人體內抗氧化物質作用流程
另一類須由膳食或藥物來補充的抗氧化物，這類抗氧化物質廣 泛存在於蔬菜、水果及穀類，有維生素C、β-胡蘿蔔素及維生素E。
(一) 維生素C (Vitamin C)(10)：
為水溶性維生素，一種活性氧清除劑與類黃酮合併使用能 強化彼此功能。由於維生素C與維生素E有相乘作用，故在高濃 度之維生素C前提下，僅需低濃度之維生素E即可提供良好之抗 氧化保護效果。
(二) β-胡蘿蔔素 (β-Carotene)(11)： O2
Mitochondria O2·- SOD
H2O
2
Catalases H2O
GSPx
H2O
2GSH
GRS GSSG
在脂質過氧化自由基反應過程中，因本身易形成β-carotene 陽離子自由基，可接受電子，可藉維生素E 或其他脂溶性物質所 提供的電子還原成β-carotene，並吸收活性氧的能量，故
β-carotene 可清除單重態氧。
(三) 維生素E (生育醇 Tocopherol)(10)：
在減少脂質過氧化上是一最有效的抗氧化物，也是生物膜及 脂蛋白上主要的脂溶性抗氧化物。可當作自由基清除者，以終止 引起連鎖反應。在血液中是經由脂蛋白輸送，防止脂蛋白受到氧 化傷害。
除上述抗氧化物之外，近年來多酚類 (Polyphenols) 為一熱門的研究題 材，因酚類化合物易釋出氫氧基上的氫原子，提供一個電子或直接提供一 個質子和自由基作用，而自身的苯環結構上的不成對電子會轉移形成穩定 的 共 振 結 構 。 大 部 分 的 研 究 發 表 ， 植 物 多 酚 類 化 合 物 如 類 黃 酮 (Flavonoids)(11)、兒茶素 (Catechins)(12) 與花青素 (Anthocyanosides)(13)等，
都具有抗氧化效果。因此，從天然藥用植物中找尋具有抗氧化活性成分作 為健康食品或是藥物開發之目標成分為最直接及最有效的方法。
本研究選擇台灣民間用於治療咳嗽、咽喉痛、水腫、跌打損傷及疝氣(14)
的毛茄，學名為 Solanum lasiocarpum Dunal. (Solanum ferox Linn.) 屬茄科植 物。別名羊不食、毛刺茄，為多年生草本，高約 1 公尺，具刺，密被星狀 毛。葉為單葉，近對生，具葉柄，柄長 3 ~ 6 公分；葉片長 10 ~ 20 公分，
寬 6 ~ 12 公分，卵形，葉基近心形，葉尖銳尖，葉緣為不規則鈍形波狀緣。
花序為短總狀花序，數朵簇生；花萼漏斗形，5 裂，裂片卵形，銳尖，兩面 密被星狀毛；花冠徑 2 ~ 3 公分，白色，深 5 裂，裂片披針形，外面密被星 狀毛，裡面光滑；雄蕊 5 枚，輳合，著生冠筒基部；花絲甚短，不明顯。
果實為漿果，密被星狀毛，成熟時黃色(15)。其外觀型態圖如圖 1-2 所示。
本研究利用埋蠟切片法，建立植物毛茄顯微組織鑑定圖譜，以提供將來研 究基源鑑定時之參考文獻，並藉由清除 DPPH 自由基能力試驗、Trolox 當 量抗氧化能力試驗及總酚含量測定試驗等三個篩選平台，以活性目標分離 方式 (Activity-guided isolation) 進行毛茄之抗氧化活性成分之分離純化及 構造鑑定，企圖分離出毛茄有效之抗氧化活性成分。
圖 1-2 毛茄外觀型態圖 (黃秀琴 老師提供)
第三節 毛茄的文獻回顧
一、毛茄的研究
毛茄全株具消炎、行氣、活血及止痛；民間是用來治療咳嗽、咽喉痛、
水腫、跌打損傷及疝氣(14)，而在印度則用來治療蛀牙(16)。目前文獻研究發 現，毛茄的種子含有硬脂酸、棕櫚酸、油酸及亞油酸(17)，且果實也發現含 有 Solanine(16,18)。Yang 等人對 127 種可食用植物中 (包含毛茄) 進行超氧陰 離子自由基清除能力測試及 Trolox 當量抗氧化能力試驗的抗氧化能力分析，
並從中挑選 5 個抗氧化能力最佳，進一步進行其他抗氧化試驗，結果顯示，
毛茄不是前 5 名抗氧化能力最佳之植物(19)，因此，未詳細敘述毛茄之相關 活性。對於毛茄之其他活性成分研究目前尚未有文獻報告，因此選擇毛茄 作為本篇論文之研究材料。
二、 抗氧化活性評估方法
本 研 究 選 用 毛 茄 ， 以 活 性 目 標 分 離 方 式 (Activity-guided isolation) 進行毛茄之抗氧化活性成分之分離純化及構造鑑定，所選 用之抗氧化活性評估方法有 DPPH 自由基清除能力試驗、Trolox 當 量的抗氧化能力 (TEAC 法) 及總酚含量測定試驗三種。DPPH 自由 基清除能力試驗為模擬脂質自氧化的過程中會產生自由基造成脂質 酸敗，實驗目的為觀察待測物對 DPPH 自由基之清除能力。Trolox
當量的抗氧化能力 (TEAC 法) 為模擬體內陽離子自由基，實驗目的 為觀察待測物對陽離子自由基之清除能力；總酚含量測定，可測量 物質中的黃酮素類、花青素類、酚酸類等，這些已被研究出具有抗 氧化能力之酚類物質。以下分別敘述此三種平台的試驗原理：
(一) DPPH 自由基清除能力試驗原理(20)：
DPPH 自由基可溶於甲醇或是乙醇溶液中，為一穩定的自由基其 結構如圖 1-3，DPPH 自由基溶液，在波長 517 nm 下，呈現藍紫色強 的吸光值。當一個抗氧化劑還原 DPPH 自由基時，會使得在 517 nm 之吸光值下降形成 DPPH2，此時顏色會變為黃色。當抗氧化劑的抗 氧化能力越強時，其吸光值就會越低，DPPH 自由基清除能力就越佳，
其反應如圖 1-3 所示。
圖 1-3 DPPH 氧化型/還原型之化學結構圖(21)
(二) Trolox 當量抗氧化試驗原理(22)：
Trolox 當量抗氧化試驗的抗氧化能力的評估是使用 ABTS˙+
﹝2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid 陽離子自由基﹞
的清除能力。當 ABTS 在 Horseradish peroxidase (HRP) 的催化下與 雙氧水 (H2O2) 反應，會形成穩定的藍綠色 ABTS˙+陽離子自由基溶 液，其反應如圖 1-4。當 ABTS˙+與擁有抗氧化能力的反應物結合後，
會使得吸光值降低，而測出來的吸光值越低，則代表著反應物清除 ABTS˙+的能力越佳，即代表著較佳的抗氧化能力效果，其反應如圖 1-4 所示。
圖 1-4 ABTS 氧化型/還原型之化學結構圖(21)
(三) 總酚含量測定試驗原理(23,24)：
測定方式是採用 Folin-Ciocalteu 法，以沒食子酸 (Gallic acid) 當 標準品進行測定。Folin-Ciocalteu 法中的福林酚試劑 (Folin-Ciocalteu reagent) 內含鎢酸鈉 Sodium tungstate (Na2WO4· 2H2O, 100 g) 與鉬 酸鈉 Sodium molybdate (Na2MoO4, 25 g) 的黃色溶液。酚類成分與
Folin-Ciocalteu 試劑反應時，必須在鹼性環境下才能進行反應，因 此加入碳酸鈉溶液使 pH 值位在鹼性。當 Folin-Ciocalteu 試劑被酚 還原成藍綠色的複合物，其在 750 nm 擁有較強的吸光值，當吸光值 越高，就代表著還原能力越佳，則酚的含量就越多。其反應式如下：
Mo (VI) + phenols → Mo (V)
第四節 研究動機與目的
台灣由於地形與氣候之共同影響，造成台灣有熱帶、亞熱帶、溫帶、
寒帶等氣候區，自然景觀與生態系亦因而豐富多樣。早期的名間偏方就常 用中草藥來治療疾病，但其機制及有效成分很多仍未被探討出。本研究所 使用的毛茄在台灣民間用於治療咳嗽、咽喉痛、水腫、跌打損傷及疝氣。
因此，本研究首先建立植物毛茄顯微組織鑑定圖譜，以提供將來研究基源 鑑定時之參考文獻。並參考毛茄民間用藥之用途，以科學方法探討其是否 含有具抗氧化功效之特殊成分，擬藉由清除 DPPH 自由基能力試驗、Trolox 當量抗氧化能力試驗及總酚含量測定試驗等三個篩選平台，以活性目標分 離方式 (Activity-guided isolation) 進行毛茄之抗氧化活性成分之分離純化 及構造鑑定，企圖分離毛茄有效之抗氧化活性成分。
第二章 材料與方法 第一節 毛茄 (SL) 根、鬚根、莖及葉部之切片鏡檢
一. 溶媒與試劑：
1. 甘油 (glycerin, C3H8O3 )：聯工化學製藥，Taiwan。
2. 石蠟塊 (paraffin )：Merck，Germany。
3. 巴爾森樹酯 (balsam, Entellan® )：Merck，Germany。
4. 福馬林 (frmalin, Formaldehyde, HCHO )：Riedel-de Haën，Germany。
5. Fast-green：Sigma，USA。
6. 番紅花素 (safranin )：Sigma，USA。
7. 95 %乙醇 (ethanol, C2H5OH )：友和貿易股份有限公司，Taiwan。
8. 99 %乙醇 (absolute ethanol, C2H5OH )：日本試藥工業株式會社，
Japan。
9. 醋酸 (acetic acid, CH3COOH )：Osaka 島久藥品株式會社，Japan。
10. 二甲苯 (xylene, C8H10 )：Sigma，USA。
11. 第三丁醇 (t-Butanol, C4H10O )：JT-Baker，USA。
二. 儀器設備：
1. 滾動式切片機：Accu-Cut® Srm-100, Japan 2. 植物標本滲蠟機：Sakura 4640, Japan
3. 植物標本染色機：Sakura drs-601-A, Japan 4. 光學顯微鏡：Olympus bx41, Japan
5. 顯微鏡攝影機：Olympus dp71, Japan 6. 加熱板：Sybron Nuova II Thermolyne, USA 7. 烘箱：Heraeus D6450 Hanau, Germany 三. 毛茄基源鑑定之實驗步驟
本研究所選用毛茄之植株，係由嘉南藥理科技大學藥學系林榮貴老師 採集鑑定後提供。
參考蔡淑華之組織切片方法(25)，將新鮮採集之毛茄作為材料，分別將 根、鬚根、莖及葉等部位以埋蠟切片法進行組織切片。
首先將毛茄根、鬚根、莖及葉等部位以刀子切成約 0.5 立方公分大小之 小塊，包埋於熔融的蠟塊中，連同蠟塊一起切片後，再去除石蠟，經染色 後封片。其詳細製片步驟如下:
1. 固定 (Fixation) :
將毛茄根、鬚根、莖及葉等部位以刀子切成約 0.5 x 0.5 x 0.5 cm3 大小，加入固定液 (Formalin 5 mL +Acetic acid 5 mL + 70 %EtOH 90 mL; FAA) 中浸置五個小時，再以 50 %乙醇洗去固定液。
2. 除氣 (Degas) :
將切成 0.5 立方公分大小之毛茄各部位材料放入固定液後，即刻
將各材料組織內之氣泡利用真空抽氣除去，使固定液能完全滲入植 物組織細胞中，使埋蠟或切片時，不至於在組織中形成空泡。
3. 洗滌 (Washing) :
移除固定液後，利用 50 %乙醇洗去固定液。
4. 脫水及滲蠟 (Dehydration and Infiltration of Paraffin) :
利用第三丁醇及 95 %乙醇與水之各種不同比例混合液如表 2-1，
材料逐步於 step1~7 混合液中，將組織內的水分逐漸取代為第三丁醇，
最後置於熔融的蠟中進行滲蠟。
表 2-1 植物標本脫水取代步驟
Step t-Butanol 95 %EtOH H2O Paraffin Time (hr) 1
2 3 4 5 6 7
10 mL 40 mL 50 mL 0 mL 1 20 mL 50 mL 30 mL 0 mL 1 35 mL 50 mL 15 mL 0 mL 1 55 mL 45 mL 0 mL 0 mL 1 75 mL 25 mL 0 mL 0 mL 1 100 mL 0 mL 0 mL 0 mL 1 0 mL 0 mL 0 mL 200 mL 24 5. 埋蠟 (Embedding) :
將滲蠟好的組織材料取出，置於不鏽鋼金屬型中，一個模型依 組織材料大小，可放入 1~4 個小塊材料，並以切面向外排列整齊，
再加入熔融的液狀蠟，待表面稍微凝固後將模型泡入冰水中冷卻凝 固。
6. 切片 (Section) :
將凝固之含小材料模型蠟塊輕敲出，將蠟塊依材料數切成數小 塊，並將切面之蠟修切，使材料露出，再將切面對邊之蠟，以小火 烤熔後固定於一小木塊上，將小木塊固定於滾動式切片機之固定夾 上，調整適當切片厚度 (約 10 m) 後，開始進行切片，可得連續切 片蠟帶。
7. 展片 (Put up the section) :
將切好之切片蠟帶，以 Mayer’s 黏附劑 (蛋白:甘油=2:1) 張貼在 載玻片上，使其排列整齊，並置於 40~45℃加熱板上待黏附劑至乾。
8. 乾燥 (Dryness) :
將固定好之載玻片放入 50℃烘箱烘乾。
9. 熔蠟和染色 (Melting wax and Staining) :
將烘乾完成之載玻片利用不同比例的二甲苯及乙醇進行熔蠟，
並利用 Safranin 及 Fast-green 以細胞標本染片機進行染色。步驟如表 2-2。
10. 封片 (Mounting) :
將染好片之玻片以 Balsam 樹脂完成封片後，置入烘箱中烘乾，
即可得永久切片。利用顯微鏡進行細胞觀察，並利用數位顯微鏡攝 影機拍照存檔。
表 2-2 細胞標本溶蠟及染色步驟
Step Solution Name Time 1
2 3 4 5
Xylene
Xylene/100 %EtOH 100 %EtOH
95 %EtOH 85 %EtOH
10 min 3 min 3 min 3 min 3 min 6
7 8 9 10
70 %EtOH 50 %EtOH 1 %Safranin
H2O 50 %EtOH
3 min 3 min 16 hr (over night)
5 min 3 min 11
12 13 14 15
70 %EtOH 85 %EtOH 95 %EtOH 0.5 %Fast-green
95 %EtOH
3 min 3 min 3 min 30 sec 3 min 16
17 18 19 20
95 %EtOH 100 %EtOH 100 %EtOH Xylene/100 %EtOH
Xylene
3 min 3 min 3 min 3 min 5 min
註 : Safranin 為鹼性染料，可將木質細胞、染色體等染上紅色 Fast-green 為酸性染料，可將柔細胞染色，使之呈綠色
第二節 毛茄 (SL) 根、莖、葉及果實四個部位之 H2O 與 95 %乙醇萃取
一、 植物材料:
本研究材料毛茄 (Solanum lasiocarpum) 屬Solanaceae (茄科) 植物，本研究內容皆以 SL 縮寫代表本植物，所使用的毛茄為民國一 百年七月十八日，至台南市關廟區文衡路上採集而得，採集部位為全 草，採集後陰乾共 1.1 Kg，將陰乾後之毛茄分為根 ( 120 g )、莖 ( 290 g )、葉 ( 610 g ) 及果實 ( 60 g ) 四個部位，作為本研究之材料。
二、 實驗方法:
(一) 溶媒：
1. 95 % 乙醇 ( Ethanol, C2H5OH)：友和貿易股份有限公司，Taiwan (二) 儀器設備：
1. 水流式抽氣機：EYELA®, A-1000S 2. 冷卻循環機：EYELA®, CA-100 3. 水浴器：Guang pyna®
4. 減壓濃縮機：Heidolph®, Laborota 4000 5. 電子天平：EXCELL®,BH-600
(三) 毛茄 (SL) 根、莖、葉及果實四個部位之 H2O 及 95 %乙醇萃取方法之 實驗步驟：
將毛茄之根、莖、葉及果實剪碎後，每個部位精秤 25 g 兩份，分 別置入兩個 500 mL 圓底燒瓶中，各加入 250 mL H2O 或 95 %乙醇分別 以 100 ℃或 80 ℃加熱迴流萃取 1 小時。1 小時後分別趁熱過濾，殘渣 再次分別加入 250 mL H2O 或 95 %乙醇，以相同條件加熱迴流，重複上 步驟共萃取三次。分別合併濾液後，經減壓濃縮至乾，可得 H2O 或 95 % 乙醇萃取物。根、莖、葉及果實之水萃取物分別標示為 SLRW、SLSW、
SLLW 及 SLFW；根、莖、葉及果實之乙醇萃取物分別標示為 SLRE、
SLSE、SLLE 及 SLFE，總共八個萃取物。將這八個萃取物分別秤重，
依下公式，分別計算萃取百分率，並將所得的萃取物放置 4 ℃貯存，提 供 DPPH 自由基清除能力，Trolox 當量抗氧化能力及總酚含量等試驗，
用。
萃取物百分率 = (萃取物重量 (g) / 25 g ) x 100
第三節 DPPH 自由基清除能力試驗方法
本 DPPH 自由基清除能力試驗方法應用於本研究中各萃取物、各分配 萃取層及分離後各分層之 DPPH 自由基清除能力抗氧化能力評估。
一. 儀器設備：
1. 天平：Sartorius®, CPA225D 2. 震盪器：HIPOINT®, M02090002
3. 超音波震盪器：ELMA®, D-7700 4. Micropipet：Eppendorf research® 5. 96 孔盤：Nunc®, 269620
6. 酵素免疫分析自動判讀機：BioTek®, 239531 二. 藥品及其配製：
1. 實驗藥品：
(1) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH; MW 394.32; Sigma, USA) (2) L-Ascorbic acid (≥99 %, Sigma, USA)
2. 藥品配製方法：
(1) 1 mM DPPH：精確秤取 3.9 mg DPPH，加入 95 %乙醇 10 mL 以 超音波震盪器溶解均勻。
(2) Vit. C 對照標準溶液：精確秤取 5 mg Vit. C 加入去離子水 1 mL 溶解均勻 (濃度 5 mg/mL)，作為 Vit. C 的貯存溶液。再由貯存溶 液以去離子水稀釋為 5、4、2、1、0.5 mg/mL 等 5 個不同濃度，
作為 Vit. C 對照標準溶液。
(3) 樣品試驗溶液配製：分別精秤各樣品各 5 mg，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例之混合溶液 1 mL 分別溶解，使各樣品濃度皆為 5 mg/mL 作為各樣品貯存溶液。再由各樣品貯存溶液經去離子水 稀釋為 5、4、2、1、0.5 mg/mL 等 5 個不同濃度，作為樣品試驗
溶液。
3. DPPH 自由基清除能力試驗之實驗步驟：
(1) 分別在 96 孔盤中各加入 30 μL 之 5、4、2、1、0.5 mg/mL 等 5 種不同濃度之樣品溶液或 Vit. C 對照標準品溶液，再分別加入 100 μL 新鮮配製的 1 mM DPPH，混合均勻，最終濃度分別為 0.1154、0.2308、0.4615、0.9231 與 1.1538 mg/mL；另外精確量 取 30 μL H2O 依上述步驟作為空白對照組。以上步驟各重複 3 次。
(2) 將上述 96 孔盤之 5 種不同濃度樣品試驗溶液，Vit. C 對照標準 溶液及空白對照組，置於室溫下避光靜置反應 30 分鐘後，再使 用 ELISA reader 讀取波長 517 nm 之吸光值。依下列公式分別計 算 Vit. C 對照標準品及 5 種不同濃度樣品之 DPPH 自由基清除 百分率。
DPPH 自由基清除百分率= (1-ASample/AControl)×100
ASample：為樣品在波長 517 nm 的吸光值。
AControl：為樣品的空白對照組，在波長 517 nm 的吸光值。
第四節 Trolox 當量抗氧化能力試驗方法
本 Trolox 當量抗氧化能力試驗方法應用於本研究中各萃取物、各分配 萃取層及分離後各分層之 Trolox 當量抗氧化能力活性評估。
一. 儀器設備：
1. 天平：Sartorius®, CPA225D 2. 震盪器：HIPOINT®, M02090002 3. 超音波震盪器：ELMA®, D-7700 4. Micropipet：Eppendorf research® 5. 96 孔盤：Nunc®, 269620
6. 酵素免疫分析自動判讀機：BioTek®, 239531 7. pH 測定儀：HANNA instruments®, pH211 二. 藥品及其配製：
1. 實驗藥品：
(1) 100 % 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS; Sigma, USA)
(2) 1550 U/mg Peroxidase (Sigma, USA) (3) 35 % H2O2 (Sigma, USA)
(4) 97 % 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
(Trolox; Sigma, USA)
(5) L-Ascorbic acid (≥99 %, Sigma, USA) 2. 藥品配製方法：
(1) 5 mM PBS：精秤 90 mg KCl、90 mg KH2PO4、3.6 mg NaCl 及 517.5 mg Na2HPO4於 1000 mL 的血清瓶中，加入 900 mL H2O 溶解均 勻，再將此溶液調至 pH 值 7.4。
(2) 43.92 U/mg Peroxidase (metmyogloloin) ： 秤 取 1550 U/mg Peroxidase 0.85 mg，加入 5 mM PBS 30 mL 溶解，混搖均勻。
(3) 500 μM H2O2：取 35 % H2O2 100 μL，加入 5 mM PBS 至 5 mL 搖 晃均勻，使其濃度為 7 mg/mL，再以此溶液取 24.3 μL 加 5 mM PBS 至 10 mL，混勻。
(4) ABTS˙+溶液：分別量取 5 mL ABTS 溶液，5 mL 43.92 U/mg Peroxidase 及 5 mL 500 μM H2O2溶液於棕色瓶中，混合均勻，
靜置 16 小時以上產生穩定藍綠色之 ABTS˙+。
(5) 500 μM Trolox 貯存溶液：精秤 97 % Trolox 1.29 mg 加入 5 mM PBS 10 mL 以超音波震盪器溶解均勻，作為 500 μM Trolox 貯存 溶液。
(6) Vit. C 對照標準溶液：精確秤取 1 mg Vit. C 加入去離子水 1 mL 溶解均勻 (濃度 1 mg/mL)。再由樣品溶液經 PBS 稀釋為 10、25、
50、75 及 100 ppm 等 5 個不同濃度，作為 Vit. C 對照標準溶液。
(7) 樣品試驗溶液配製：分別精秤各樣品各 2 mg，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例之混合溶液 1 mL 分別溶解，使各樣品濃度皆為 2 mg/mL 作為各樣品貯存溶液。再由樣品溶液經 PBS 稀釋為 20、
50、100、150 及 200 ppm 等 5 個不同濃度之樣品試驗溶液。
三. Trolox 當量抗氧化能力試驗之實驗步驟：
本試驗分為 Trolox 對照標準品檢量線溶液及樣品試驗溶液配製：
1. Trolox 對照標準品檢量線溶液配製：
Trolox 檢量線溶液配製，先取 200 μL 的 500 μM Trolox 貯存溶液 與 800 μL 的 5 mM PBS，配製為 100 μM Trolox 溶液。再以 5 mM PBS 稀釋為 8、16、24、32 及 40 μM，共 5 個不同濃度做為 Trolox 標準品 檢量線溶液。
再取 100 μL 上述 5 個不同濃度的 Trolox 標準品溶液，加入 96 孔盤中，再分別在每個孔中分別加入100 μL ABTS˙+溶液，使最終濃 度為 4、8、12、16 與 20 μM 等，並以 5 mM PBS 溶液取代 0 μM Trolox 標準品溶液，共 6 個不同濃度作為 Trolox 對照標準品檢量線。
2. 樣品試驗溶液與對照標準溶液配製：
樣品的部分，則從 20、50、100、150 及 200 ppm 等 5 個不同濃 度之樣品試驗溶液或 20、50、100、150 及 200 ppm 等 5 個不同濃度
之 Vit. C 對照標準品溶液中各取 125 μL 於 96 孔盤中，再分別在每個 孔中分別加入 25 μL 5 mM PBS，最後分別在每個孔中分別加入 100 μL ABTS˙+溶液，並將樣品試驗溶液與對照標準溶液震搖均勻。以上試 驗重複 3 次。
上述 Trolox 對照標準品檢量線六個不同濃度溶液與五個不同 濃度之樣品試驗溶液及 Vit. C 對照標準溶液分別靜置反應 60 秒之後，
使用 ELISA reader 讀取波長 750 nm 之吸光值。將上述 Trolox 對照標 準品各六個最終不同濃度為 X 軸，各濃度所測得吸光值為 Y 軸，繪 圖製作檢量線，並求得 Trolox 標準曲線之線性迴歸方程式 (y=ax+b)，
及其相關係數 (R2)。再經由 Trolox 標準品檢量線之線性迴歸方程式換 算各樣品及 Vit. C 對照標準溶液相當於 Trolox 當量抗氧化濃度，以 TEAC (M) 縮寫表示。
第五節 總酚含量測定試驗方法
本總酚含量測定試驗方法應用於本研究中各萃取物、各分配萃取層及 分離後各分層之總酚含量測定抗氧化能力評估。
一. 儀器設備：
1. 天平：Sartorius®, CPA225D
2. 震盪器：HIPOINT®, M02090002 3. 超音波震盪器：ELMA®, D-7700 4. Micropipet：Eppendorf research® 5. 96 孔盤：Nunc®, 269620
6. 酵素免疫分析自動判讀機：BioTek®, 239531 二. 藥品及其配製：
1. 實驗藥品：
(1) 2 N Folin-Ciocalteu reagent (Sigma, USA)
(2) Sodium carbonate, anhydrous (Na2CO3；MW 105.99；和光純藥工業 株式會社)
(3) Gallic acid (MW 170.12; Sigma, USA) 2. 藥品配製方法：
(1) 0.5 Folin-Ciocalteu reagent：取 2 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL，
加入去離子水 1.5 mL 混合均勻。
(2) 20 % Na2CO3：秤取 3 mg Na2CO3 加入去離子水 15 mL，溶解，
混勻。
(3) 1 mg/mL Gallic acid 貯存溶液：秤取 5 mg Gallic acid 加入 5 mL 去 離子水，溶解，混勻。
3. 樣品試驗溶液配製：
分別精秤各樣品各 1 mg，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例 之混合溶液 1 mL 分別溶解，使各樣品濃度皆為 1 mg/mL 作為各樣品 貯存溶液。再由各樣品貯存溶液以去離子水稀釋為 100 μg/mL 樣品 試驗溶液。
三. 總酚含量測定試驗之實驗步驟：
本試驗分為 Gallic acid 對照標準品檢量線溶液及樣品試驗溶液配製：
1. Gallic acid 對照標準品檢量線溶液配製：
檢量線的部分，取 1 mg/mL Gallic acid 貯存溶液 300 μL 於試管中，
並加入去離子水 2700 μL 混勻，配製成 100 μg/mL Gallic acid 溶液。
再經由去離子水配製為 20、40、60、80 與 100 μg/mL Gallic acid 溶液，
以 H2O 作為 0 μg/mL Gallic acid 溶液，共 6 個不同的濃度作為 Gallic acid 對照標準品檢量線。
再分別取50 μL 的 Gallic acid 上述六種不同濃度溶液於 96 孔盤中，
各加入 50 μL 0.5 Folin-Ciocalteu reagent 與 100 μL 20 %Na2CO3混合均 勻，使最終濃度為 0、5、10、15、20 與 25 μg/mL 等六個不同濃度。
2. 樣品試驗溶液配製：
樣品的部分，秤取 1 mg 待測物加入，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例之混合溶液 1 mL 分別溶解，以超音波震盪溶解均勻，使其 濃度為 1 mg/mL，再取此濃度 100 μL 加入 900 μL 去離子水稀釋，使
其濃度為 100 μg/mL ，再取 50 μL 的 100 μg/mL 樣品試驗溶液於 96 孔盤中。樣品試驗溶液中加入 50 μL 0.5 Folin-Ciocalteu reagent 與 100 μL 20 %Na2CO3混合均勻，樣品濃度為 25 μg/mL。將以上試驗重複 3 次。
使用 ELISA reader 讀取波長 750 nm 之吸光值，以標準品 Gallic acid 各濃度所測得之吸光值為 y 軸及標準品之各不同濃度為 x 軸，繪 圖製作 Gallic acid 檢量線，並求得 Gallic acid 檢量線之線性迴歸方程 式 (y= ax+b) 及其相關係數 (R2)，將各試驗樣品所測得吸光值，以內 插法計算，求出各樣品相對於 Gallic acid 當量濃度 (Gallic acid equivalent, GAE)，再以此相對濃度回算每克樣品相當於多少毫克的 Gallic acid 以 mg of GAE/g 表示。
毛茄根、莖、葉及果實四個部位之水及 95 %乙醇萃取物經由 DPPH 自由基清除能力試驗，Trolox 當量抗氧化能力試驗及總酚含量 測定試驗篩選後，篩選出毛茄葉部的 95 %乙醇萃取物具有最佳的抗 氧化能力。因此進行毛茄葉部大量的 95 %乙醇萃取及分離，其萃取 及分離方法於本章第六節所敘述。在每個分離階段利用所建立的 DPPH 自由基清除能力試驗，Trolox 當量抗氧化能力試驗及總酚含量 測定試驗之平台作為篩選，並選擇具有較佳的抗氧化能力之分層進 行更進一步之分離純化，企圖分離出抗氧化活性成分。
第六節 毛茄葉部大量萃取及分離
一. 溶媒：
1. 二氯甲烷 (Methylene chloride, CH2Cl2)：Mallinckrodt, USA 2. 甲醇 (Methanol, CH3OH)：Mallinckrodt, USA
3. 95 % 乙醇 (Ethanol, C2H5OH)：友和貿易股份有限公司，Taiwan 4. 乙酸乙酯 (Ethyl acetate, CH3COOC2H5)：關東化學株式會社，Japan 5. 正丁醇 (n-Butanol, C4H10O)：Riedel-de Haë, Germany
6. 醋酸 (Acetic acid, CH3COOH) : JT-Baker, USA 二. 層析材料：
1. TLC Plates Silica gel 60 F254：Merck No.105554, Germany 2. Silica gel 60-230 mesh : Merck No.64271, Germany
三. 儀器設備：
1. 紫外線照射燈：UVP Model®, UVGL-25 2. 水流式抽氣機：EYELA®, A-1000S 3. 冷卻循環機：EYELA®, CA-100 4. 水浴器：Guang pyna®
5. 減壓濃縮機：Heidolph®, Laborota 4000 6. 電子天平：EXCELL®,BH-600
7. 微熔點測定儀：Yanaco®, MP-S3 8. 紫外線分光光譜儀：Hitachi®, U2900) 9. 紅外線光譜儀：SHIMADZU®, FTIR-8501 10. 核磁共振儀：Bruker®, AV-400
11. 離子層析儀：Dionex ics-1100
12. 感應耦合電漿質譜儀：Agilent 7500A/G3160B 四. 毛茄葉部大量萃取及分離之實驗步驟
將陰乾絞碎後的毛茄葉部 (SLL) 共 540.38 g，加入 9 L 95%乙醇，
於 80 ℃下加熱迴流萃取 6 個小時，趁熱過濾後，收集濾液，殘渣再次 加入 9 L 95 %乙醇。依上述步驟重複萃取共十次直至濾液無色，合併濾 液，將濾液減壓濃縮至乾，得到黑褐色毛茄酒精萃取物，標示為 SLLE，
共 116.53 g。將萃取物 116.53 g 以 H2O 共 1.6 L 及 CH2Cl2溶媒共 3.5 L 作分配萃取，可得 27.56 g CH2Cl2層萃取物標示為，SLLED。0.47 g 不 溶物萃取物標示為，SLLEI。H2O 層再與 EtOAc 溶媒共 8.0 L 作分配萃 取可得 19.07 g EtOAc 層萃取物，標示為 SLLEA。0.89 g 乳化層萃取物，
標示為 SLLEE。剩下之 H2O 層再與 n-Butanol 溶媒共 8.0 L 作分配萃取 可得 n-Butanol 層萃取物，標示為 SLLEB 共 41.18 g。H2O 層萃取物，標 示為 SLLEW 共 26.20 g。將 CH2Cl2、EtOAc、乳化層、n-Butanol、不溶 物與 H O 層萃取物分別進行 DPPH 自由基清除能力測試、Trolox 當量抗
氧化能力試驗及總酚含量測定試驗，結果則以 SLLEA (EtOAc 層萃取 物) ，具有最高之抗氧化能力，結果論述於第三章第四節。由 SLLEA 預留 0.4067 g，作為預試驗用。由 SLLEA 中可分離得到 7.3457 g (1) 化 合物，剩餘 11.32 g 以 CH2Cl2 : MeOH (25:1) 進行矽膠管柱層析分離，分 離得 SLLEA1~5 之五個分層。將此五個分層分別進行 DPPH 自由基清除 能力測試、Trolox 當量抗氧化能力試驗及總酚含量測定試驗，結果顯示 出 SLLEA2 具有最佳之抗氧化能力，結果論述於第三章第四節。再將 SLLEA2 預留 0.0505 g，其餘 0.3398 g 以 CH2Cl2 : MeOH (25:1) 進行矽 膠管柱層析分離，得 SLLEA2-1~ SLLEA2-6 之六個分層。將此六個分層 分別進行 DPPH 自由基清除能力測試、Trolox 當量抗氧化能力試驗及總 酚含量測定試驗，結果顯示出 SLLEA2-2 及 SLLEA2-3 具有最佳之抗氧 化能力。SLLEA2-3 分離得到 (2) 化合物。萃取分離純化流程圖如圖 2-1 以下即分別敘述毛茄個部位水萃及 95 %乙醇萃取物、各分配萃取 層及矽膠管柱分離之各分層之 DPPH 自由基清除能力試驗、Trolox 當量 抗氧化能力試驗及總酚含量試驗測定試驗結果，及 (1) 化合物與 (2) 化合物之結構鑑定。
圖 2-1 毛茄葉部 95 %乙醇萃取物之分離及純化流程圖 The Leaves of Solanum lasiocarpum (SL) (540 g)
H2O / CH2Cl2 Crude extract (SLLE) (116.53 g)
H2O layer 116.53 g for partition
CH2Cl2 layer (27.56 g, SLLED)
EtOAc layer (19.07 g,SLLEA)
H2O / EtOAc
Emulsion layer
(0.89 g, SLLEE) H2O / n-BuOH
n-BuOH layer (41.18 g, SLLEB)
H2O layer (26.20 g, SLLEW) H2O layer
SLLEA2 (0.4035 g)
SLLEA3 (0.6761 g)
SLLEA4 (6.2324 g)
SLLEA5 (3.7452 g) SLLEA1
(0.2488 g)
SLLEA2-2 (0.1227 g)
SLLEA2-4 (0.0504g) SLLEA2-3
(0.0233 g)
SLLEA2-5 (0.0319 g)
SLLEA2-6 (0.0582g) SLLEA2-1
(0.0269 g)
Extracted with 95 %EtOH 9 L / time x 10 times Concentration
Insolubles layer (0.47 g, SLLEI)
Fe, Cu, Ni, cation and anion SO42-
the Salt class mixture (1) (7.3457 g) 407 mg for preliminary test SLLEA (11.32 g)
SiO2 c.c.
CH2Cl2 : MeOH (25:1)
SLLEA2 (0.3398 g)
50.5 mg for preliminary test
SiO2 c.c.
CH2Cl2 : MeOH (25:1)
Paprazine (2) (1.54 mg)
第三章 結果與討論 第一節 毛茄根、鬚根、莖及葉之切片鏡檢結果
圖 3-1~3-3 分別為毛茄根、鬚根、莖及葉等各部位組織切片圖。圖 3-1 為根部橫切圖，由圖中可觀察到毛茄根部之最外層由 5~6 層栓皮層細胞堆 疊，且有裂隙 (圖 C)，皮層有 2~5 個徑約 19~50 m 石細胞群 (圖 D) 、樹 脂及沙晶散佈 (圖 E)，木部較寬且佈滿著髓腺，髓腺由髓部往外延伸，木 部有 1~4 個，徑約 18~71 m 導管聚集。鬚根亦具有髓腺及導管，髓腺由髓 部往外延伸 (圖 G)。
圖 3-2 為莖部橫切圖，可觀察到毛茄莖部之表皮有纖毛 (圖 E) 及刺 (圖 F)，且有沙晶分佈 (圖 H)，皮部較薄有裂隙 (圖 D)，有徑約 19~63 m 石細 胞環繞 (圖 C) ，木部厚度約 230~340 m，佈滿著髓腺及導管，髓部柔細 胞呈類圓形大小約 23~71 m (圖 G)。
圖 3-3 為葉部橫切圖，可觀察到毛茄葉部之上下表皮有纖毛 (圖 E)，表 皮內部可觀察到柵狀組織 (圖 F)，且有裂隙及沙晶 (圖 G)，維管束中，有 徑約 4~52 m 導管分排列 (圖 D)。
圖 3-2 毛茄莖部橫切圖
圖 3-3 毛茄葉部橫切圖
表 3-1 生藥學術語之英文略字表
略字 術語 中文名 略字 術語 中文名 b Bristle 刺毛
c cambium 形成層 cd crystal sand 沙晶 ci cilia 纖毛 cr crack 裂隙 epl lower epidermis 下表皮 epu upper epidermis 上表皮 m medulla 髓 mr medullary ray 髓腺
p parenchyma 柔細胞 ph phelloderm 栓皮層 pm palisade mesophyll 柵狀組織 re resin 樹脂 st stone cell 石細胞 v vessel 導管 vb vascular vessel 維管束 x xylem 木質部
第二節 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取百分率之結果
毛茄 (SL) 的根、莖、葉及果實四個部位經由水與 95 %乙醇萃取，分 別得到四個部位的水萃取物，分別標示為 (SLRW, SLSW, SLLW and SLFW) 及 95 %乙醇萃取物，分別標示為 (SLRE, SLSE, SLLE and SLFE)，共八個 萃取物，所得萃取率如表 3-2 所示，SL 各部位的水萃取物皆高於 95 %乙醇 萃取物，SLFW 的萃取率最高為 25.68 %，SLRE 的萃取率最低為 4.8 %。
表 3-2 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取率 毛茄 (SL) 各部位 水萃取率 (%) 95 %乙醇萃取率 (%)
根 (R) 莖 (S) 葉 (L) 果實 (F)
11.36 23.04 23.12 25.68
4.8 13.00 15.36 11.88
第三節 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取之抗氧化能力 試驗結果
一、DPPH 自由基清除能力試驗結果
毛茄 (SL) 的根、莖、葉及果實四個部位經由 H2O 與 95 %乙醇萃取，
分別得到水及 95 %乙醇共八個萃取物分別為 SLRW, SLSW, SLLW SLFW, SLRE, SLSE, SLLE and SLFE，將此八個萃取物進行 DPPH 自由基清除能力 試驗，其結果如圖 3-4 所示。當 Vit C 的濃度在 0.1154 mg/mL 時，其清除
Concentration (mg/mL)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Scavenging Effect (%)
0 20 40 60 80 100
vit. C SLSW SLSE SLLW SLLE SLFW SLFE SLRW SLRE
DPPH 自由基能力已達到 94.69 %，隨著 Vit C 濃度的增加，清除率已達飽 和狀態呈現平穩的曲線。毛茄的八個萃取物在濃度 0.1154 mg/mL 時，其清 除 DPPH 自由基能力由大到小分別為: SLLE (24.07 %)，SLFE (22.81 %)，
SLRE (22.23 %)，SLLW (18.53 %)，SLSE (16.65 %)，SLSW (15.14 %)，SLFW (14.19 %)，SLRW (7.54 %)。但隨著濃度的增加，於 1.154 mg/mL 時 SLFE 其清除率反而高於 SLLE，其清除 DPPH 自由基能力分別為 92.43 %及 90.13
%。結果顯示 SLLE 於低濃度清除 DPPH 自由基能力比 SLFE 佳。
圖 3-4 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水與 95 %乙醇萃取物對 DPPH 自由基清除能力 試驗結果圖，DPPH 自由基清除率 (%) = (1-A樣品組/A空白組) × 100 %，以去離子水 當空白組，結果以 mean ± SD (n=3) 表示。
Vit. C：對照標準品
SLRW：毛茄根部的水萃取物 SLRE：毛茄根部的 95 %乙醇萃取物 SLSW：毛茄莖部的水萃取物 SLSE：毛茄莖部的 95 %乙醇萃取物 SLLW：毛茄葉部的水萃取物 SLLE：毛茄葉部的 95 %乙醇萃取物 SLFW：毛茄果實的水萃取物 SLFE：毛茄果實的 95 %乙醇萃取物
將圖 3-4 之清除 DPPH 自由基能力結果以 IC50 (半抑制濃度) 表示，IC50
值愈小表示樣品清除 DPPH 自由基之能力愈佳，由表 3-3 可知，IC50值由小 到大分別為: Vit. C (0.0062 mg/mL)，SLLE (0.2559 mg/mL)，SLFE (0.3148 mg/mL)，SLLW (0.3527 mg/mL)，SLRE (0.4424 mg/mL)，SLFW (0.4991 mg/mL)，SLRW、SLSW 及 SLSE 之 IC50在濃度 1.154 mg/mL 時，其 DPPH 自由基清除能力未達 50 %，因此無法求得。由此數據可知，SLLE 具有最 佳的 DPPH 自由基清除能力。綜合 DPPH 自由基清除率及 IC50值之結果，
判定 SLLE 為具有最佳 DPPH 自由基清除能力之萃取物。
表 3-3 毛茄根、莖、葉及果實四個部位水及 95 %乙醇萃取物之 DPPH 自由 基清除能力 IC50比較表
樣品 IC50 (mg/mL)
Vit. C SLLE SLLW SLFE SLFW SLRE SLRW SLSW
SLSE
0.0062±0.0001 0.2559±0.0078 0.3527±0.0021 0.3148±0.0027 0.4991±0.0027 0.4424±0.0069
- - -
IC50：能抑制或清除 50 %DPPH 自由基之樣品濃度，以 mean ± 95 %信賴區間 (n=3) 表示
- : 在濃度 1.154 mg/mL 時，其 DPPH 自由基清除能力未達 50 % Vit. C：對照標準品
SLRW：毛茄根部的水萃取物 SLRE：毛茄根部的 95 %乙醇萃取物 SLSW：毛茄莖部的水萃取物 SLSE：毛茄莖部的 95 %乙醇萃取物 SLLW：毛茄葉部的水萃取物 SLLE：毛茄葉部的 95 %乙醇萃取物 SLFW：毛茄果實的水萃取物 SLFE：毛茄果實的 95 %乙醇萃取物
二、Trolox 當量抗氧化能力試驗結果
毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇萃取物經由 Trolox 當量抗氧化試驗，其 Trolox 標準品檢量線如圖 3-5 所示，可得 Trolox 標準 品之回歸方程式及其相關系數分別分別為 y = -0.0143 x + 0.4162，R2 = 0.9991，顯示 Trolox 標準品檢量線於 0~20 μM 之濃度範圍內可得一良好線 性關係，因此利用 Trolox 標準品檢量線所得線性迴歸方程式，再進一步換 算對照標準品 Vit. C 與毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇 萃取物含有相當於 Trolox 濃度之抗氧化能力。結果如圖 3-6 與表 3-4 所示，
在濃度 10 ppm 時，對照標準品 Vit. C 含有相當於 Trolox 25.77 μM 之抗氧化 能力，各萃取物之 Trolox 當量抗氧化能力 (TEAC) 由大到小分別為: 為 SLLE (13.79 μM)，SLFE (13.14 μM)，SLLW (10.43 μM)，SLFW (6.47 μM)，
SLRE (5.14 μM)，SLRW (4.68 μM)，SLSE (4.54 μM)，SLSW (3.77 μM)，TEAC 值愈大，表示其抗氧化能力愈佳。因此由結果顯示，以毛茄葉部 95 %乙醇 萃取物之 Trolox 當量抗氧化能力最佳。
Concentration (M)
0 5 10 15 20 25
Aborsbence(OD)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Trolox
圖 3-5 Trolox 標準品檢量線曲線圖，結果以 mean ± SD (n=3) 表示。
Final concentration (ppm)
0 20 40 60 80 100
TEAC (M)
0 5 10 15 20 25 30
Vit. C SLSW SLSE SLLW SLLE SLFW SLFE SLRW SLRE
圖 3-6 毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇萃取物之 Trolox 當量抗氧化 能力試驗結果圖，結果以 mean ± SD (n=3) 表示。
Vit. C：對照標準品
SLRW：毛茄根部的水萃取物 SLRE：毛茄根部的 95 %乙醇萃取物 SLSW：毛茄莖部的水萃取物 SLSE：毛茄莖部的 95 %乙醇萃取物 SLLW：毛茄葉部的水萃取物 SLLE：毛茄葉部的 95 %乙醇萃取物
表 3-4 毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇萃取物之 TEAC 試驗結果表
樣品 TEAC (M)
Vit. C SLLE SLFE SLLW SLFW
SLRE SLRW SLSE SLSW
25.77±0.08 13.79±0.19 13.14±0.15 10.43±0.12 6.47±0.22 5.14±0.40 4.68±0.34 4.54±0.21 3.77±0.28
TEAC：每 10 ppm 樣品相當於 Trolox 清除 ABTS˙+之當量濃度 (μM)，結果以 mean ± SD (n=3) 表示。
Vit. C：對照標準品
SLRW：毛茄根部的水萃取物 SLRE：毛茄根部的 95 %乙醇萃取物 SLSW：毛茄莖部的水萃取物 SLSE：毛茄莖部的 95 %乙醇萃取物 SLLW：毛茄葉部的水萃取物 SLLE：毛茄葉部的 95 %乙醇萃取物 SLFW：毛茄果實的水萃取物 SLFE：毛茄果實的 95 %乙醇萃取物
三、總酚含量測定試驗結果
毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇萃取物經由總酚含 量測定試驗結果，Gallic acid 標準品檢量線由圖 3-7 所示，可得 Gallic acid 標準品之回歸方程式及其相關係數分別為 y = 0.0171x - 0.0066，R2 = 0.9991，
顯示 Gallic acid 標準檢量線於 0~25 μg/mL 之濃度範圍可得一良好線性關係。
利用 Gallic acid 標準品檢量線所得線性迴歸方程式，換算毛茄八個萃取物之 總酚含量。結果如表 3-5 所示，總酚含量由大到小為: SLLE (185.419 mg of GAE/g)，SLFE (170.604 mg of GAE/g)，SLLW (158.908 mg of GAE/g)，SLRE
(140.195 mg of GAE/g)，SLSE (135.517 mg of GAE/g)，SLSW (127.719 mg of GAE/g)，SLRW (126.160 mg of GAE/g)，SLFW (120.702 mg of GAE/g)。此 結果顯示，SLLE 為總酚含量最高。
Concentration (g/mL)
0 5 10 15 20 25
Aborsbence(OD)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Gallic acid
圖 3-7 Gallic acid 標準品檢量線曲線圖，結果以 mean ± SD (n=3) 表示。
表 3-5 毛茄根、莖、葉及果實四個部位的水萃及 95 %乙醇萃取物之總酚含 量結果表
樣品 總酚含量 (mg of GAE/g) Gallic acid
SLLE SLLW
SLFE SLFW
SLSE SLSW SLRE SLRW
1101.589±0.008 185.419±0.003 158.908±0.001 170.604±0.001 120.702±0.001 135.517±0.006 127.719±0.001 140.195±0.001 126.160±0.001
總酚含量：每克樣品相當於含有沒食子酸之毫克 (mg) 數，結果以 mean ± SD (n=3) 表示。
Gallic acid：對照標準品
SLRW：毛茄根部的水萃取物 SLRE：毛茄根部的 95 %乙醇萃取物 SLSW：毛茄莖部的水萃取物 SLSE：毛茄莖部的 95 %乙醇萃取物 SLLW：毛茄葉部的水萃取物 SLLE：毛茄葉部的 95 %乙醇萃取物 SLFW：毛茄果實的水萃取物 SLFE：毛茄果實的 95 %乙醇萃取物
依上述之毛茄八個萃取物於 DPPH 自由基清除能力試驗結果、Trolox 當量抗氧化能力試驗結果與總酚含量測定試驗結果得知，毛茄葉部 95 %乙 醇萃取物在 DPPH 自由基清除能力試驗、Trolox 當量抗氧化能力試驗與總 酚含量測定試驗中，抗氧化能力最高。因此，選擇毛茄葉部 95 %乙醇萃取 物做進一步的大量萃取、分配萃取及分離。
