第二章 材料與方法
第三節 DPPH 自由基清除能力試驗方法
萃取物百分率 = (萃取物重量 (g) / 25 g ) x 100
第三節 DPPH 自由基清除能力試驗方法
本 DPPH 自由基清除能力試驗方法應用於本研究中各萃取物、各分配 萃取層及分離後各分層之 DPPH 自由基清除能力抗氧化能力評估。
一. 儀器設備：
1. 天平：Sartorius®, CPA225D 2. 震盪器：HIPOINT®, M02090002
3. 超音波震盪器：ELMA®, D-7700 4. Micropipet：Eppendorf research® 5. 96 孔盤：Nunc®, 269620
6. 酵素免疫分析自動判讀機：BioTek®, 239531 二. 藥品及其配製：
1. 實驗藥品：
(1) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH; MW 394.32; Sigma, USA) (2) L-Ascorbic acid (≥99 %, Sigma, USA)
2. 藥品配製方法：
(1) 1 mM DPPH：精確秤取 3.9 mg DPPH，加入 95 %乙醇 10 mL 以 超音波震盪器溶解均勻。
(2) Vit. C 對照標準溶液：精確秤取 5 mg Vit. C 加入去離子水 1 mL 溶解均勻 (濃度 5 mg/mL)，作為 Vit. C 的貯存溶液。再由貯存溶 液以去離子水稀釋為 5、4、2、1、0.5 mg/mL 等 5 個不同濃度，
作為 Vit. C 對照標準溶液。
(3) 樣品試驗溶液配製：分別精秤各樣品各 5 mg，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例之混合溶液 1 mL 分別溶解，使各樣品濃度皆為 5 mg/mL 作為各樣品貯存溶液。再由各樣品貯存溶液經去離子水 稀釋為 5、4、2、1、0.5 mg/mL 等 5 個不同濃度，作為樣品試驗
溶液。
3. DPPH 自由基清除能力試驗之實驗步驟：
(1) 分別在 96 孔盤中各加入 30 μL 之 5、4、2、1、0.5 mg/mL 等 5 種不同濃度之樣品溶液或 Vit. C 對照標準品溶液，再分別加入 100 μL 新鮮配製的 1 mM DPPH，混合均勻，最終濃度分別為 0.1154、0.2308、0.4615、0.9231 與 1.1538 mg/mL；另外精確量 取 30 μL H2O 依上述步驟作為空白對照組。以上步驟各重複 3 次。
(2) 將上述 96 孔盤之 5 種不同濃度樣品試驗溶液，Vit. C 對照標準 溶液及空白對照組，置於室溫下避光靜置反應 30 分鐘後，再使 用 ELISA reader 讀取波長 517 nm 之吸光值。依下列公式分別計 算 Vit. C 對照標準品及 5 種不同濃度樣品之 DPPH 自由基清除 百分率。
DPPH 自由基清除百分率= (1-ASample/AControl)×100
ASample：為樣品在波長 517 nm 的吸光值。
AControl：為樣品的空白對照組，在波長 517 nm 的吸光值。
第四節 Trolox 當量抗氧化能力試驗方法
本 Trolox 當量抗氧化能力試驗方法應用於本研究中各萃取物、各分配 萃取層及分離後各分層之 Trolox 當量抗氧化能力活性評估。
一. 儀器設備：
1. 天平：Sartorius®, CPA225D 2. 震盪器：HIPOINT®, M02090002 3. 超音波震盪器：ELMA®, D-7700 4. Micropipet：Eppendorf research® 5. 96 孔盤：Nunc®, 269620
6. 酵素免疫分析自動判讀機：BioTek®, 239531 7. pH 測定儀：HANNA instruments®, pH211 二. 藥品及其配製：
1. 實驗藥品：
(1) 100 % 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS; Sigma, USA)
(2) 1550 U/mg Peroxidase (Sigma, USA) (3) 35 % H2O2 (Sigma, USA)
(4) 97 % 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
(Trolox; Sigma, USA)
(5) L-Ascorbic acid (≥99 %, Sigma, USA) 2. 藥品配製方法：
(1) 5 mM PBS：精秤 90 mg KCl、90 mg KH2PO4、3.6 mg NaCl 及 517.5 mg Na2HPO4於 1000 mL 的血清瓶中，加入 900 mL H2O 溶解均 勻，再將此溶液調至 pH 值 7.4。
(2) 43.92 U/mg Peroxidase (metmyogloloin) ： 秤 取 1550 U/mg Peroxidase 0.85 mg，加入 5 mM PBS 30 mL 溶解，混搖均勻。
(3) 500 μM H2O2：取 35 % H2O2 100 μL，加入 5 mM PBS 至 5 mL 搖 晃均勻，使其濃度為 7 mg/mL，再以此溶液取 24.3 μL 加 5 mM PBS 至 10 mL，混勻。
(4) ABTS˙+溶液：分別量取 5 mL ABTS 溶液，5 mL 43.92 U/mg Peroxidase 及 5 mL 500 μM H2O2溶液於棕色瓶中，混合均勻，
靜置 16 小時以上產生穩定藍綠色之 ABTS˙+。
(5) 500 μM Trolox 貯存溶液：精秤 97 % Trolox 1.29 mg 加入 5 mM PBS 10 mL 以超音波震盪器溶解均勻，作為 500 μM Trolox 貯存 溶液。
(6) Vit. C 對照標準溶液：精確秤取 1 mg Vit. C 加入去離子水 1 mL 溶解均勻 (濃度 1 mg/mL)。再由樣品溶液經 PBS 稀釋為 10、25、
50、75 及 100 ppm 等 5 個不同濃度，作為 Vit. C 對照標準溶液。
(7) 樣品試驗溶液配製：分別精秤各樣品各 2 mg，以 H2O、EtOH 或 DMSO 不同比例之混合溶液 1 mL 分別溶解，使各樣品濃度皆為 2 mg/mL 作為各樣品貯存溶液。再由樣品溶液經 PBS 稀釋為 20、
50、100、150 及 200 ppm 等 5 個不同濃度之樣品試驗溶液。
三. Trolox 當量抗氧化能力試驗之實驗步驟：
本試驗分為 Trolox 對照標準品檢量線溶液及樣品試驗溶液配製：
1. Trolox 對照標準品檢量線溶液配製：
Trolox 檢量線溶液配製，先取 200 μL 的 500 μM Trolox 貯存溶液 與 800 μL 的 5 mM PBS，配製為 100 μM Trolox 溶液。再以 5 mM PBS 稀釋為 8、16、24、32 及 40 μM，共 5 個不同濃度做為 Trolox 標準品 檢量線溶液。
再取 100 μL 上述 5 個不同濃度的 Trolox 標準品溶液，加入 96 孔盤中，再分別在每個孔中分別加入100 μL ABTS˙+溶液，使最終濃 度為 4、8、12、16 與 20 μM 等，並以 5 mM PBS 溶液取代 0 μM Trolox 標準品溶液，共 6 個不同濃度作為 Trolox 對照標準品檢量線。
2. 樣品試驗溶液與對照標準溶液配製：
樣品的部分，則從 20、50、100、150 及 200 ppm 等 5 個不同濃 度之樣品試驗溶液或 20、50、100、150 及 200 ppm 等 5 個不同濃度
之 Vit. C 對照標準品溶液中各取 125 μL 於 96 孔盤中，再分別在每個 孔中分別加入 25 μL 5 mM PBS，最後分別在每個孔中分別加入 100 μL ABTS˙+溶液，並將樣品試驗溶液與對照標準溶液震搖均勻。以上試 驗重複 3 次。
上述 Trolox 對照標準品檢量線六個不同濃度溶液與五個不同 濃度之樣品試驗溶液及 Vit. C 對照標準溶液分別靜置反應 60 秒之後，
使用 ELISA reader 讀取波長 750 nm 之吸光值。將上述 Trolox 對照標 準品各六個最終不同濃度為 X 軸，各濃度所測得吸光值為 Y 軸，繪 圖製作檢量線，並求得 Trolox 標準曲線之線性迴歸方程式 (y=ax+b)，
及其相關係數 (R2)。再經由 Trolox 標準品檢量線之線性迴歸方程式換 算各樣品及 Vit. C 對照標準溶液相當於 Trolox 當量抗氧化濃度，以 TEAC (M) 縮寫表示。