肝癌

第一章 緒論

第一節 肝癌

一、肝癌的流行與發生

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在全球癌症死因中排名 第三位(Llovet & Bruix, 2008)，亞洲及非洲有較高的好發率，但在美 洲及歐洲肝癌的發生率也有持續成長的情形(Llovet, Di Bisceglie, et al., 2008)。台灣行政院衛生署 100 年統計資料顯示，癌症佔死亡原因 排名第一位，而癌症死因中肝癌則僅次於肺癌，排名第二位，可見肝 癌對於國人健康的威脅。肝癌發生的機制目前尚未完全明確，飲食、

遺傳、藥物代謝、病毒感染都可能使肝臟受損，增加肝癌的發生率。

B 型肝炎病毒的感染是造成肝癌的主要危險因子，其次為 C 型肝炎病 毒及酒精引起的病變(Bosch, Ribes, Diaz, & Cleries, 2004)，B 型肝炎病 毒感染在亞洲及非洲國家較為普遍，在西方國家則是 C 型肝炎病毒的 感染佔較多數(But, Lai, & Yuen, 2008)，無論是 B 型肝炎或是 C 型肝 炎的患者都有很大的風險罹患肝硬化，最後可能導致肝癌(Degos et al., 2000; Fattovich et al., 1991)。自西元 1991 年起，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）推行施打 B 型肝炎疫苗後，臺灣地區 B 型肝炎盛行率大幅降低，也減少因 B 型肝炎所導致的肝癌比例(Chang et al., 1997; Lai & Lau, 2005)。此外，其他影響因子如：飲食中的黃麴

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毒素（Aflatoxin）造成的 p53 基因突變、遺傳性疾病血鐵沉積症

（hereditary hemochromatosis）、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎

（Nonalcoholic steatohepatitis；NASH）都會提高罹患肝癌的風險 (Bruix & Sherman, 2011; Qian et al., 1994)。

二、肝癌治療

目前肝癌的治療方式有外科手術治療、肝臟移植及化學藥物治療，

在治療前需評估病患的身體狀況、腫瘤的大小來選擇治療的方式，但 皆有一定的風險及負作用存在。手術切除腫瘤對於肝腫瘤小於 2 cm、

無肝硬化及肝臟功能較良好的病患，其治療效果較佳，併發症也較少，

但病患在切除腫瘤後五年內復發率高達 80%(Imamura et al., 2003)。其 他的手術治療方法還包括經皮酒精注射法（Percutaneous ethanol injection，PEI）、射頻切除手術（Radiofrequency ablation，RFA）、微 波熱凝治療（Microwave coagulation therapy，MCT）、肝動脈栓塞化 療（Transarterial chemoembolization，TACE）、肝動脈栓塞放射線治 療（Transarterial radioembolization，TARE）(Maluccio & Covey, 2012)。

經皮酒精注射法是將針插入肝臟腫瘤內並緩慢注射 95%的酒精，造成 局部細胞壞死。射頻切除手術是利用熱能造成癌細胞壞死，經皮酒精 注射法及射頻切除手術在 2 cm 以下的腫瘤治療效果最好，若大於 2 cm 的腫瘤則是射頻切除手術的效果較佳，但若腫瘤太過靠近附近的

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器官則會因怕波及到其他器官而有所限制(Bruix & Sherman, 2011)。

肝動脈栓塞化療則是將化療藥物置入供應癌細胞的主要動脈中，造成 細胞壞死並延緩腫瘤生成，目前常用的藥物為 Doxorubicin、Cisplatin 與 Lipiodol 混合使用，但也發現病患有嚴重的副作用，造成肝臟衰竭 而死亡的病例(Chan, Yuen, Hui, Tso, & Lai, 2002)。肝臟移植較不受肝 硬化的限制，可以清除所有肝臟內部癌細胞病灶，且復發率也較手術 切除低(Iwatsuki et al., 1991)，但病患可能在等待肝臟移植時，肝癌繼 續惡化而死亡或被排除在等後名單內(Iwatsuki, et al., 1991)。

由於肝癌患者被診斷出肝癌時大多是較後期的肝癌，此時無法使 用手術方式治療，因此化學藥物治療是病患的首要選擇。目前臨床化 療用藥有 Doxorubicin、5-Fluorouracil（5-FU）、Capecitabine、Cisplatin、

Tamoxifen 等，但這些藥物合併或單獨使用也只能延長使用這些藥物 的病患壽命 3～12 個月(Kawano et al., 2012)，治療後出現的負作用常 讓病患難受；此外，肝癌常出現多重藥物抗藥性（Multidrug resistance，

MDR）也增加治療的困難(Perez-Tomas, 2006)。病患常見的副作用像 是 Doxorubicin 會引發心毒性而有劑量限制(Sadzuka, Nagamine, Toyooka, Ibuki, & Sonobe, 2012)。目前最新的臨床標靶藥物 Sorafenib 在 2007 年由美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration；FDA）

核准使用於肝癌治療上(Llovet, Ricci, et al., 2008)，Sorafenib 為多酶抑

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制劑，能抑制血管新生及抑制腫瘤生長，但在臨床上發現只能使病患 延長 3 個月的壽命(A. L. Cheng et al., 2009; Llovet, Ricci, et al., 2008)。

產生的副作用像是：體重減輕、噁心、嘔吐、手足症後群也讓病患感 到不適(Rossi et al., 2010)。同為抑制血管新生的 Bevacizumab 在臨床 試驗第一、二期發現對於肝癌患者有好的治療效果，但會造成嚴重的 出血副作用，因此使用上也需審慎的評估(Rossi, et al., 2010)。目前在 臨床試驗上合併 Sorafenib 與 Doxorubicin 藥物的治療，雖然病人有較 好的耐受性，但對於癌細胞死亡的機制卻有相互抵制癌細胞凋亡的效 果(Manov, Pollak, Broneshter, & Iancu, 2011)。而 Sorafenib 與 5-FU 合 併使用的結果發現，病患存活率雖然有較高，但其手足症後群在有肝 硬化病人身上發生頻率卻增加(B. Xie, Wang, & Spechler, 2012)。以上 的治療結果可發現目前治療肝癌的藥物不僅副作用大，且無論有無合 併使用，其治療效果並不佳，因此找尋有效且副作用低的藥物為目前 迫切所需。

5 第二節 爵床素 A（Justicidin A，JA）

爵床素 A （Justicidin A，JA）是由全草植物爵床（Justicia

procumbens，JP）萃取出來的純化物，爵床為民間傳統中藥，具有抗

菌消炎、止痛、治療發燒的功效(Asano, Chiba, Tada, & Yoshii, 1996;

Weng, Ko, Yeh, Lin, & Lin, 2004)（Appendix Fig. 1）。之前的研究發現，

在以脂多醣（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬細胞 RAW 264.7 細胞株中給與低濃度（ 1 M）的 JA 能促進腫瘤壞死因子-（Tumor necrosis factor-，TNF-）生成，但在大於 5M 的濃度下，JA 卻能 抑制 TNF-被高基氏體（Golgi body）運送至細胞膜上，降低 TNF-

分泌Tsao, Lin, & Wang, 2004)。我們研究團隊之前的研究發現，結直 腸癌細胞 HT-29 以及 HCT 116 兩種細胞株在 JA 處理後，會降低細胞 質中的 Ku70 蛋白表現量，增加粒線體上的 Bax 蛋白量，破壞粒線體 膜電位，增加粒線體釋放細胞色素 c（Cytochrome c）到細胞質中，

進而活化 caspase-9 及 caspase-3 讓細胞產生細胞凋亡而死亡，而使用 不同濃度的 JA 培養六天使用 MTT 檢測其抑制率計算出 IC50的濃度 則發現，人類正常單核球細胞（Peripheral blood mononuclear cells，

PBMC）的 IC50明顯大於 HT-29 以及 HCT 116 細胞株，顯示對於正常 細胞並無明顯影響；在動物試驗中，給予 NOD-SCID 老鼠每天口服 6.2 或 10.6 mg/kg 的 JA 達 60 天，發現老鼠體內 HT-29 腫瘤細胞的生

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長有明顯降低(J. C. Lee et al., 2005)；另外在肝癌細胞株 Hep 3B 以及 Hep G2 中，發現 JA 能誘發 caspase-8 活化，讓粒線體膜電位降低，

細胞質中的細胞色素 c 及 Smac/DIABLO 蛋白質表現量增加，經由內 在及外在路徑導致細胞進行細胞凋亡，並且在動物試驗中將 Hep 3B 細胞株注射至 NOD-SCID 老鼠體內，每天餵食 20 mg/kg 的 JA 至 60 天，也發現能降低腫瘤的生長(Su et al., 2006)。

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第三節 計畫性細胞死亡（Programmed cell death，PCD）

計畫性細胞死亡在器官發育的過程中扮演著關鍵且重要的角色，

能控制細胞的數量，讓受損的細胞死亡，維持細胞的動態平衡。細胞 死亡可分為三種：細胞凋亡（Apoptosis，Type I）、細胞自噬（Autophagy，

Type II）、細胞壞死（Necrosis，Type III）(Lockshin & Zakeri, 2004)。

計畫性細胞死亡包括細胞凋亡及細胞自噬(Debnath, Baehrecke, &

Kroemer, 2005)，因細胞壞死會造成周邊組織產生發炎反應，所以在 癌症治療上會以導致細胞凋亡的死亡方式為目標。

一、細胞凋亡

細胞凋亡是生物體內主要的計畫性細胞死亡方式，當細胞受到無 法回復的損傷時就會進行細胞凋亡讓細胞走向死亡(Kerr, Wyllie, &

Currie, 1972)。主要特徵包括：細胞膜上的 phosphatidylserine（PS）

外翻、細胞膜皺縮（Shrinkage）、細胞核濃縮（Nuclear condensation）、

細胞膜萎縮成空泡狀（Membrane blebbing）、細胞凋亡小體（Apoptotic body）產生，最後被鄰近的巨噬細胞吞噬(Hengartner, 2000)。其訊息 傳遞路徑分為兩種：外在路徑 （Extrinsic pathway）和內在路徑

（Intrinsic pathway）（Appendix Fig. 2）。

外在路徑是藉由 death ligand 如：Fas ligand、CD95 ligand、

TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）與 death receptor，如：

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Fas、CD95、Tumor necrosis factor receptor（TNFR）結合後形成 Death complex 再與 adaptor（如：Fas-associated death domain，FADD）以及 initiator caspase（如：procaspase-8）結合形成更大的複合體，稱為 Death inducing signaling complex（DISC），誘發 caspase-8 活化後引發一連 串 pro-caspase 活化，最後活化 caspase-3 而走向細胞凋亡 (Lavrik, Golks, & Krammer, 2005; Walczak & Krammer, 2000; Zapata et al., 2001)。內在路徑則是以粒線體為主要中心，當細胞受到刺激（如：

UV 光照射、藥物刺激），粒線體外膜變得可通透時，細胞色素 c

（Cytochrome c）、Smac/DIABLO、AIF、endonuclease G 會被釋放出 來(Saelens et al., 2004)，細胞色素 c 被釋放出後與 Apaf-1 及

procaspase-9 結合，形成 apoptosome，進而活化 caspase-9 及 caspase-3，

最後導致細胞凋亡(Reed, 1997)。

其它與細胞凋亡相關的蛋白質還有 p53、NF-B、Bcl-2 家族蛋白、

MAPK 家族蛋白。Bcl-2 家族蛋白對於細胞凋亡的調控扮演重要的角 色，主要分為三類：促進細胞凋亡蛋白（如：Bax、Bak），抑制細胞 凋亡蛋白（如：Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1）及 Bcl-2 Homology (BH) domains(Adams & Cory, 2007; Youle & Strasser, 2008)。Bax 及 Bak 蛋 白主要存在於細胞質中，粒線體受到刺激後 Bax 及 Bak 蛋白會聚集 在粒線體外膜上，形成通道讓粒線體內的細胞色素 c 能穿過通道釋放

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至細胞質中(Kroemer, Galluzzi, & Brenner, 2007); Bcl-2 及 Bcl-XL則會 抑制 Bax 移到粒線體外膜上，避免形成通道因而抑制細胞色素 c 的釋 放。而只有 BH3 結構的蛋白質（如：Bid、Bad、PUMA）會增進促 凋亡蛋白質 Bax、Bak 的活性(Giam, Huang, & Bouillet, 2008)。p53 會 活化 Bcl-2 家族蛋白中的促凋亡蛋白如：Bid、PUMA，間接調控內在 路徑或是直接活化 Bax 或 Bak 讓粒線體外膜通透性增加來促進細胞 凋亡進行(Moll, Wolff, Speidel, & Deppert, 2005)。Extracellular

signal-regulated kinase（ERK）屬於 MAPK 家族蛋白，其上游蛋白還 有 Mitogen-activated protein kinase/ERK kinase（MEK）、Raf 及 Ras；

Raf/MEK/ERK 路徑會影響細胞凋亡的內在及外在路徑相關蛋白質，

對於細胞凋亡的調控有促進及抑制的功能。活化的 ERK 會降低粒線 體膜電位促進細胞色素 c 的釋放，活化 caspase 9 來促進細胞凋亡進 行並且調控 Bcl-2 家族蛋白，正調控促凋亡蛋白質：Bax、PUMA、

Bak、Bim，使促凋亡蛋白表現量增加，負調控抑凋亡蛋白質：Bcl-2 及 Bcl-XL，來促進細胞凋亡。但也會活化抑凋亡蛋白質 Mcl-1，抑制 Bax 活化與合成 homodimers，以及磷酸化 Bad S112 的位置，抑制 Bad 促凋亡功能，進而抑制細胞凋亡(Harada, Quearry, Ruiz-Vela, &

Korsmeyer, 2004; H. Li et al., 2007; J. Liu, Mao, Ding, & Liang, 2008;

Schweyer et al., 2004)。對於外在路徑則能藉由增加 death ligand 及促

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進 death receptor 與 adaptor 結合來活化 caspase-8 促進細胞凋亡進行 (Tewari, Sharma, Koul, & Sen, 2008) 。

二、細胞自噬

細胞自噬在 1963 年首先被提出，為受損細胞內藉由溶酶體

（Lysosome）降解的過程，普遍存在於真核細胞內，是一種維持細胞 動態平衡的機制，在細胞受到壓力或營養缺乏時，細胞為了自救而產 生雙層膜的自噬體 （Autophagosome）包裹受損或老化的胞器，再與 溶酶體結合，由溶酶體內的酵素分解自噬體內的物質後，釋放出胺基 酸讓細胞利用而能存活(Mizushima, Yoshimori, & Levine, 2010)。

細胞自噬的形成及降解分為五個階段：起始（Initiation）、延展

細胞自噬的形成及降解分為五個階段：起始（Initiation）、延展