JA 與臨床藥物 Sorafenib 合併使用對於肝癌細胞的影響 73

有限，而 JA 在細胞及動物實驗中對於肝癌細胞已證實有良好的毒殺 效果，並對正常細胞毒性很低(J. C. Lee, et al., 2005)，為比較臨床藥物 Sorafenib 合併 JA 後對於肝癌細胞的影響，實驗利用細胞毒殺試驗方 法，將不同濃度的 Sorafenib（0-10 M）及不同濃度的 JA（0.5 與 1 M）

合併使用，測試對細胞生長的抑制率並以 Jin’s method 公式計算 q 值，

檢測使用單一藥物處理與合併藥物處理癌細胞對於細胞存活率的影 響。q 值的計算公式為：q = D1+2/(D1+D2-D1×D2，D1為第一種藥物的 細胞抑制率，D2為第二種藥物的細胞抑制率，D1+2則為合併使用兩種 藥物的細胞抑制率，當 q 值小於 0.85 時兩者為拮抗（antagonism），

大於 1.15 時兩者為協同（synergism），數值介於 0.85～1.15 之間則為 加成（additivity）(Zhou, Wang, Tang, & Ma, 1984)。

實驗結果（Fig. 22）發現，Sorafenib 的細胞毒殺能力在 2.5~10 M 的濃度下，有隨劑量增加而明顯上升（p < 0.05）。J A 0.5 M 的濃度 與 2.5~10 M Sorafenib 的細胞毒殺能力相比，在 JA 0.5 M 的濃度下 的細胞毒殺能力較 2.5 M Sorafenib 好（p < 0.05），與 5 M Sorafenib 相比，細胞毒殺能力無明顯差異（p > 0.05），而 10 M Sorafenib 的細 胞毒殺能力較 J A 0.5 M 佳（p < 0.05）；合併使用 JA 0.5 M 與 2.5~10

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M Sorafenib 的細胞毒殺能力與單獨使用 2.5~10 mM 濃度下的

Sorafenib 相比，在 Sorafenib 2.5 M 濃度下，合併使用 JA 的細胞毒 殺能力顯著較無合併使用佳（p < 0.05），在 Sorafenib 5 及 10 M 濃度 下，合併使用 JA 的細胞毒殺能力與無合併使用的相比無明顯差異（p

> 0.05），合併使用 JA 0.5 M 與 Sorafenib 2.5~10 M 的細胞毒殺能力 與單獨 JA 0.5 M 濃度相比，只有在合併 10 M Sorafenib 時才有較高 的細胞毒殺能力（p < 0.05）；由計算合併效用的 q 值來看，JA 0.5 M 合併使用 Sorafenib 10 M 濃度計算出的 q 值為加成效用，而合併 2.5

M 與 5 M 的 Sorafenib 計算出的 q 值為拮抗。

由實驗結果（Fig. 23）發現，JA 1 M 的濃度與 2.5~10 M Sorafenib 的細胞毒殺能力相比，在 JA 1 M 濃度下細胞毒殺能力較 Sorafenib 2.5 M 與 5 M 好（p < 0.05），而 Sorafenib 10 M 的細胞 毒殺能力較 J A 1 M 佳（p < 0.05）; 合併使用 JA 1 M 與 Sorafenib 2.5~10 M 的組別中，在 2.5 M 與 5 M Sorafenib 的濃度下，合併 使用 JA 的細胞毒殺能力顯著較無合併使用佳（p < 0.05），在 10 M Sorafenib 的濃度下，合併使用 JA 的細胞毒殺能力與無合併使用的相 比無明顯差異（p > 0.05）。合併使用 JA 1 M 與 Sorafenib 2.5~10 M 細胞毒殺能力與單獨 JA 1 M 濃度相比，只有在合併 10 M Sorafenib 時才有較高的細胞毒殺能力（p < 0.05）；由計算合併效用的 q 值來看，

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JA 1 M 合併使用 Sorafenib 2.5~10 M 濃度計算出的 q 值皆為加成效 用。由（Fig. 22、23）可推論，JA 的細胞毒殺能力顯著較 Sorafenib 佳，在 Sorafenib 2.5 M 與 5 M 的濃度下合併使用 JA，細胞毒殺的 能力大多由 JA 提供，在 Sorafenib10 M 的濃度下才有較高的細胞毒 殺能力，且與 JA 合併效果為加成效應。

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Fig. 22 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells viability determined by MTT assay and the interaction of sorafenib and JA determined by the value of q.

Hep 3B cells (1 × 10⁴ cells/well) were treated with various concentrations (0, 2.5, 5, 10 M) of Sorafenib with or without JA 0.5 M for 48 h.

Percentage of inhibition on Hep 3B cells was measured by MTT assay.

The value of q indicates synergism when greater than 1.15, antagonism when smaller than 0.85, and additivity when located between 0.85 and 1.15. Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common letter differ, p＜0.05. Results are representative of three independent experiments.

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Fig. 23 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells viability determined by MTT assay and the interaction of sorafenib and JA determined by the value of q.

Hep 3B cells (1 × 10⁴ cells/well) were treated with various concentrations (0, 2.5, 5, 10 M) of Sorafenib with or without JA 1 M for 48 h.

Percentage of inhibition on Hep 3B cells was measured by MTT assay.

The value of q indicates synergism when greater than 1.15, antagonism when smaller than 0.85, and additivity when located between 0.85 and 1.15. Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common letter differ, p＜0.05. Results are representative of three independent experiments.

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第五章 討論

本研究中發現 JA 能誘發人類肝癌 Hep 3B 細胞產生細胞自噬，

誘發自噬的路徑與活化 MEK/ERK 路徑相關，且其自噬流程有走到與 溶酶體結合的階段。抑制細胞自噬進行，能提升 JA 毒殺細胞的能力 並增加細胞凋亡比例。但抑制細胞凋亡並不影響細胞自噬產生。與目 前臨床肝癌標靶藥物 Sorafenib 毒殺 Hep 3B 細胞效果相比，JA 有更 好的毒殺效果外，在 1 M 的濃度下與 Sorafenib 合併使用具有加成的 效果。

目前許多抗癌藥物是以誘發或促進癌細胞細胞凋亡進行為主，所 誘發的細胞凋亡除了可讓癌細胞死亡外，對於放射線治療也可促進其 敏感性。但因癌細胞本身的代謝機制與細胞訊息傳遞路徑較正常細胞 複雜，對於一些促凋亡的藥物有抗藥性的情形，因此細胞自噬也成為 促進癌細胞死亡的另一個目標途徑，例如給與 mTOR 抑制劑

Rapamycin 來誘發細胞自噬，在某些癌細胞上發現能促進癌細胞死亡。

抗癌藥物 Tamoxifen 會抑制 Akt 蛋白表現而誘發乳癌細胞細胞自噬，

能促進癌細胞死亡(Faivre, Kroemer, & Raymond, 2006; J. J. Liu, Lin, Yu, Liu, & Bao, 2011; Scarlatti et al., 2004)。但目前有許多研究發現，

有些抗癌藥物，不僅能誘發細胞凋亡也能誘發細胞自噬，例如：Arsenic trioxide 在白血病細胞上會誘發細胞凋亡，但會造成惡性膠質瘤細胞

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細胞自噬；SAHA 能誘發肝癌細胞株 Huh7 細胞凋亡，但也在同一細 胞株上發現能誘發細胞自噬；臨床用藥 Cisplatin 為一 DNA 嵌合劑，

會造成惡性膠質瘤細胞凋亡，但同樣為 DNA 嵌合劑的 Temozolomide

（TMZ）則會導致細胞自噬(Kanzawa et al., 2004; Kanzawa, Kondo, Ito, Kondo, & Germano, 2003; Y. L. Liu et al., 2010; Pelicano et al., 2003)。

JA 在之前的研究中已發現會使肝癌細胞株 Hep 3B 及 HepG2 細胞死 亡並能產生細胞凋亡的情形，在 JA 1M 的濃度下，作用時間 6 小時 即發現有活化型態的 caspase 8 出現 (Su, et al., 2006)。而由（Fig. 1）

可發現，JA 在 1M 的濃度下，作用時間 24 小時 AVOs 的比例並不 明顯 ，在作用時間 48 小時，才有明顯 AVOs 的比例產生。（Fig. 2）

則發現，在 1M 的濃度作用在 Hep 3B 細胞株上 24 小時，其 LC3-II 有明顯表現，顯示在 24 小時自噬小體有產生，到 48 小時則進行到自 噬溶酶體階段，顯示 JA 不僅能誘發細胞凋亡也會誘發細胞自噬進行，

且 JA 是先誘發了細胞凋亡產生，而後同時發生了細胞自噬。

但也有研究指出在一些癌細胞上，抑制了細胞凋亡會促進細胞自 噬進行，反之，抑制了細胞自噬也可能會誘發細胞凋亡發生。例如在 老鼠的纖維母細胞上，使用 caspase 8 的抑制劑抑制細胞凋亡後會促 進細胞自噬進行，加了細胞自噬抑制劑後卻會降低細胞死亡的比例。

另一實驗則發現，將 SAHA 與細胞凋亡抑制劑 pan-caspase inhibitor

80 增加 5-FU 藥物效果(Abedin, Wang, McDonnell, Lehmann, & Kelekar, 2007; Boya et al., 2005b; J. Li, et al., 2009; Y. L. Liu, et al., 2010; Yu et al., 2004)。細胞自噬的抑制劑種類繁多，除了 3-MA，還有 Wortamannin、

BAF 及 Chloroquine（CQ）等抑制劑，3-MA 與 Wortamannin 會抑制 class III PI3K 表現而抑制自噬小體形成，而 BAF 與 CQ 則不影響自噬 小體的形成，BAF 會抑制自噬小體與溶酶體的結合，影響細胞自噬 的流程，而 CQ 則會增加溶酶體 pH 值，抑制自噬溶酶體成熟，導致 細胞自噬流程無法完成(Bursch et al., 1996; Carew et al., 2007; Ko, Kim, Park, Park, & Yang, 2009; Mathew, Karantza-Wadsworth, & White, 2007)。有些研究發現，在乳癌及大腸癌細胞上使用 3-MA，可抑制放 射線所誘發的細胞自噬並讓細胞存活率增加，且細胞凋亡也不會進行，

但若使用了 BAF 抑制自噬小體與溶酶體結合，卻發現對於放射線所 誘發的細胞自噬雖然被抑制但仍能進行細胞凋亡，並能促進癌細胞死 亡(Paglin et al., 2001)。本實驗使用了 BAF 抑制細胞自噬進行，由結

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果（Fig. 3、4、5）可發現，加入抑制劑的組別中，LC3-II、p62 及 LAMP2a 的蛋白表現量增加，（Fig. 6）也發現，LC3 及 LAMP2a 結合 的比例較少，顯示細胞自噬流程停滯，（Fig. 7、8、9）則可發現加入 抑制劑的組別中，細胞凋亡 Sub-G1 的比例增加，且細胞凋亡下游蛋 白 caspase-3 活化的比例也較多，顯示抑制 JA 誘發 Hep 3B 的細胞自 噬進行能促進細胞凋亡，MTT 實驗結果也發現加入 BAF 抑制劑後，

細胞生長抑制率增加，與之前的實驗結果類似(Paglin, et al., 2001)。而 加入了細胞凋亡抑制劑 zVAD-fmk 後，由（Fig. 11、12、13）可發現，

無論有無加細胞凋亡抑制劑，對於細胞自噬相關蛋白質的表現量並沒 有影響，推論 JA 所誘發的細胞自噬會抑制細胞凋亡的表現，但細胞 凋亡並不影響細胞自噬進行。在臨床上使用 JA 則建議與細胞自噬抑 制劑合併使用，以增加 JA 誘發細胞凋亡比例及細胞毒殺能力。

由西方墨點法實驗檢測 JA 所誘發的細胞自噬路徑方面，研究顯 示 Atg12-Atg5 與 class III PI3K、Beclin 1 會形成複合體，幫助細胞自 噬小體形成(Aita et al., 1999)，但實驗結果中與誘發細胞自噬相關的 Atg12-Atg5、class III PI3K 及 Beclin 1 的表現量（Fig. 14、15）並無 明顯變化，顯示 JA 所誘發的細胞自噬與此路徑較無關聯，而另一條 與抑制細胞自噬相關的 class I PI3K/Akt/mTOR 路徑，此路徑活化不 只會抑制細胞自噬進行也會促進癌細胞存活(Vivanco & Sawyers,

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2002)，而實驗結果中，此三種蛋白質磷酸化的表現（Fig. 16、17、18）

在 24 小時表現量反而增加，且由定量結果來看，磷酸化的 class I PI3K 及 Akt 至 96 小時的表現量與 0 小時相比還是有較高的趨勢。因 LC3-II 的蛋白質表現量及 AVOs 在 24 小時的比例（Fig. 1、2）顯示 JA 在此 條件下確實會誘發細胞自噬發生，推論 class I PI3K/Akt/mTOR 路徑 也與 JA 引發之細胞自噬較無相關。因此檢測了另一條同樣會造成細 胞自噬的路徑：Ras/Raf/MEK/ERK 路徑。由實驗結果（Fig. 19、20、

21）顯示，磷酸化的 MEK 與 ERK 從 24 至 72 小時之間的蛋白表現 量有上升的趨勢，與 0 小時相比，到了 72 小時表現量最多，顯示此 路徑有被活化。Ras 是 class I PI3K 的上游蛋白，也是 MEK/ERK 路徑 的上游蛋白，作用較為複雜，既參與了抑制細胞自噬路徑也參與了誘 發細胞自噬路徑，但其表現量的趨勢也與 MEK 及 ERK 相似，推論 JA 所誘發的細胞自噬路徑與 MEK/ERK 相關，但 LC3-II 的表現量在 24 小時及有明顯表現，因此，或許還有其他因子與路徑也會影響 JA 引發細胞自噬進行。

有研究顯示 Raf/MEK/ERK 路徑除了與誘發細胞自噬之外，也會 影響細胞凋亡路徑的進行，例如抗癌藥物 Doxorubicin，UV 或是放射 線照射皆有研究顯示會經由此路徑誘發細胞凋亡(Y. J. Lee et al., 2003;

Tang et al., 2002)，此外，與 JA 同為天然物的檞皮素（Quercetin）、白

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藜蘆醇（Resveratrol）、蟾蜍靈（Bufalin）也會活化 Raf/MEK/ERK 路 徑經由內在或是外在路徑產生細胞凋亡，但在使用了 MEK 抑制劑後 發現會降低細胞凋亡的情形(Kim, Lee, Jeong, Guo, & Lee, 2008; Shih, Davis, Lin, & Davis, 2002; Watabe et al., 1996)，JA 在之前的研究指出 會誘發人類大腸癌細胞與肝癌細胞細胞凋亡的發生，在本篇研究中也 發現會經由 MEK/ERK 路徑來誘發細胞自噬的情形，但此路徑對於 JA 誘發的細胞凋亡影響還需更進一步的釐清。

目前在臨床上使用的肝癌標靶藥物 Sorafenib，其作用的路徑為抑 制 Raf/MEK/ERK 路徑、血管內皮生長因子接受器（vascular endothelial

目前在臨床上使用的肝癌標靶藥物 Sorafenib，其作用的路徑為抑 制 Raf/MEK/ERK 路徑、血管內皮生長因子接受器（vascular endothelial